全 文 ：辐照蚕豆成熟花粉的细胞学效应
王侯聪1 　杨善民2 　郑　涛1
(厦门大学生物学系1 　抗癌研究中心2 　厦门　361005)
此文于 1996 年 6 月 5 日收到。
国家和福建省自然科学基金资助项目。
用60Coγ射线 0～837 Gy 辐照蚕豆成熟花粉 ,观察在人工培养下萌发花粉的显
微、亚显微辐射细胞学效应。花粉的萌发率和精核畸形率随辐照剂量的增大而提高 ,
精细胞进管率则相应下降。在超微结构上 ,93 Gy 辐照组的萌发花粉内 ,细胞核和细
胞器未见异常 ,279 Gy 辐照组的花粉管内 ,线粒体空泡化 ,并存在不成熟质体 ,465 Gy
以上剂量辐照 ,核膜破裂 ,精核破碎 ,花粉管内存在多泡小体 ,偶尔有光化铁蛋白在不
成熟质体内堆积。研究结果表明 ,蚕豆花粉的半致死剂量为 465 Gy。
关键词 :蚕豆花粉 　辐照 　超微结构 　细胞学效应 　半致死剂量
前 　　　言
作物的成熟花粉数量多 ,而且都处于相对稳定的单倍体状态 ,是诱变育种的理想材料。几
年来 ,我们开展了水稻成熟花粉辐射生物学效应及诱变效果的研究 ,取得了一些进展 ,并对辐
照成熟花粉的受精行为以及授粉后对籽粒发育及生物大分子代谢的剂量效应已有所了
解[1 - 3 ] ,但对其细胞学的辐射效应 ,特别是亚显微水平的辐射效应却了解不多。为了进一步
探索成熟花粉的诱变机理 ,我们特采用容易进行体外萌发的蚕豆成熟花粉为研究对象 ,研究其
辐射细胞学效应 ,并对成熟花粉的诱变等问题进行探讨。
材 料 与 方 法
材料与处理　蚕豆 (福建同安本)的成熟花粉。在田间摘取第 2 天将开放的花蕾 ,置于培
养皿内 ,在福建省农科院稻麦研究所钴 - 60 辐照室辐照。辐照剂量分别为 0、93、279、465、651
和 837 Gy ,剂量率 277 Gy/ h。
花粉培养基　100ml 培养液含 H3BO3 10mg、Ca (NO3) 2·4H2O 30mg、MgSO4·7H2O 20mg、
KNO3 10mg、蔗糖 15g。固体培养基为 100ml 液体培养液加 0. 5g 琼脂。
花粉人工培养 　在载玻片上涂 1 薄层固体培养基 ,待凝固后加 1 小滴液体培养基 ,将花粉
撒于液体培养基上 ,用小玻棒摊开成单层花粉层 ,并将其置于保湿的培养皿内 ,25 ℃温育。
显微观察　材料在 Cannoy 氏固定液中固定 ,Mayer 氏苏木精染色。用含 1 %盐酸的 70 %
乙醇分色 1～5min , 再用 1 %乙酸钠分色至固体培养基呈淡蓝色。用 Olympus 显微镜观察。
亚显微观察　经人工培养萌发的花粉 ,用 215 %戊二醛和 4 %多聚甲醛混合固定液固定
402　 核 农 学 报　1997 ,11 (4) :204～208Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
4h , 900g 离心 10min ,去上清液 ,加入 40 ℃2 %的琼脂 ,迅速离心使花粉混合液凝成小丸 ,再用
原固定液固定 15min。将固定的花粉小丸切成 1mm3 小块 ,然后用 1 %锇酸和 10 %亚铁氰化
钾混合固定液固定 2h ,用饱和醋酸铀的 70 %乙醇染色过夜。常规脱水 , Epon618 包埋 ,超薄切
片 ,枸橼酸铅染色后置于 J EM100c ×Ⅱ透射电子显微镜下观察。
结 果 与 分 析
(一) 蚕豆花粉萌发率的剂量效应
0～837 Gy 辐照的蚕豆花粉 ,在人工条件下 ,15min 即开始萌发 ,45min 后调查不同剂量处
理组的萌发率 (表 1) 。结果表明 ,γ射线对蚕豆花粉的萌发活力有抑制作用 ,其萌发率随辐照
剂量的增大而降低。经直线回归方程分析 ,花粉萌发率与辐照剂量呈显著的负相关 ,相关系数
r = - 0. 8613 ( P < 0102) 。
表 1 　辐照蚕豆花粉萌发率的剂量效应
Table 1 　The dose effect of irradiation on germination rate of V icia f ava pollen
剂量
Dose
( Gy)
花粉数
No. of
pollen
萌发数
No. of
germination
萌发率
Rate of
germination ( %)
　　　　　0 529 471 89104
93 555 375 67157
279 507 270 53126
465 503 261 51189
651 562 266 47133
837 527 238 45116
(二) 蚕豆精细胞活力的剂量效应
蚕豆花粉在人工条件下培养 40min ,其短棒形的精核开始进入花粉管 ,花粉管口较小 ,约
6μm ,精核在进入花粉管时 ,其形态变成稍长棒状 ,且较尖的一端先进入花粉管。通常圆形或
卵圆形的营养核较精核先进入花粉管。经不同剂量辐照后 ,精细胞进入花粉管的活力随辐照
剂量的增大而降低 (表 2) ,有时还可观察到精核朝不萌发花粉管的萌发孔运动。从表 2 可看
到 ,651 Gy 辐照处理组的精细胞进管率反而有所提高。我们认为 ,这不是精细胞活力增强的结
果 ,而是由于精细胞受高剂量辐照 ,细胞解体、破碎 ,并且在花粉管的伸长过程中随泡内液的运
动而流入花粉管。
(三) 辐照蚕豆花粉精核畸变的剂量效应
经不同剂量辐照的蚕豆花粉 ,在精细胞进入花粉管之前 ,其精核的形态无大变化 ,当它变
形而进入花粉管时 ,才可观察到精核因射线的作用而发生畸形。与此同时 ,营养核也由圆形变
为糜散和羽毛状及细线状 ,其进管时间也延缓。精核形态的畸变率随辐照剂量的提高而增大
(表 2) ,而且呈显著的正相关 (y = 0. 593 ±91422x , r = 0. 967 , p < 0. 005) 。
辐照剂量不同 ,精核产生的畸变类型也不同。在 279 Gy 以下剂量组 ,精核变为长棒形 ,或
502　4 期 辐照蚕豆成熟花粉的细胞学效应
表 2 　辐照蚕豆花粉精核畸变率的剂量效应
Table 1 　The dose effect of irradiation on aberration rate of sperma nucleus of V icia f ava pollen
剂量
Dose
( Gy)
精核进管数
No. of sperm
nucleus entering tube
畸形数
No. of
aberrant
畸形率
Aberration
rate ( %)
　　　　　0 216 　　　　　　1 0146
93 157 26 16156
279 106 21 19181
465 79 33 41177
651 85 68 80100
837 113 91 80153
弯曲成不同的形态 (图版 Ⅰ22～4) ;经 465 Gy 辐照后 ,精核聚缩成块状、油滴状或哑铃状等 ,并
可见精核断裂 (图版 Ⅰ25) 。在 651 Gy 以上剂量组 ,精核变成线形 ,或断裂成念珠状 (图版 Ⅰ2
6) 。可见 ,经 465 Gy 以上剂量辐照的蚕豆花粉 ,其精核才呈现出严重的辐射损伤 ———核断裂。
(四) 蚕豆花粉超微结构的辐射效应
已观察了正常蚕豆花粉在体外萌发过程中的超微结构[5 ] 。经不同剂量辐照后 ,其超微结
构也相应出现不同程度的辐射损伤。93 Gy 辐照组的精核、营养核及花粉管内细胞器均未见明
显的结构改变。279 Gy 处理组的精核、营养核的结构仍然变化不大 ,而花粉管内的线粒体发生
断嵴、空泡以及存在许多未成熟的质体 (图版 Ⅰ27、8) ,465 Gy 以上剂量辐照后 ,营养核膜被破
坏 ,核质外流 (图版 Ⅰ29) ,精核发生断裂 (图版 Ⅰ210) ,在花粉管内除了线粒体空泡化外 ,在未
成熟质体中可见成簇的光化铁蛋白堆积 (图版 Ⅰ211) ,并有由被破坏的质体与溶酶体构成的多
泡小体 (图版 Ⅰ212) 。
讨 　　　论
植物花粉数量多且全部处于相对稳定的单倍性时期是研究辐射效应和诱变育种的好材
料。Zelles[4 ]曾报道低剂量 X射线或紫外线可以刺激花粉管的生长 ,高剂量则有抑制效应。我
们用 93～837 Gy 辐照蚕豆成熟花粉 ,也观察到花粉的萌发率、精细胞的活力产生不同程度的
抑制效应 ,且与剂量成显著的负相关。
研究花粉的显微 ,特别是亚显微的辐射效应还不多见。我们的研究表明 ,经 279 Gy 以下
剂量辐照的花粉 ,其精核的畸变率在 20 %以下 ,且形态上主要表现为弯曲的长棒形。亚显微
水平上可观察到花粉管内的细胞器 (如线粒体) 发生空泡化等典型的辐射损伤 ,而精核和营养
核的亚显微结构无显著改变。可见精核的辐射损伤主要表现在分子水平的改变 ,如断裂、粘连
等 ,致使在显微水平上出现各种形态。465 Gy 以上剂量辐照 ,精核畸变率迅速提高到 40 %以
上 ,且其形态收缩 ,粘连成块状或溃解成细线、念珠状 ,亚显微结构上表现出核膜破碎 ,花粉管
中产生许多由溶酶体和损伤的质体构成的多泡小体 ,在未成熟质体中堆积光化铁蛋白等。综
观花粉萌发、精细胞活力及精核显微、亚显微的辐射损伤情况 ,我们认为 ,蚕豆成熟花粉的半致
602 核　农　学　报 11 卷
死剂量为 465 Gy。
图版 Ⅰ
11 蚕豆花粉体外萌发、棒形精核 (个)位于花粉管内 (CK) 。　2、3、41 279 Gy 辐照后棒形精核变成钩型、L 型或 V 型。　
51 465 Gy 辐照后 ,精核断裂成大核和小核。　61 651 Gy 辐照后 ,断裂的长形精核。　71 279 Gy 辐照后 ,花粉管内线粒体
空泡样变 ,嵴断裂。　81 279 Gy 辐照后 ,花粉管内不成熟质体空泡样变。　91 465 Gy 辐照后 ,营养核核膜破裂。　101
651 Gy 辐照后 ,精核碎裂。　111 465 Gy 辐照后 ,质体内光化铁蛋白堆积。　121 651 Gy 辐照后 ,多泡小体见于花粉管内。
Plate Ⅰ
11 Sperm nucleus in the pollen tube ( CK) . 　2 ,3 ,41 Cudgel2like sperm nucleus turned to be hook2type , L2type or V2type
(279 Gy) . 　51 The sperm nucleus fragmentated into two nuclei (465 Gy) . 　61 Sperm nucleus lengthen and fragmentated
(651 Gy) . 　71 In pollen tube , mitochondria were vacuolated and the cristae were broken (279 Gy) . 　81 In pollen tube , imma2
ture plastids were vacuolated (279 Gy) . 　91 The nuclear membrane of vegetative nucleus was broken ( 465 Gy) . 　101 The
sperm nucleus was fragmentated (651 Gy) . 　111 The photo chemo2ferritin were accumulated in plastids (465 Gy) . 　121 Multi2
vesicular body were shown in the pollen tube (651 Gy) .
近年来人们都在寻找提高辐射诱发有益突变率、减少无效突变的技术。我们认为 ,利用花
粉作为诱变材料有希望达到这一目标。首先 ,花粉数量多 ,在一定剂量辐照下 ,各花粉粒受到
随机性分子水平的损伤 ,可产生多种多样的位点突变 ;其次 ,位点突变的精核所产生的后代不
会产生嵌合体 ,而且一些隐性突变也会在以后的世代中不断表达 ,还会直接引起胚乳性质的突
变 ,这就为育种家提供丰富多彩的数量性状突变新类型。熟期、株高和穗部等性状是与产量有
密切相关的性状 ,它们都是受多基因调控的数量性状 ,用小剂量辐照成熟花粉是提高这些性状
有益突变的有效途径。
702　4 期 辐照蚕豆成熟花粉的细胞学效应
参 考 文 献
1 　王侯聪等. 辐照水稻花粉双受精行为的剂量效应. 核农学报 ,1995 ,9 (3) :149～152
2 　王侯聪等. 水稻成熟花粉诱变育种的研究进展. 中国农业科学 ,1995 ,28 (3) :96
3 　王侯聪等. 水稻辐照花粉授粉后灌浆期物质代谢的剂量效应. 核农学通报 ,1993 ,14 (4) :151～155
4 　Zelles L . Radiation induced stimulation of elongation of pine pollen tubes. Fertilization
in Higher Plants , ed. H. F. Linskens , North2Holland Publishing Company2Amster dan , the Netherlands , 1974 , 161～165
5 　王侯聪等. 蚕豆萌发花粉的超微结构. 厦门大学学报 (自然科学版) ,1997 ,36 (1) :153～157
CYTOLOGICAL EFFECT OFγ2RADIATION ON vicia f aba POLL EN
Wang Houcong1 　Yang Shanmin2 　Zheng Tao1
( Dept . of Biology1 , Cancer Research Center2 , Xiamen U niversity , Xiamen 　361005)
ABSTRACT
To study the radiation cytological effect on pollen grain f unction , fresh pollen samples shed
from Vicia f aba were exposed to 60Coγ2ray in doses ranging from 0 to 837 Gy ,and immediately
permitted to germinate in vit ro. It was shown that with increasing dose ofγ2irradiation , both
the rate of pollen germination and the rate of sperm nucleus that migrating into pollen tube were
reduced , concurrently , the rate of aberrant nuclei was elevated. Cytological examination showed
that formation of the nuclei and organella in the pollen tube appeared to be normal by irradia2
tion of 93 Gy , while withγ2radiation of 279 Gy and up subcellular structure of the germinating
pollen cells exhibited various degrees of distortion : mitochondria and immature plastids vacuo2
lated , nuclear membrance disrupted , sperm nucleus fractured , occasionally , and photo2chemo2
ferritin accumulated in the immature plastids. With the doses of above 465 Gy , multivesicular
bodies presented in the pollen tube , suggesting that 465 Gy could be marked as the semilethal
dose.
Key words :Pollen grain of V icia f aba ,γ2irradiation , cytological effect , semilethal dose , ul2
t rast ructure
802 Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
1997 ,11 (4) :204～208