全 文 ：核 农 学 报 2011，25(3):0488 ～ 0493
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
收稿日期:2010-08-15 接受日期:2010-10-12
作者简介:梁新乐(1969-)，男，湖北江陵人，博士，教授，研究方向为应用微生物学。E-mail:dbiot@ mail． zjgsu． edu． cn
文章编号:1000-8551(2011)03-0488-06
氡温泉中耐辐照嗜热菌的分离及其特性研究
梁新乐 杨 龙 张 虹 张 蕾
(浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江 杭州 310012)
摘 要:氡温泉水样经 8kGy60 Co γ 射线预处理后，从中分离获得 1 株耐60 Co γ 射线和 UV 辐照的嗜热菌
株 R4 － 33。经形态观察、生理生化试验、脂肪酸分析、(G + C)mol%含量和 16S rDNA 序列测定，结果表
明，菌株 R4 － 33 为杆状，革兰氏阴性菌，无鞭毛，形成末端芽孢;最适生长温度 60℃，最适生长 pH 7. 5;
能以葡萄糖、麦芽糖和海藻糖等作为唯一碳源生长，水解酪素和淀粉;过氧化氢酶阳性;对青霉素、新霉
素、红霉素、万古霉素、链霉素、庆大霉素、丁胺卡拉和氨苄青霉素敏感;细胞主要脂肪酸为 C14∶ 1
(48. 4%)和 C15∶ 1(15. 2%);基因组 DNA 中(G + C)mo1% 含量 58. 2%。经比对菌株 R4 － 33 的 16S
rDNA 序列与 Anoxybacillus 属菌株有较高的同源性，其中与 Anoxybacillus gonensis 菌株的相似性高达
99. 5%。经 R4 － 33 菌株生理生化试验及 16S rDNA 序列分析，该株菌归属于 Anoxybacillus 属，暂命名为
Anoxybacillus sp． R4 － 33。耐辐射细胞存活试验结果显示菌株 R4 － 33 对 UV 的耐辐射能力达 396J /m2，
对60 Co γ 射线耐辐照能力为 14kGy，表明其对 UV 和 γ 射线辐照具有较高耐受性。
关键词:耐辐射;嗜热菌;Anoxybacillus 属;分类
ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF A RADIATION RESISTANT THERMOPHILIC
BACTERIUM FROM RADON HOT SPRING
LIANG Xin-le YANG Long ZHANG Hong ZHANG Lei
(1. Department of Biotechnology，Zhejiang Gongshang University，Hangzhou，Zhejiang 310035)
Abstract:A radiation resistant and thermophilic bacterium strain R4 － 33 was isolated from radon hot spring water
samples，pretreated with 60Co γ - rays and UV irradiation． Tests on morphological，physiological and biochemical
characters，fatty acid compositions，(G + C)mol% contents，and 16S rDNA sequencing were conducted． The results
showed that strain R4 － 33 was of rod-shape，Gram-negative，atrichous，and endospore-forming． The optimum growth
temperature and pH were 60℃ and 7. 5，respectively． The strain utilized glucose，maltose and trehalose as carbon
sources，and hydrolyzed casein and starch． Its catalase positive． The strain was sensitive to penicillin，neomycin，
erythromycin，vancomycin，streptomycin，gentamycin，amikacin and ampicillin． The major cellular fatty acids were
C14:1(48. 4%)and C15:1(15. 2%)． The (G + C)mol% content of DNA was 58. 2% ． Phylogenetic tree based on 16S
rDNA sequence showed R4 － 33 shared highly similarity to those of species in genus Anoxybacillus，especially to that of
Anoxybacillus gonensis (99. 5%)． Based on the above，the strain R4 － 33 was proposed to the evolution branch of
Anoxybacillus and designated as Anoxybacillu sp． R4 － 33. The UV and γ-radiation tests showed that the strain R4 － 33
had an ability of resistance to UV of 396J /m2 and60 Co γ-rays irradiation of 14. 0kGy，indicating that the strain was a
radiation resistant and thermophilic bacterium．
Key words:radiationresistant;thermophilic bacterium;Anoxybacillus;taxonomy
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3 期 氡温泉中耐辐照嗜热菌的分离及其特性研究
极端微生物因其独特的生理学特征和巨大的工业
潜在价值，已成为微生物新资源开发的热点。目前耐
辐射细菌研究报道最多的是耐辐射奇异球菌，主要集
中于菌种分离分类、耐辐射分子机制和基因进化等方
面［1，2］。耐辐射嗜热菌属双极微生物范畴，由于其独
特的耐辐射和嗜热双重特性，其在农业、环境、生物医
学、国防等领域展现出巨大的应用前景［3，4］。Battista J
R 等［5］将耐辐射菌中的抗干旱基因转化植物并表达，
提高植物对干旱的忍耐力，从而提高有限水资源的利
用;Appukuttan 等［6］通过构建表达非特异性酸性磷酸
酶基因的耐辐射球菌工程菌对水中的铀进行沉淀，修
复铀污染的环境。
浙江泰顺氡温泉位于浙江省温州境内，日产泉水
达 500t 左右，温度为 55℃，水中放射性氡含量为 55. 5
Bq /L。氡温泉为筛选和分离耐辐射嗜热微生物提供
了良好的材料。本文以泰顺氡温泉水为样品，从中分
离得到 1 株耐辐射嗜热菌 R4 － 33。经形态学、生理生
化特征、(G + C)mol%含量、脂肪酸成分及 16S rDNA
序列测定分析，初步确定 R4 － 33 属厌氧芽孢杆菌属
(Anoxybacillus)，并具有耐辐射特性，淀粉酶和蛋白酶
活性，表明该菌株在特殊恶劣环境下(辐射 +高温)的
应用潜力。本文对探索具有新功能的耐辐射嗜热微生
物菌种提供了新途径。
1 材料和方法
1. 1 材料
1. 1. 1 样品 样品为浙江温州泰顺氡温泉水，温度
55℃左右，pH 7. 5 ～ 8. 0，氡含量 55. 5Bq /L，运回实验
室后 4℃保存。
1. 1. 2 培养基 TY 培养基:1. 0%胰蛋白胨，0. 5%酵
母浸出粉，0. 2% NaCl，用泉水溶解，调 pH 7. 5。TGY
培养基:0. 1%葡萄糖，0. 5%胰蛋白胨，0. 3%酵母提取
物，pH 7. 0。LB 培养基:1. 0% 胰蛋白胨，0. 5% 酵母
粉，1. 0% NaCl，pH 7. 2。
1. 1. 3 对照菌株 耐辐射异常球菌 (Deinococcus
radiodurans R1)购自中国农业科学院，培养条件为
TGY 培养基，30℃ 培养 2 ～ 3d;大肠杆菌(Escherichia
coli DH5α)为本实验室保存，培养条件为 LB 培养基，
37℃过夜培养。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 菌株分离及培养［7］ 温泉水样按 5ml /管分装
于 10ml 的离心管中，置于60 Co γ 射线下辐照，辐照剂
量为 8kGy。取 1ml 菌液用 10mmol /L 磷酸缓冲液进行
倍比稀释(10 － 1 ～ 10 － 6)，然后分别取 200μl 涂布于 TY
固体培养基，于 55℃培养 24h 后挑取单菌落直至纯培
养，并命名其中 1 株为 R4 － 33。
1. 2. 2 样品处理及形态观察 扫描电镜样品在
2. 5%的戊二醛溶液中 4℃固定过夜;倒掉固定液，用
0. 1mol /L pH 7. 0 的磷酸缓冲液漂洗样品 3 次，每次
15min;用 1%的锇酸溶液固定样品 1. 5h;倒掉固定液，
用 0. 1mol /L pH 7. 0 的磷酸缓冲液再次漂洗样品 3
次，每次 15min;用梯度浓度(50%、70%、80%、90%和
95%)的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处
理 15min，再用 100%的乙醇处理 2 次，每次 20min;用
乙醇与醋酸异戊酯混合液(V ∶ V = 1 ∶ 1)处理样品
30min，再用纯醋酸异戊酯处理样品 1. 5h;临界点干
燥;样品黏附在样品台上，在 EikoIB5 型离子溅射仪中
喷镀 4 ～ 5min;荷兰 Phikps 公司的 XL30 型 EMES 扫描
电镜观察。透射电镜样品悬于 2ml 磷酸缓冲液
(0. 1mol /L，pH7. 0)中，制成菌悬液;取等量的上述菌
悬液与等量 2% 的磷钨酸钠水溶液混合，制成混合菌
悬液。用菌毛细吸管吸取混合菌悬液滴在铜网膜上。
经 3 ～ 5min 后，用滤纸吸去余液，待样品干燥后，置低
倍光学显微镜下检查，挑选膜完整、菌体分布均匀的铜
网投射电镜(JEM-1230)观察照相。
1. 2. 3 16S rDNA 序列分析 采用通用细菌引物 F8
(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)和 R1513 (5-
ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3)进行 16S rDNA 的
PCR 扩增。PCR 扩增条件［12］:94℃ 5min;94℃ 1min，
56℃ 1min，72℃ 2min，30 个循环;72℃ 10min。扩增产
物经纯化后，送上海生工生物技术有限公司测序。所
测序列用 BLAST 软件与 GenBank 和 RDP 数据库进行
相似性分析，并与相关的亲近物种用 MEGA 4. 0［13］软
件包中的 Neighbor-Joining 法［14］构建系统进化树。使
用 p-distance 法［15］，重复抽样 1000 次分析系统树各分
枝的置信度。
1. 2. 4 UV 和 γ 射线辐照抗性试验 UV 辐照抗性检
测［16］:取 2ml 生长至对数期菌液于 8000r /min 离心收
集菌体，重悬于 2ml 磷酸缓冲液(10mmol /L，pH 7. 0)
中。然后将 lml 细胞悬液置于培养皿中(开盖)，室温
下用不同剂量的 256nm 紫外线对菌液进行照射。经
UV 处理的细胞用磷酸缓冲液(10mmol /L，pH 7. 0)进
行一系列倍比稀释(10 － 1 ～ 10 － 6)。然后分别取 100μl
稀释液涂布于 TY 固体培养基上，每处理设 3 个重复，
在 55℃ 培养 24h，观察记录结果。 γ 辐照抗性检
测［16］:菌液处理同 UV 辐照抗性试验，将装有 1ml 细
胞悬液的 EP 管分别置于 2. 0、4. 0、6. 0、8. 0、10. 0 和
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14. 0kGy 60 Co γ 射线(1. 69 × 1015 Bq 辐射源)下照射。
辐照后的细胞用 10mmol /L 磷酸缓冲液一系列倍比稀
释(10 － 1 ～ 10 － 6)，然后各取 100μl 稀释液分别涂布于
TY 固体培养基上，每处理 3 个重复。经 55℃ 培养
24h，观察记录结果。
UV 和 γ 辐 照 抗 性 检 测 时，用 Deinococcus
radiodurans R1 和 E． coli DH5α 分别作为阳性和阴性
对照菌株。存活率计算采用相同条件下的未辐照菌做
对照。
1. 3 指标测定
1. 3. 1 生长特性［8］ 在 45℃ ～ 75℃范围内测定菌株
R4 － 33 在各个温度下的生长速度，以各个温度下的
OD600值对温度作图，得到生长温度曲线;在最适生长
温度下，测定菌株 R4 － 33 在不同 pH 缓冲液(pH6 ～
10)中的生长速度，得到生长 pH 曲线;在最适生长温
度和 pH 条件下，测定不同浓度的 NaCl 对菌株 R4 － 33
生长的影响。
1. 3. 2 碳源利用测定［8］ 采用杭州微生物试剂有限
公司提供的细菌生化微量鉴定管。测定的碳源包括葡
萄糖、麦芽糖、棉籽糖、乳糖、半乳糖、木糖、淀粉、海藻
糖和蔗糖。
1. 3. 3 抗生素抗性测定［8］ 用无菌水配制抗生素溶
液，无菌滤膜过滤后加入 TY 液体培养基中，55℃，
150r /min 摇床培养，24h 后观察结果。所用抗生素包
括链霉素、红霉素、新霉素、青霉素、万古霉素、庆大霉
素、氨苄青霉素、丁胺卡拉、氯霉素和苯唑青霉素。每
种抗生素分别配成终浓度为 10 和 100μg /ml 的 2 种溶
液。
1. 3. 4 脂肪酸成分分析 细胞脂肪酸成分测定采用
气相色谱法［9］，分析条件:炉温为二阶程序升温:起始
温度 170℃，以 5℃ /min 升至 260℃，随后以 40℃ /min
升至 310℃，维持 1. 5min;进样口温度 250℃，载气为
氢气，流速 0. 5ml /min，分流进样模式，分流比 50∶ 1，进
样量 2μl;检测器温度 300℃，氢气流速 30ml /min，空气
流速 216ml /min，补充气(氮气)流速 30ml /min。
1. 3. 5 基因组 DNA 的(G + C)mol%含量测定 基因
组 DNA 提取采用 CTAB 法［10］。(G + C)mol%含量测
定参考 Tamaoka 和 Komagata 等［11］的方法。液相色谱
分析条件:色谱柱为安捷伦 ZORBAX SB Aq-C18 柱
(4. 6mm × 250mm，5μm);流动相 A 为 20mmol /L 醋酸
铵缓冲盐溶液，流动相 B 为乙腈。梯度洗脱条件:0 ～
10min，B 相 5%→10%;10 ～ 11min，B 相 10%→90%;
11 ～ 15min，B 相 90%;15 ～ 16min，B 相 90%→5%;16
～ 18min，B 相 5%;检测波长 280nm，流速 0. 6ml /min，
色谱柱温度:室温;进样量:8μl。
2 结果与分析
2. 1 耐辐射嗜热菌的分离及形态特征
2. 1. 1 耐辐射嗜热菌的分离筛选 单菌落经分离、纯
化培养后从中挑选获得菌株 R4 － 33，该菌株可在高辐
照剂量下存活，确定菌株 R4 － 33 具有耐辐射特性;同
时该菌株在 55℃下生长良好，可见菌株 R4 － 33 是一
株耐辐射的嗜热菌。
2. 1. 2 R4 － 33 的菌体形态特征 R4 － 33 在 TY 固体
平板培养基上培养 2d 能形成 4mm 左右菌落，呈多个
同心圆环，较粘稠，易挑起，边缘整齐。在电子显微镜
下进行镜检观察到细胞呈短杆状，大小为(1 ～ 2)μm
×(0. 5 ～ 0. 6)μm (图 1 － A)，有些成对或以短链排
列，形成末端芽孢(图 1 － B)。
图 1 菌株 R4 － 33 在扫描电镜(A，10000 ×)和透射电镜
(B，30000 ×)下的形态特征
Fig． 1 Morphology of strain R4 － 33 under scanning
electron microscopy (A，10000 ×)and transmission
electron microscopy (B，30000 ×)
2. 2 生理生化特性
菌株 R4 － 33 能以葡萄糖、麦芽糖和海藻糖为唯
一碳源生长，发酵产酸;不利用半乳糖、乳糖和木糖，不
水解明胶;过氧化氢酶阳性;能水解酪素和淀粉;生长
温度 45℃ ～ 70℃;最适生长温度 60℃(图 2-A);生长
pH 范围 6. 0 ～ 9. 0，最适生长 pH 7. 5 左右(图 2-B)，适
合在偏碱性的环境中生长;最适生长的 NaCl 浓度 0 ～
0. 6%，当 NaCl 浓度大于 0. 7%时，生长被抑制。
2. 3 基因组 DNA 的(G + C)mol%含量测定
通过测定 4 种脱氧核糖核苷酸含量，经公式(G +
C)mol% = (G + C)/(G + C + A + T)计算，菌株 R4
－ 33 的基因组 DNA 中(G + C)mol%含量为 58. 2%。
2. 4 16S rDNA 序列及系统发育树分析
经测序，菌株 R4 － 33 的 16S rDNA 序 列 长
1460bp，其 GenBank 登录号为 HM587242。用 BLAST
程序对该序列和 GenBank 中已登录的 16S rDNA 序列
进行核苷酸同源性比较，结果发现菌株 R4 － 33 与
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3 期 氡温泉中耐辐照嗜热菌的分离及其特性研究
图 2 温度(A)、pH(B)对菌株 R4 － 33 生长的影响
Fig． 2 Effect of temperature (A)and
pH (B)on growth of strain R4 － 33
Anoxybacillus 属成员具有较高的序列同源性，相似性在
96% ～ 99% 之间。其中，R4 － 33 菌株与 Anoxybacillus
gonensis NCIMB 13933T 的 16S rDNA 序列(GenBank 登
录号:AY122325)的同源性最高(＞ 99. 5%)。基于
16S rDNA 基因序列，用 Neighbor- Joining 方法构建 R4
－ 33 菌株与亲缘关系相近物种的系统发育树(图 3)，
表明 R4 － 33 属于 Anoxybacillus。
2. 5 菌株 R4 － 33 耐 UV 和60Co γ射线辐照特性
菌株 R4 － 33 经 396J /m2剂量 UV 辐照后细胞仍
有存 活 (存 活 率 为 0. 1%)，与 阳 性 对 照 菌 D．
radiodurans R1 结果类似(图 4);而阴性对照菌 E． coli
DH5α 经 198J /m2 UV 辐照后没有细胞存活。经 2. 0
kGy 60 Co γ 射线辐照后 E． coli DH5α 细胞没有存活，
但此剂量对菌株 R4 － 33 和 D． radiodurans R1 生存几
乎没有影响。当辐照剂量达到 14. 0kGy 后菌株 R4 －
33 仍然有细胞存活 (图 5)，可见菌株 R4 － 33 对 UV
和60 Co γ射线辐照具有较强的耐受性。
2. 6 指标测定
2. 6. 1 抗生素抗性 抗生素试验表明菌株 R4 － 33
对链霉素、红霉素、新霉素、青霉素、万古霉素、庆大霉
素、氨苄青霉素和丁胺卡拉 8 种抗生素敏感。
图 3 基于 16S rDNA 序列构建的包括菌株 R4 － 33 在内的无氧芽孢杆菌系统发育树
Fig． 3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences，showing the relationship
between strain R4 － 33 and the members of Anoxybacillus
2. 6. 2 脂肪酸成分分析 经测定，菌株 R4 － 33 的细
胞脂肪酸由 7 种饱和脂肪酸和 6 种不饱和脂肪酸组
成，其 中 C14∶ 1 (48. 4%)、C15:1 (15. 2%)、C12∶ 0
(8. 27%)、C13∶ 0(7. 48%)和 C16∶ 0(6. 85%)。
3 讨论
耐辐射菌是一类具有重要开发利用前景的极端微
生物资源，现今发现的耐辐射菌主要是耐辐射奇异球
菌属，美国能源部已着手研究耐辐射菌用于核废料治
理和污染物处理［17］。华跃进等［18］利用该菌构建了检
测环境放射性和遗传毒性物质的生物传感器以及开发
了放射性污染检测试剂盒。近年来耐辐射嗜热菌的研
究报道逐渐增多，冯雁［19］等从长白山温泉分离鉴定了
1 株嗜热厌氧芽孢杆菌 CBS － 5;唐然［20］等从新疆戈壁
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核 农 学 报 25 卷
图 4 菌株 R4 － 33 UV 辐照生存曲线
Fig． 4 Survival curves of R4 － 33
irradiated by UV
图 5 菌株 R4 － 33 60 Co γ 射线辐照生存曲线
Fig． 5 Survival curves of R4 － 33
irradiated by 60 Co γ － rays
土壤中分离到 1 株耐辐射菌 I － 7R，经鉴定为 Kocuria
属。从台湾地热环境中分离的具有辐照抗性的嗜热
菌［21］ 分 别 属 于 7 个 属:Deioncoccus、Rubrobacter、
Meiothermus、Bacillus、Aneurinibacillus、Anoxybacillus 和
Paenibacillus，这 也 是 首 次 报 道 厌 氧 芽 孢 杆 菌 属
(Anoxybacillus)具有嗜热及耐辐射的双重特性。目前
厌氧芽孢杆菌属已有多个种被鉴定，大多来自于陆地
热泉。菌株 R4 － 33 分离自浙江泰顺氡温泉，根据其
形态学和生理生化特征，初步确定属厌氧芽孢杆菌属
(Anoxybacillus)，但与同属内其他种在生理特征上也存
在差异。厌氧芽孢杆菌属的绝大多数种的主要脂肪酸
为 iso － C15∶ 0，如 Anoxybacillus flavithermus 中 iso-C15∶ 0为
54. 8%［22］，Anoxybacillu ayderensis 中 为 48. 2%［23］，
Anoxybacillus kestanbolensis 中 为 68. 6%［23］，
Anoxybacillus gonensis 中 为 65. 2%［24］，Anoxybacillus
pushchinoensis 中为 51. 9%［22］，而菌株 R4 － 33 的脂肪
酸主要成分为 C14:1，含量为 58. 2%，与厌氧芽孢杆菌
属中的其他种明显不同。过氧化氢酶阳性，氧化酶阴
性，UV 和 γ 射线辐照抗性等生理生化特征也存在差
异。(G + C)mo1%含量为 58. 2%，较已报道的同属其
种略高。16S rDNA 序列测定结果表明菌株 R4 － 33 与
Anoxybacillus 属 成 员 具 有 较 高 的 序 列 同 源 性，与
Anoxybacillus gonensis NCIMB 13933T 的 16S rDNA 序列
(GenBank 登录号:AY122325)的同源性最高(identity
＞ 99. 5%)。随着对 R4 － 33 菌株研究的深入，其潜在
应用价值将在今后陆续报道。
4 结论
菌株 R4 － 33 是自浙江泰顺氡温泉分离获得的一
株耐辐射嗜热菌。细胞呈短杆状，长 1 ～ 2μm，宽 0. 5
～ 0. 6μm，末端形成椭圆形芽孢，革兰氏染色阴性。在
TY 培养基，温度 45℃ ～ 70℃(最适 60℃)和 pH 6. 0 ～
9. 0 (最适 pH 7. 2)下可以生长。能以葡萄糖、麦芽糖
和海藻糖为唯一碳源生长，发酵产酸。不利用半乳糖、
乳糖和木糖，不水解明胶。过氧化氢酶阳性。能水解
酶酪素、淀粉。对链霉素、红霉素、新霉素、青霉素、万
古霉素、庆大霉素、氨苄青霉素和丁胺卡拉等抗生素敏
感。主要脂肪酸为 C14∶ 1 (48. 4%)，C15∶ 1 (15. 2%)，
C12∶ 0(8. 27%)，C13∶ 0(7. 48%)和 C16∶ 0(6. 85%)。DNA
(G + C)mol%含量为 58. 2%。与 Anoxybacillus 属成员
具有较高的序列同源性(16S rDNA 基因序列相似性在
96 ～ 99% 之间)。菌株 R4 － 33 被归于 Anoxybacillus
属，初步命名为 Anoxybacillus sp． R4 － 33。菌株 R4 －
33 对紫外线的耐辐照能力达 396J /m2，对60 Co γ 射线
的耐辐照能力为 14kGy。
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