全 文 ：文章编号 :100028551 (2009) 0120085205
日本臭菘体细胞胚胎发生及植株再生体系的建立
姜云天1 　陈艳秋2 　朱俊义1 　李玉梅3 　曲柏宏2
(11 通化师范学院生物系 ,吉林 通化　134002 ; 21 延边大学农学院园艺系 ,吉林 龙井　133400 ;
31 吉林师范大学 ,吉林 四平　136000)
摘 　要 :以日本臭菘幼叶为外植体 ,应用均匀设计法筛选其最适合的胚性愈伤组织及胚性细胞复合体诱
导体细胞胚胎发育及植株再生的培养基配方 ,建立日本臭菘体细胞胚胎发生体系。结果表明 ,LS + 62BA
110mgΠL + 2 ,42D 210mgΠL + IAA 011mgΠL 适宜日本臭菘幼叶胚性愈伤组织及胚性细胞复合体诱导 ,诱导
率为 98 % ;LS + 62BA 0150mgΠL + NAA 0110mgΠL + IAA 0110mgΠL 最适宜体胚发育及植株再生 ,体胚萌发
率为 100 % ,萌发的体胚在发育培养基上继续培养 42d 后全部发育成完整植株。对不同阶段培养材料的
形态结构及超微结构的观察证明 ,已成功建立了日本臭菘体细胞发生及植株再生体系。
关键词 :日本臭菘 ;均匀设计 ;胚性细胞复合体 ;体细胞胚 ;植株再生
ESTABLISHMENT OF SOMATIC EMBRYOGENESIS AND PLANT REGENERATION
SYSTEM OF Symplocarpus nipponicus MAKINO
J IANG Yun2tian1 　CHEN Yan2qiu2 　ZHU Jun2yi1 　LI Yu2mei3 　QU Bai2hong2
(11 Department of Biology , Tonghua Normal University , Tonghua , Jilin 　134002 ;
21 Department of Horticulture , Yanbian Agricultural College of Yanbian University , Longjing , Jilin 　133400 ;
31 Jilin Normal University , Siping , Jilin 　136000)
Abstract :Young leaves of Symplocarpus nipponicus Makino were used as explants in this experiment . Uniform design for the
most suitable media for embryogenic callus induction and embryogenic cell complex ,development of somatic embryo and plant
regeneration were screened , in vitro plants had been successfully developed. The results showed that medium of LS + 62
BA 110mgΠL + 2 ,42D 210mgΠL + IAA 011mgΠL was suitable for embryogenic callus and embryogenic cell complex induction ,
the inducement percentage was 98 % ; the medium of development of somatic embryo and plant regeneration was LS + 62BA
0150mgΠL + NAA 0110mgΠL + IAA 0110mgΠL , the regeneration percentage was 100 % , and converted into plantlets with
shoots and roots after 42 days culture on the same medium. The observation of morphostructure and ultrastructure proved that
somatic embryogenesis and plant regeneration system of Symplocarpus nipponicus Makino had been successfully established.
Key words : Symplocarpus nipponicus Makino ; uniform design ; embryogenic cell complex ; somatic embryo ; plant regeneration
收稿日期 :2008206202 　接受日期 :2008208228
基金项目 :通化师范学院自然科学基金 (2008043)
作者简介 :姜云天 (19752) ,男 ,吉林四平人 ,助教 ,硕士研究生 ,主要从事长白山区植物生理生化研究. Tel : 043523208073 ; E2mail : gudizhou @
1631com
通讯作者 :曲柏宏 (19632) ,男 ,吉林长岭人 ,教授 ,主要从事果树生理研究. Tel :043322732058 ; E2mail :bhqu @ybu. edu. cn　　日本臭菘 ( Symplocarpus nipponicus Makino) ,天南星科臭菘属 ,吉林省一类重点保护草本植物 ,是长白山区野生珍稀濒危药用植物[1 ] 。该植物全草入药 ,主治失眠、风湿性心脏病、气管炎、风湿等症。全株可做植物性杀虫剂。我国仅在吉林省抚松县和通化有零星分 布。因其种子不易获得 ,其常规繁殖主要靠分蘖方式 ,繁殖系数小。体细胞胚胎发生途径是培养体细胞经历与合子胚发育相似的过程 ,通过诱导形成胚性细胞复合体 ,然后萌发进而发育为完整植株。不仅繁殖系数
58　核 农 学 报　2009 ,23 (1) :85～89Journal of Nuclear Agricultural Sciences
高 ,而且遗传稳定性强 ,可用于人工种子的制作 ,大大
提高种苗生产效率 ,并可用于遗传转化 ,直接通过体胚
发生途径获得日本臭菘转基因植株。目前 ,国内外关
于植物体细胞胚胎发生研究的报道较多[2～6 ] ,本文在
前人报道的基础上 ,采用均匀设计法对日本臭菘体胚
诱发及发育的培养基进行筛选 ;同时对体胚发生发育
过程的形态及超微结构进行研究 ,为深入了解日本臭
菘体胚发生的形态学及形态调控技术提供依据 ,为提
高种苗生产率和制作日本臭菘人工种子奠定基础。
1 　材料与方法
111 　材料
2007 年 7 月 ,于吉林省哈泥河国家级自然保护区
采集日本臭菘新生幼叶。
112 　方法
11211 　材料处理 　将日本臭菘新发幼叶剪下 ,在超净
工作台上用 70 %酒精涮洗 10s ,再用含 3 %链霉素的次
氯酸钠 (011 %)溶液浸泡 10min ,无菌水冲洗 8 次 ,用无
菌滤纸将外植体表面的水分吸干 ,切除受灭菌剂损害
的边缘部分后备用[7 ,8 ] 。
11212 　胚性愈伤组织及胚性细胞复合体的诱导 　以
LS 为基本培养基 ,添加蔗糖 20gΠL ,琼脂 810gΠL ,pH
515 ,温度控制在 26 ℃±2 ℃,黑暗培养。将幼叶背面朝
下接种到附加不同浓度细胞分裂素 62BA 和生长素 2 ,
42D、NAA、IAA (由预试验可知 : 62BA 浓度控制 011～
110mgΠL ,2 ,42D、NAA、IAA 浓度均控制在 0～210mgΠL)
的LS 培养基上进行胚性愈伤组织及胚性细胞复合体
诱发培养。为了提高日本臭菘胚性愈伤组织诱导的速
度和诱导率 ,采用均匀设计法[9 ] ,每个处理外植体数为
30 ,选用 U10 (108 ) 均匀表 (见表 1) ,同时考察了细胞分
裂素 62BA 和生长素 2 ,42D、NAA、IAA 的浓度交叉配比
对诱导率的影响 ,结果见表 2。观察胚性愈伤组织形
成情况 ,筛选最合适的诱导培养基。
11213 　体细胞胚发生发育及植株再生 　将含有胚性
细胞复合体胚性愈伤组织转接到附加 62BA、IAA、IBA、
NAA (由预试验可知 : 62BA 浓度范围控制在 011～
015mgΠL ,NAA、IAA 浓度范围均控制在 011～110mgΠL)
的LS 培养基上进行体胚发生及发育培养 ,筛选最佳的
体胚发生发育培养基。为了提高日本臭菘体胚的发育
及萌发速度和萌发率 ,采用均匀设计法 ,每个处理接种
体胚数为 30。选用 U10 (108 ) 均匀表 (表 3) ,同时考察
了细胞分裂素 62BA 和生长素 NAA、IAA 的浓度交叉配
比对萌发率的影响 ,结果见表 4。培养到一定时期后 ,
胚性愈伤组织表面产生鱼雷状突起时 ,此时将突起剥
离 ,转接到体胚发生培养基中继续培养 ,使体胚继续发
育并萌发后形成完整的植株。同时 ,结合电镜观察体
胚产生的部位及发育情况 (球形胚、盾形胚、子叶胚和
再生植株) 。
表 1 　U10 ( 104 )因素及水平设计
Table 1 　U10 (104 ) gactors and levels design
水 平
levels
因素 factors( hormone) (mgΠL)
X1 X2 X3 X4
1 0110 0100 0100 0100
2 0120 0110 0110 0110
3 0130 0125 0125 0125
4 0140 0150 0150 0150
5 0150 0175 0175 0175
6 0160 1100 1100 1100
7 0170 1125 1125 1125
8 0180 1150 1150 1150
9 0190 1175 1175 1175
10 1100 2100 2100 2100
表 2 　U10 ( 104 )均匀设计试验安排及结果
Table 2 　U10 (104 ) uniform design test plan and result
处理号
treatment code
因素 factors( hormone) (mgΠL)
X1 X2 X3 X4
Y
( %)
1 0110 0125 0150 0175 57100
2 0120 1100 1150 2100 65100
3 0130 1175 0100 0150 84100
4 0140 0100 0175 1175 49100
5 0150 0150 1175 0125 70100
6 0160 1125 0110 1150 77100
7 0170 2100 1100 0110 93100
8 0180 0110 2100 1125 62100
9 0190 0175 0125 0100 78100
10 1100 1150 1125 1100 88100
Note: X1 : 62BA ; X2 : 2 , 42D ; X3 : NAA ; X4 : IAA ; Y 为诱导率 inducement
percentage.
11214 　结果观察 　用数码相机对外植体各阶段的形
态变化进行拍摄。同时 ,将不同阶段的培养物剥离或
切割成 2～3 mm 的小块用导电胶粘在样品台上 ,将样
品台放入日立 S23000N 型的扫描电镜上观察并拍摄。
113 　数据分析与处理 　数据分析与处理采用均匀设
计 (Uniform Design)软件。
2 　结果与分析
211 　不同激素配比对含胚性愈伤组织及胚性细胞复
合体诱导的影响
68 核　农　学　报 23 卷
表 3 　U10 ( 103 )因素及水平设计
Table 3 　U10 (103 ) factors and levels design
水平
levels
因素 factors(hormone) (mgΠL)
X1 X2 X3
1 0110 0110 0110
2 0120 0120 0120
3 0130 0130 0130
4 0140 0140 0140
5 0150 0150 0150
6 0110 0160 0160
7 0120 0170 0170
8 0130 0180 0180
9 0140 0190 0190
10 0150 1100 1100
表 4 　U10 ( 103 )均匀设计试验安排及结果
Table 4 　U10 (103 ) uniform design test plan and result
处理号
treatment code
因素 factors(hormone) (mgΠL)
X1 X2 X3
Y
( %)
1 0110 0150 0170 68100
2 0120 1100 0130 66100
3 0130 0140 1100 74100
4 0140 0190 0160 72150
5 0150 0130 0120 93100
6 0110 0180 0190 62100
7 0120 0120 0150 78100
8 0130 0170 0110 76100
9 0140 0110 0180 89100
10 0150 0160 0140 79100
Note : X1 :62BA ; X2 :NAA ; X3 : IAA ; Y 为萌发率 germination.
　　根据 U10 (104 ) 均匀设计试验安排表进行试验 (见
表 2) ,并将试验所得胚性愈伤组织诱导率经均匀设计
软件处理得回归方程 : Y = 5411 + 1219 X1 + 1610 X2 +
01691 X3 - 4154 X4 ,样本容量 N = 10 ,显著性水平α=
0101 ,复相关系数 R = 019944 ,检验值 Ft = 10919 ,临界
值 F(0101 ,4 ,5) = 11139 , Ft > F(0101 ,4 ,5) ,回归方程显著。对
各方程项进行显著性检验可知 :检验值 F(3) = 014266 ,
临界值 F(0101 ,1 ,5) = 16126 , F(3) ≤F(0101 ,1 ,5) ,此方程项不
显著。剔除不显著方程项 ,新建回归方程继续计算 :得
回归方程 : Y = 5416 + 1314 X1 + 1518 X2 - 4142 X4 ,复相
关系数 R = 019938 ,检验值 Ft = 16119 ,临界值 F(0101 ,3 ,6)
= 91780 , Ft > F(0101 ,3 ,6) ,回归方程显著。同理 ,对各方
程项进行显著性检验可知 :各方程项对 Y 值均影响显
著。求得试验范围内的最佳条件为 : X1 = 110 , X2 =
210 , X3 = 0 , X4 = 011 ,在此组合基础上求得最优解 : y
= 9911 ,此解为回归方程的解析解 ,按公式 Y = y ±uα·
s (其中 uα 为正态分布的双侧分位数 , s 为剩余标准
差) 计算出优化值区间估计为 Y = 9911 ( ±7111) ,即
91199 %～106121 %。
用试验得到的优化值 62BA 110mgΠL + 2 , 42D
210mgΠL + IAA 011mgΠL 进行验证优化值试验 ,幼叶接
种到诱导培养基 15d 后逐渐增厚变形 ,继续培养至 45d
后完全脱分化形成黄绿色表面光滑致密的愈伤组织
(图 12a) ,60d 后部分愈伤组织表面逐渐形成颗粒状的
小突起 (图 12b) 。通过电镜观察确定 :表面光滑致密的
愈伤组织是含有胚性细胞复合体的胚性愈伤组织 (图
22a ,b) ,小突起是体胚发育的前期即球形胚 (图 22c ,
d) 。60d 后统计诱导率 ,可达 98 %以上 ,在估计区间范
围内 ,且比所有试验 Y 值都大。因此 ,日本臭菘幼叶
诱导含胚性细胞复合体的胚性愈伤组织最佳培养基
为 :LS + 62BA 110mgΠL + 2 ,42D 210mgΠL + IAA 011mgΠ
L。
图 1 　日本臭菘体细胞胚诱导及发生发育各阶段的形态结构
Fig. 1 　Morphostructure of inducing and developing somatic embryogenesis in
various stages of Symplocarpus nipponicus Makino
a : 胚性愈伤组织 ; b : 含有球形胚的胚性细胞复合体 ; c : 体细胞胚萌发 ; d : 体细胞胚萌发后发育为完整植株
a : Embryonic Callus ; b : Embryonic cell complex with globular embryo ; c : Somatic cell embryo germination ;
d : Somatic embryos developed a complete plant after germination
78　1 期 日本臭菘体细胞胚胎发生及植株再生体系的建立
图 2 　日本臭菘体细胞胚诱发及发育各阶段组织结构扫描电镜观察
Fig. 2 　Showing scanning electron microscopical observation of induction and development of
symplocarpus nipponicus makino somatic embryo in different stages
a : 含胚性细胞复合体的胚性愈伤组织 ( ×60) ; b : 胚性细胞复合体 ( ×180) ; c :含球形胚的胚性细胞复合体 ( ×215k) ;
d : 球形胚 ( ×100) ; e : 盾形胚 ( ×60) ; f : 子叶胚 ( ×35)
a : embryonic Callus with embryonic cells complex( ×60) ; b : Embryonic cell complex( ×180) ; c : Embryonic cell complex with Globular embryo
( ×215k) ; d : Globular embryo ( ×100) ; e : Scutellate embryo ( ×60) ; f : Cotyledonary embryo ( ×35)
212 　不同激素配比对体细胞胚发育及植株再生的影
响
根据 U10 (103 ) 均匀设计试验安排表进行试验 (见
表 4) ,并将试验所得体胚萌发率经均匀设计软件处理
得回归方程 : Y = 8011 + 3616 X1 - 1816 X2 - 9126 X3 ,样
本容量 N = 10 ,显著性水平α= 0101 ,复相关系数 R =
019943 ,检验值 Ft = 17311 ,临界值 F(0101 ,3 ,6) = 91780 , Ft
> F(0101 ,3 ,6) ,回归方程显著。对各方程项进行显著性检
验可知 :各方程项均显著。根据回归方程求出 Y 的最
优组合为 : X1 = 0150 , X2 = 0110 , X3 = 0110 ,在此组合基
础上求得最优解 : y = 9516 ,按公式 Y = y ±uα·s 计算
出优化值区间估计为 Y = 9516 ( ±4172) ,即 90188～
100132。
用试 验 得 到 的 优 化 值 62BA 0150mgΠL +
NAA 0110mgΠL + IAA 0110mgΠL 进行验证优化值试验。
将含有胚性细胞复合体的胚性愈伤组织切割成适当的
小块转接到附加 62BA 0150mgΠL、NAA 0110mgΠL 和
IAA 0110mgΠL的LS 培养基上进行体胚发育及萌发培
养 ,胚性细胞复合体在此组合的培养基上培养 20d 后
开始呈现出明显的发育状态 ,由黄绿色逐渐转为翠绿
色 ,继续培养至 40d 后 ,有绿色芽锥出现并伴有芽苗产
生 (图 12c) 。通过电镜观察确定 :绿色锥体是胚性细胞 复合体表面球形胚发育产生的盾形胚 (图 22e) 和子叶胚 (图 22f) ,说明体胚开始转向植株萌发阶段。45d 后统计体胚萌发率 ,可达 100 % ,在估计区间范围内 ,且比所有试验 Y值都大。因此 ,日本臭菘体细胞胚发育及萌发的最佳培养基为 :LS + 62BA 0150mgΠL + NAA0110mgΠL + IAA 0110mgΠL。将胚性愈伤组织表面产生的小芽锥剥离 ,转接到LS + 62BA 0150mgΠL + NAA 0110mgΠL + IAA 0110mgΠL培养基中继续培养 20d 后 ,小芽锥全部发育成完整的植株 (图 12d) 。通过电镜观察证实了锥形体为子叶胚(图 22f) 。3 　讨论植物离体培养的外部条件影响着体胚的发生和发育。本试验对影响体胚发生过程的植物生长调节剂因素进行了研究。关于体胚诱导的外植体因素 ,在其他植物上已有较多研究 ,大多数植物只有处于一定发育阶段的某些器官的外植体才易于诱导形成胚性细胞复合体[10 ] 。本研究结果表明 ,日本臭菘幼叶较适宜胚性愈伤组织及胚性细胞复合体诱导。体胚发生不同阶段所需植物生长调节剂种类和浓度存在差异 ,较低浓度的 IAA、较高浓度的 2 ,42D 和一定浓度的 62BA 在日本
88 核　农　学　报 23 卷
臭菘胚性愈伤组织诱导阶段是必需的 ,但添加过高浓
度的 2 ,42D 会使外植体迅速黄化导致细胞死亡 ,不能
形成胚性愈伤组织。原因可能是高浓度 2 ,42D 会诱导
外植体生成乙烯等气体 ,加速外植体的衰老。添加 62
BA 有利于外植体保持较高的活性 ,同时还影响体胚的
发育进程 ,体胚发育培养基中添加适当浓度的 62BA ,
一方面消除胚性愈伤组织中 2 ,42D 的影响 ,另一方面
保持胚性愈伤组织的活性 , 促使体胚进一步发
育[11～13 ] 。体胚发生过程的扫描电镜观察表明 ,日本臭
菘体细胞胚胎发生过程具有和合子胚发生相似的阶
段 ,胚性愈伤组织及胚性细胞复合体形成后 ,继续发育
经历球形胚、盾形胚、子叶胚等发育阶段。研究中发现
球形胚形成后与其周围组织之间产生了结构上的隔
离 ,这正是体细胞胚胎发生的先决条件。球形胚形成
后 ,两极同时发育 ,呈现明显的两极性 ;且每个体细胞
胚最终都能萌发成完整的植株 ,具有相对的独立性。
这两个特征是区分器官发生和体胚发生的标志。植株
再生体系的建立可将胚性愈伤组织表面产生的小芽锥
剥离下来 ,再转接到体胚发生培养基上继续培养使体
胚发育成完整的植株 ,这可能是胚性愈伤组织表面产
生的具有两极性的小芽锥在此培养基上得到了进一步
发育。日本臭菘体胚发生的形态学和超微结构观察表
明 ,本研究初步建立了相对稳定的日本臭菘体细胞胚
胎发生体系 ,为进一步完善体胚发生调控体系和阐明
体胚发生发育机理提供了基础。
致谢 :在试验研究和数据处理过程中 ,得到通化师范学
院生物系顾地周老师的大力支持和帮助 ,谨此致谢。
参考文献 :
[ 1 ] 　周　繇. 长白山区野生珍稀濒危药用植物资源评价体系的初步
研究[J ] . 西北植物学报 ,2006 ,26 (3) :599～605
[ 2 ] 　Kuehnle A R , Sugii N. Callus induction and plantlet regeneration in
tissue cultures of Hawaiian anthuriums[J ] . HortScience ,1991 , 26 (7) :
919～921
[ 3 ] 　范国强 ,翟晓巧 ,马新业 ,黎 明. 两种基因型泡桐体细胞胚胎发
生及植株再生[J ] . 核农学报 ,2005 , (4) :274～278
[ 4 ] 　Adelheid R ,Kuehnle , Fure2Chyi Chen ,Nellie S. Somatic embryogenesis
and plant regeneration in Anthurium andraeanum [ J ] . Plant Cell
Reports ,1992 ,11 (9) :438～442
[ 5 ] 　Al2Ramamneh E , Serek M , Sriskandarajah S. Plant regeneration via
somatic embryogenesis in Schlumbergera truncate[J ] . Plant Cell Tiss Org
Cult ,2006 , 84 :333～342
[ 6 ] 　朱海军 ,俞红强 ,义鸣放. 蓝刺头组织培养和叶片再生植株的研
究[J ] . 核农学报 ,2007 , (6) :581～584
[ 7 ] 　施　茜 ,孙振元 ,卢　琦. 梭梭 ( Haloxylon ammodendron) 愈伤组织
诱导及植株再生[J ] . 核农学报 ,2005 , (6) :441～444
[ 8 ] 　顾地周 ,孙忠林 ,何晓燕 , 张秋菊 ,朱俊义. 牛皮杜鹃的组培快繁
及种质试管保存技术[J ] . 园艺学报 ,2008 ,35 (4) :603～606
[ 9 ] 　方开泰. 均匀设计2数论方法在试验设计的应用[J ] . 应用数学学
报 , 1980 ,3 (4) :363～372
[10 ] 　王清连 ,王　敏 ,师海荣. 植物生长调节剂对棉花体细胞胚胎发
生的诱导及调节作用[J ] . 生物技术通讯 ,2004 ,15 (6) :577～579
[11 ] 　袁　澍 ,贾勇炯 ,林宏辉. 诱导植物体细胞胚发生的几个生理因
素[J ] . 植物生理学通讯 ,2003 ,39 (5) :508～512
[12 ] 　钱永强 ,孙振元 ,韦善君 ,李 　云 ,韩 　蕾. 中华结缕草成熟胚再
生影响因素研究[J ] . 核农学报 ,2005 , (6) :436～440
[13 ] 　冯大领 ,孟祥书 ,王艳辉 ,刘 　霞 ,李 　明 ,赵 　锦 ,白志英. 植物
生长调节剂在植物体细胞胚发生中的应用[J ] . 核农学报 ,2007 ,
(3) :256～260
(上接第 79 页)
[18 ] 　Chou C H , Chiou S J . Autointoxication mechanism of Oryza sativa. II.
Effects of culture treatments on the chemical nature of paddy soil and on
rice productivity. J Chem Ecol , 1979 , 5 :839～859
[19 ] 　Ben2Hammouda M , Ghorbal M H , Kremer R J , Oueslati O. Autotoxicity
of barley [J ] . J Plant Nutri , 2002 , 25 :1155～1161
[20 ] 　Waller G R. Allelopathic compounds in soil from no tillage vs
conventional tillage in wheat production [J ] . Plant Soil , 1987 , 98 :5～15
[ 21 ] 　Young C C , Thorne R L Z , Waller G R. Phytotoxic potential of soil and
wheat straw in rice rotation cropping systems of subtropical Taiwan [J ] .
Plant Soil , 1989 , 120 :95～101
[22 ] 　Young C C. Autointoxication in root exudates of Asparagus officinalis L.
[J ] . Plant Soil , 1984 , 82 :247～253
[23 ] 　Yu J Q , Sen S , Ya Q , et al . Autotoxic potential of cucurbit crops [J ] .
Plant Soil , 2000 , 223 :147～151
[24 ] 　曹潘荣 , 骆世明. 茶树的自毒作用研究[J ] . 广东茶叶 , 1996 , 02 :
9～11
[25 ] 　Founden L , Lea P J . Herbivores their interaction with secondary plant
metabolite [M] . New York : Academic Press , 1979 , 135～160
[26 ] 　Bong2Seop K. Effect of pine allelochemicals on selected species in
KoreaΠΠIn : Rizvi S J H , Rizvi , V. ( Eds. ) . Allelopathy : Basic and
Applied Aspects [M] . Chapman & Hall , London , 1992 , 204～241
[27 ] 　Rice E L. Allelopathy [M] . USA : Academic Press , 1984
[28 ] 　赵　鑫 , 詹立平 , 邹学忠. 牡丹组织培养研究进展[J ] . 核农学
报 , 2007 , 21 (2) : 156～159
98Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2009 ,23 (1) :85～89