全 文 ：核 农 学 报 2010，24(3):482 ～ 489
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
文章编号:1000-8551(2010)03-0482-08
构建番茄红素 β /ε环化酶基因 RNAi植物
表达载体及其表达分析
马 超 何 娟 郝青南 王 蕾 鲁晓燕 马兵钢
(石河子大学农学院园艺系，新疆 石河子 832003)
摘 要:根据 GenBank 中 Lyc-β 基因 (X86452)及 Lyc-ε 基因 (Y14387)设计引物，通过高保真 PCR 从番
茄 cDNA 中克隆到两段长度为 302 和 330bp 的 Lyc-β 基因片段和两段长度为 302 和 288bp 的 Lyc-ε 基因
片段。从质粒 pCAMBIA-2301 (AF234316)克隆出 gusA 基因长度为 168 和 235bp 的 2 个内含子片段。
根据 RNAi 原理将正、反向序列与内含子连接，之后插入启动子与终止子之间构建成 4 组植物表达载
体。利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草植株，通过 PCR 鉴定共获得 107 株转基因植株。利用荧光定量
PCR 分析干扰效果，结果显示经 4 组干扰载体干扰后，转基因植株中目的基因 mRNA 含量分别为对照
的 3. 4%、16. 4%、15. 2%和 21. 8%。进一步用 HPLC 对应分析转化株的番茄红素含量，结果表明转基
因植株中番茄红素平均增长量分别为 3. 4、2. 1、3. 4 和 2. 0μg / g。同时测定转基因植株中的 β-胡萝卜素
与叶黄素含量，发现它们根据干扰的基因不同呈现对应的变化。
关键词:番茄红素;β-胡萝卜素;叶黄素;番茄红素 β /ε 环化酶;RNAi
CONSTRUCTION OF RNAI PLANT EXPRESSION VECTORS FOR INTERFERING
LYCOPENE CYCLASE-β /ε GENES AND ITS EXPRESSION ANALYSIS
MA Chao HE Juan HAO Qing-nan WANG Lei LU Xiao-Yan MA Bing-gang
(Agricultural College，Shihezi University，Shihezi，xinjiang 832003，China)
Abstract:According to the Lyc-β gene (X86452)and Lyc-ε gene (Y14387)sequences published in the GenBank，four
pairs of primers were designed to amplify the fragments of 302 and 330 bp (Lyc-β gene)，302 and 288 bp (Lyc-ε gene)
from tomato cDNA. The gusA gene intron sequences of 168 and 235 bp were cloned from the plasmid pCAMBIA-2301
(AF234316). Four plant expression vectors interfering Lyc-β and Lyc-ε genes were constructed by ligation the intron
fragments of gusA gene within two target gene fragments，which were designed in opposite direction. The transformed
tobacco plants were identified by PCR，and a total of 107 transgenic plants were obtained. The interference effects were
analyzed by real time PCR，and the results showed that the target genic relative abundance in the transgenic plants were
3. 4%，16. 4%，15. 2% and 21. 8% respectively compared with wild type plants. Further analysis of the pigment
content in transgene plants showed that the average accumulating rate of lycopene content in transgenic plants were 3. 4，
2. 1，3. 4，2. 0μg / g，respectively. The β-carotene and lutein contents in transgenic plants had the corresponding
change.
Key words:Lycopene;β-carotene;lutein;lycopene β /ε-cyclase;RNAi
收稿日期:2009-10-12 接受日期:2009-12-29
基金项目:国家自然科学基金项目 (30460081)，新疆兵团博士资金项目 (ZD2007JC06)
作者简介:马 超 (1983-)，男，山东聊城人，硕士，从事园艺植物分子育种研究。E-mail:MCHJ111@ 163. com
通讯作者:马兵钢 (1972-)，男，湖北黄岗人，博士，教授，主要从事园艺植物分子育种研究。E-mail:binggang@ hotmail. com
284
3 期 构建番茄红素 β /ε 环化酶基因 RNAi 植物表达载体及其表达分析
番茄红素(lycopene)是一种天然植物色素，是许
多类胡 萝 卜 素 生 物 合 成 的 中 间 体。 20 世 纪 初
Schunck［1］从番茄中提取出一种色素，这种色素与从胡
萝卜中提取的胡萝卜素具有不同的吸收光谱，将其命
名为番茄红素。在类胡萝卜素合成途径中八氢番茄红
素在脱氢酶作用下，依次脱氢生成六氢番茄红素、链孢
红素，最后脱氢生成番茄红素。番茄红素 β /ε 环化酶
(LYC-β /ε)是类胡萝卜素合成途径中重要的酶，番茄
红素在它们的作用下分两条支路发生环化作用，分别
生成 β-胡萝卜素、α-胡萝卜素，之后经过多个反应形
成结构更复杂的脱落酸、叶黄素等［2］。通过正向调控
手段提高类胡萝卜素的含量是一种常见的办法。
Ronen 等［3］在对类胡萝卜素合成途径的研究中发现，
增加植株中 Lyc-β 基因的表达可以有效增加番茄果实
中 β-胡萝卜素的含量，同时番茄红素的含量有所下
降。Aluru 等［4］通过八氢番茄红素合成酶及类胡萝卜
素脱氢酶的过表达，发现在转基因玉米中类胡萝卜素
总量提高了 34 倍，而且 β-胡萝卜素优先在玉米的胚
乳中积累。利用反向调控手段来提高植物中类胡萝卜
素含量目前已有一些报道，主要是通过反义基因或
RNA 干扰的手段来达到反向调控的目的。目前在多
种植物中已经有一些关于 RNA 干扰的研究，如拟南
芥［5］、烟草［6］、马铃薯［7］、大豆［8］、水稻［9］、玉米［10］等。
本试验希望通过 siRNA 干扰的方法控制 Lyc-β、Lyc-ε
基因的表达，利用实时 PCR、HPLC 的手段全面检测转
基因植株中多种色素的变化关系，最终达到调控植物
中类胡萝卜素含量的目的。
1 材料与方法
1. 1 材料
番茄(Solanum lycopersicum Mill. Cv. Leeger 87-
5)、烟草(Nicotiana tabacum L. cv. Samsun-NN)由本
实验室培养保存。
质粒 pCAMBIA-2301、pUBI (含 Ubiquitin 基因)为
本实验室保存，表达载体 p2300 － 121 (含 P35s-gusA-
Tnos 串 联 系 列) 由 本 实 验 室 构 建。大 肠 杆 菌
(Escherichia coli)菌株为 XL1，农杆菌 (Agrobacterium
tumefaciems)菌株为 EHA105。引物由上海生工生物
工程技术服务有限公司合成。番茄红素、β-胡萝卜素、
叶黄 素 标 准 品 购 自 Sigma 公 司 (Sigma-Aldrich，
L9879、C9750、X6250)。C18 柱:Agilent 4. 6 × 150mm，
5μm。二氯甲烷、乙腈、甲醇、异丙醇购自 Honeywell
Burdick＆Jackson 公司，其他常规试剂采用国产分析
纯。
1. 2 方法
1. 2. 1 Lyc-β、Lyc-ε 基因目的片段及 gusA 基因内含
子片段的克隆 根据 Genbank 中番茄 Lyc-β 基因
(X86452)、Lyc-ε 基因 (Y14387)的保守序列设计引
物 扩 增 干 扰 片 段，根 据 质 粒 pCAMBIA-2301
(AF234316)序列设计引物扩增 gusA 基因第 1 个内含
子序列 (表 1)。
表 1 Lyc-β、Lyc-ε和 gusA 基因扩增引物序列及加入的酶切位点
Table 1 The primers and its additional restriction enzyme cutting site for cloning the Lyc-β，Lyc-ε and gusA fragments
引物
primer name
位置
site
序列(5′ － 3′)
primer sequence(5′ － 3′)
X1-S 480 － 99 (X86452) TT CTCGAGCTATGGTGTTTGGGTGGATG
X1-AS 757 － 81 (X86452) TAGAGAAGCCAGTTGCATCGAGCAC
X2-S 1007 － 25 (X86452) TT CTCGAGCATCACTCGTAGCTCGTC
X2-AS 1319 － 37 (X86452) TAGGCCACAAATCTTTCC
GusA1-S 21 － 42 (AF234316) CC GGATCCATTTCTAGTTTTTCTCCTTCAT
GusA1-AS 167 － 88 (AF234316) TT AGATCTATCATAGACACACGAAATAAAG
Y1-S 347 － 64(Y14387) AA CTCGAGTCCTGCTGGTCTTGCTCT
Y1-AS 631 － 48(Y14387) CAATCCTATCCACTTTCG
Y2-S 1151 － 68(Y14387) TT CTCGAGTCCAGCCACAGGTTATTC
Y2-AS 1421 － 39(Y14387) TCCAGCCACAGGTTATTC
GusA2-S 11605 － 22 (AF234316) ATTTGGAGAGAACACGGG
GusA2-AS 190 － 207 (AF234316) TCTGTAACTATCATCATC
UBI-S 92 － 111 (EU294350) CAGATCTTCGTCAAAACCCT
UBI-AS 263 － 282 (EU294350) GACTCCTTCTGGATGTTGTA
注:下划线表示酶切位点。
Note:The underline indicats the enzyme cutting sites.
384
核 农 学 报 24 卷
用生长健壮的番茄植株的幼叶为材料，提取总
RNA (总 RNA 提取试剂盒，上海生工，SK1322)，用
oligdT(18)引物合成 cDNA 第 1 链 (MMLV 逆转录试
剂盒，上海生工，K1622)。Pfu PCR (高保真 PCR 试剂
盒，上海生工，BS295)，PCR 扩增在 Mycycler 扩增仪
(BIORAD)进行。 PCR 反应条件为 94℃ 预变性
5min;94℃变性 45s，59℃ (X1-S，X1-AS) / 52℃ (X2-
S，X2-AS) / 52℃ (Y1-S，Y1-AS) / 55℃ (Y2-S，Y2-
AS)退火 45s，72℃延伸 30s，30 个循环;最后 72℃延
伸 7min。PCR 产物在 1. 0 % 的琼脂糖凝胶上电泳分
析。用凝胶回收试剂盒 (百泰克，CAT#DP1501)回
收 PCR 产物，之后对该 PCR 产物加尾 (PCR 产物加尾
试剂盒，上海生工，BS513)插入上海生工生产的
pUCm-T 载体，转化大肠杆菌 XL1，获得质粒 pLYC-X1、
pLYC-X2、pLYC-Y1、pLYC-Y2，由上海生工测序鉴定。
gusA 基因内含子片段的扩增方法同上。扩增条
件为:94℃预变性 3min;94℃变性 1min，57℃ (GusA1-
S，GusA1-AS) / 50℃ (GusA2-S，GusA2-AS)退火 45s，
72℃延伸 30s，30 个循环;最后 72℃延伸 7min。产物
回收、克隆步骤同前。获得质粒 pGusA1 和 pGusA2，由
上海生工测序鉴定。
1. 2. 2 RNAi 表达载体的构建 用 SalⅠ、BamHⅠ
(TaKaRa)双酶切质粒 pLYC-X1，切胶回收 3100bp 左
右的大片段。同时，用 BamHⅠ和 XhoⅠ双酶切质粒
pLYC-X1，回收 302bp 的小片段。连接大小片段，构建
成不含内含子的 2 个正反向连接的重组载体质粒
p2LYC-X1。之后用 BamHⅠ酶切质粒 p2LYC-X1，电
泳回收 3700bp 左右的大片段。将该片段与用 BglⅡ酶
切 pGusA1 回收得到的 168bp 的内含子小片段连接，
构建成 Lyc-β 基因中间克隆载体 pRNAi-X1。用 Hind
Ⅲ酶切 pRNAi-X1，经灭活、补平、沉淀。再用 SacⅠ酶
切，电泳回收 900bp 左右的小片段。将该片段与用
SmaⅠ和 SacⅠ酶切 p2300 － 121 质粒回收的 10000bp
左右的大片段连接构成植物表达载体 p2300-121-X1
(图 1)。并用冷冻法将其转入农杆菌 EHA105 中。
经过以上步骤获得含有质粒 p2300-121-X1 的农
杆菌，可以用于植物转化。其他干扰载体的构建过程
与 p2300-121-X1 一致，但在针对 ε 支路构建干扰载体
时内含子为引物 GusA2-S 、GusA2-AS 扩增出 gusA 基
因的第一个内含子的全序列。这样一共获得 4 组干扰
载体，分 别 为:p2300-121-X1、p2300-121-X2、p2300-
121-Y1、p2300-121-Y2。
图 1 植物 RNA 干扰表达载体模式图
Fig. 1 The diagram of plant RNAi vector
1. 3 测定分析
1. 3. 1 烟草的遗传转化 烟草的转化参考《植物基
因工程》中叶盘法［11］并结合何道一等［12］方法稍做改
动进行。
1. 3. 2 转基因植株的 PCR 鉴定 用 CTAB 法分别提
取野生烟草和抗性植株总 DNA，针对 35s 启动子序列
设计 PCR 检测引物:35S-s:5′-AGGCTTACGCAGCAG-
GTC-3′，35S-as:5′-GCAGAGGCATCTTCAACG-3′。PCR
反应体系为 20μl:2μl 10 × PCR buffer，1. 2μl MgCl2
(25mmol /L)，0. 4μl dNTP (10mmol /L)，上、下游引
物各 1μl(20 mmol /L)，模板 DNA 1μl(100 ng /μl)，Taq
DNA Polymerase 0. 2μl (5U /μl)，ddH2O 补足到 20μl;
反应条件为 94℃预变性 5min;94℃变性 45s，56℃退火
45s，72℃延伸 1min，30 个循环;最后 72℃延伸 7min。
产物利用 1%琼脂糖凝胶电泳进行结果分析。
1. 3. 3 Real time PCR 分析 提取转基因植株叶片总
RNA，紫外分光光度计 (Lab Tech，UV1100)定量 2μg
RNA 用于逆转录反应(MMLV 逆转录试剂盒，上海生
工，K1622)。实时 PCR 反应在 Mx3000sp 荧光定量
PCR 仪 (Strategen)上进行。利用荧光定量 PCR 试剂
盒 (SYBR  Green Real time PCR Master Mix，
TOYOBO)分析 Lyc-β 与 Lyc-ε 基因被干扰后的表达
量。分别用 pLYC-X1、pLYC-X2，pLYC-Y1、pLYC-Y2、
pUBI 质粒稀释成 102、103、104、105、106、107 个拷贝数
作标准曲线。荧光定量 PCR 扩增 20μl 体系包含:
10μl SYBR Green Real time PCR Master Mix，上、下游
引物各 0. 4μl (10mmol /L)，模板 cDNA 1μl，ddH2O
8. 2μl。PCR 反应条件为:94℃预变性 30s;94℃ 变性
5s，59℃ (X1-S，X1-AS) / 52℃ (X2-S，X2-AS) / 52℃
(Y1-S，Y1-AS)/ 55℃ (Y2-S，Y2-AS)/ 55℃ (UBI-S，
UBI-AS)退火 5s，72℃ 延伸 20s，循环 40 次后，94℃
1min，52℃ 30s 后 0. 01℃ / s 收集荧光信号，做溶解曲
线。计算 Ct 值代入标准曲线计算基因的拷贝数，用于
相对定量分析。
484
3 期 构建番茄红素 β /ε 环化酶基因 RNAi 植物表达载体及其表达分析
1. 3. 4 高效液相色谱鉴定 取生长良好的转基因植
株叶片 1g，用有机溶剂提取法提取番茄红素［13］。利用
超声波辅助提取法同时提取 β-胡萝卜素与叶黄素［14］。
将 1mg 番茄红素、β-胡萝卜素及叶黄素标准品分别用
流动相溶解后，依次稀释成 20、10、2、1 和 0. 2μg /ml 5
个浓度梯度，用于绘制标准曲线。用 Agilent 1100 高
效液相色谱仪测量色素浓度。番茄红素测定以二氯甲
烷、乙腈、甲醇 (2∶ 7 ∶ 7)混合液为流动相，β-胡萝卜素
与叶黄素测定以乙腈、二氯甲烷、异丙醇 (8 ∶ 1 ∶ 1)混
合液为流动相。在 C-18 硅胶柱 (Agilent )进行恒速
洗脱。流速控制在 1ml /min，柱温 25℃。进样量 10μl，
检测波长分别为 472nm (番茄红素)、450nm (β-胡萝
卜素与叶黄素)。番茄红素洗脱时间为 30min，β-胡萝
卜素与叶黄素洗脱时间为 20min。所有操作避光进
行。番茄红素、β-胡萝卜素、叶黄素含量通过外标法计
算。
2 结果和分析
2. 1 RNAi 植物表达载体的构建
根据所设计的引物从番茄基因组中分别获得了
302 和 288bp 的 Lyc-β 基因的片段及 302 和 330bp 的
Lyc-ε 基因片段;同时从 pCAMBIA-2301 载体中的 gusA
基因中分离了 gusA 基因第 1 个内含子 168bp 的部分
片段和其全长 235bp。利用 PCR 扩增筛选阳性克隆，
利用酶切筛选插入片段的方向，送上海生工测序，结果
表明扩增片段与 GenBank 中所发表序列的同源率
100%。获 得 质 粒 pLYC-X1、pLYC-X2、pLYC-Y1、
pLYC-Y2 和 pGusA1、pGusA2。
利用酶切位点控制片段方向实现正反向 LYC 片
段的链接，之后再在中间插入内含子序列。在针对
Lyc-β 基因构建载体时插入 gusA 基因内含子部分序
列，而针对 Lyc-ε 基因构建载体时插入 gusA 基因全长
内含子序列。最后将干扰片段插入植物表达载体
p2300-121 中，构建得到含有 P35S-RNAi-Tnos 序列的
植物表达载体 (图 1)，分别命名为 p2300-121-X1、
p2300-121-X2、p2300-121-Y1、p2300-121-Y2。
2. 2 转基因植株的分析
2. 2. 1 转化烟草抗性苗的 PCR 筛选 通过 Kan 抗性
筛选，4 组干扰载体共获得 129 株转化再生烟草植株。
提取其 DNA 进行 PCR 检测，其中 107 株扩增出预期
的片段 (图 2)。经 PCR 鉴定为转基因的植株经炼苗
后，移载到室外让其自然生长。
2. 2. 2 RNAi 干扰效果的荧光定量 PCR 分析 试验
图 2 转基因烟草 PCR 鉴定
Fig. 2 PCR screening of part of transgenic
tobacco plants
1:2300 － 121 质粒(阳性对照);2 ～ 9:转基因烟草植株;
10;野生烟草(阴性对照);M:GeneRulerTM DNA ladder mix
1:positive control;2 ～ 9:transgenic tobacco plants;10:negative control
以 ubi 基因作为内参基因来消除不同样品在逆转录过
程中所产生的误差。分别用 pLYC-X1、pLYC-X2、
pLYC-Y1、pLYC-Y2、pUBI 做标准曲线，标准物的 Ct 值
与拷贝数呈直线相关。从经过 PCR 鉴定的转基因烟
草中选 80 株 (每组干扰载体转化获得的转基因植株
选 20 株)进行实时定量 PCR 分析。以野生烟草为对
照分别检测目的基因及内参基因的 Ct 值，通过 Ct 值
分别代入各自的标准曲线得到相应的拷贝数，再换算
为浓度。用内参基因浓度比目的基因浓度得到一个比
值来消除逆转录误差。最后用样品的这个比值与野生
烟草的比值相比较，发现 80 株转基因烟草目的基因
mRNA 量远小于野生植株，干扰现象明显。在对 Lyc-β
基因进行干扰时，由干扰质粒 p2300-121-X1 转化的植
株 mRNA 含量为对照植株的 0. 53% ～ 15. 2%，干扰后
平均含量为 3. 4%。在由干扰质粒 p2300-121-X2 转化
的植株 mRNA 含量为对照植株的 0. 15% ～ 95%，干扰
后平均含量 16. 4% (图 3-A，B)。相对而言，干扰质粒
p2300-121-X1 导入植物后，干扰效果更为明显，目标
序列的降解幅度更大。在对 Lyc-ε 基因进行干扰时，
由干扰质粒 p2300-121-Y1 转化的植株 mRNA 含量为
对照植株的 1. 74% ～ 58. 5%，干扰后平均含量为
15. 2%。由 干 扰 质 粒 p2300-121-Y2 转 化 的 植 株
mRNA 含量为对照植株的 1. 16% ～ 71. 7%，干扰后平
均含量 21. 8% (图 3-C、D)。相对而言，在 4 组干扰载
体中 p2300-121-X1 导入植物后，干扰效果更为明显，
目标 mRNA 的降解幅度最大。
2. 2. 3 转基因植株番茄红素、β-胡萝卜素、叶黄素含
量的分析 从经过实时 PCR 鉴定的 80 株转基因烟草
中，在每组干扰载体得到的转基因植株中各自取干扰
效果最明显的 10 株，进行番茄红素、β-胡萝卜素、叶黄
素含量测定。番茄红素、β-胡萝卜素、叶黄素标准品的
584
核 农 学 报 24 卷
出峰时间分别为 25、20. 4 和 2. 9min，并通过番茄红
素、β-胡萝卜素、叶黄素标准品稀释后的相应浓度做标
准曲线 (图 4)。
图 3 转基因植株目的基因 mRNA 相对含量实时 PCR 分析
Fig. 3 The real-time PCR of the target gene mRNA relative abundance in transgene lines
A，B:p2300-121-X1，p2300-121-X2 载体转化植株 Lyc-β 基因 mRNA 相对含量;
C，D:p2300-121-Y1，p2300-121-Y2 载体转化植株 Lyc-ε 基因 mRNA 相对含量
A，B:The Lyc-β gene relative abundance in the p2300-121-X1 and p2300-121-X2 vectors transgenetic plant;
C，D:The Lyc-ε gene relative abundance in the p2300-121-Y1 and p2300-121-Y2 vectors transgenetic plant
图 4 番茄红素(A)、β-胡萝卜素(B)、叶黄素的标准曲线(C)
Fig. 4 The standard curve of Lycopene(A)，β-carotene(B)and lutein(C)
根据标准曲线，通过各色素 HPLC 得出的峰面积，
计算转化株及对照植株叶片中各色素含量。以每 g 叶
片中所含有的色素量为纵坐标，以野生植株及转基因
植株为横坐标绘制坐标图 (图 5)。由图 5 可以看出，
经 4 组干扰载体转化得到的转基因植株叶片内的番茄
红素含量都有所增加，同时根据被干扰基因的不同，发
现它们的下游物质呈现对应的变化趋势。
在对 Lyc-β 基因进行干扰时，由 p2300-121-X1 载
体干扰得到的转化株具有较高的番茄红素含量，干扰
后 番 茄 红 素 平 均 增 长 3. 4μg / g，最 多 可 增 长
14. 24μg / g。同时 β-胡萝卜素与叶黄素都有不同程度
的降低，其中 β-胡萝卜素平均含量为对照的 61. 2%，
叶黄素平均含量为对照的 32. 1%。由 p2300-121-X2
载体干扰得到的转化株中番茄红素平均增长 2. 1μg /
g，最多可增长 3. 05μg / g。β-胡萝卜素与叶黄素也呈
现下降趋势，β-胡萝卜素平均含量降低为对照的
66. 5%，叶黄素平均含量降低为对照的 40. 5%。
在对 Lyc-ε 基因进行干扰时，由 p2300-121-Y1 载
体干扰得到的转化株具有较高的番茄红素含量，干扰
后番茄红素平均增长 3. 4μg / g，最多可增长 10. 87
684
3 期 构建番茄红素 β /ε 环化酶基因 RNAi 植物表达载体及其表达分析
μg / g。β-胡萝卜素的含量有一定程度的增加，平均增
长 1. 7 倍;而叶黄素的含量明显下降，为对照含量的
19. 7%。由 p2300-121-Y2 载体干扰得到的转化株番
茄红素含量平均增长 2. 0μg / g，β-胡萝卜素的含量增
长 1. 6 倍;叶黄素含量降低为对照含量的 32. 0%。
综合而言，p2300-121-X1 干扰载体的干扰效果最
好，即利用干扰载体 p2300-121-X1 对 Lyc-β 基因进行
干扰时植株内番茄红素的含量提高最大，下游物质的
变化也大。这与实时 PCR 检测的结果吻合。
图 5 p2300-121-X1(A)、p2300-121-X2(B)、p2300-121-Y1(C)、p2300-121-Y2(D)载体转化植株的 HPLC 分析
Fig. 5 The HPLC analysis of the p2300-121-X1(A)，p2300-121-X2(B)，p2300-121-Y1(C)，
p2300-121-Y2(D)vector transgenetic plant
3 讨论
RNA 干扰是 20 世纪 90 年代被人们发现的一种
生物新技术，它具有高度的特异性，只引起与 dsRNA
同源的 mRNA 的降解，经体内 Dcier 酶切割得到 21 ～
23nt 的小干扰片段中，改变 1 个核苷酸就可以使该
siRNA 序列不对靶向 mRNA 起作用［15］。朱剑等［16］认
为载体介导的 RNAi，小的干扰片段可很好的引起沉默
效应，300bp 左右干扰效果好。李小平等［17］认为干扰
片段中的内含子应为全长序列，内含子边界序列在形
成发夹 RNA 结构及产生 RNA 干扰起重要作用。本试
验采用 300bp 的干扰片段，同时设计了包含边界序列
与不包含边界序列 2 种内含子，构建成干扰载体。实
时 PCR 鉴定的结果显示，4 组干扰载体对目的基因都
有很高的干扰效果。插入不包含边界序列的内含子片
段构建的干扰载体，经转化得到的转基因植株中目的
基因 mRNA 含量为对照的 9. 9%;而以插入全部内含
子序列构建的干扰载体，经转化得到的转基因植株中
目的基因 mRNA 含量为对照的 18. 5%。由试验结果
可看出，由不包含边界序列的内含子序列设计得到的
干扰载体也具有很高的干扰效果，目标序列的降解幅
度甚至超过插入全序列内含子的干扰片段，初步判断
内含子边界序列在干扰载体发挥干扰作用中不起决定
性作用。
植物类胡萝卜素合成途径是重要的色素合成途
径。在类胡萝卜素合成途径中八氢番茄红素合成酶
(PSY)及八氢番茄红素脱氢酶 (PDS)是番茄红素合
成的关键酶，许多学者对其进行过表达来调控下游代
谢产物的含量。Fraser 等［18］通过 PSY 的过表达，使番
茄植株内的八氢番茄红素、番茄红素、类胡萝卜素、叶
黄素的含量都有不同程度的增加。但是有报道表明过
表达可能引起植株矮化、叶片形态变化等不良反
应［19］。而 Diretto 等［20］通过研究诱导型启动子控制
Psy，Pds，Lyc-β 3 个基因的过表达，成功克服了叶片畸
形现象，并且使转基因马铃薯中的类胡萝卜素与对照
相比提高了 20 倍。在番茄中，Rosati 等［21］通过过表达
Lyc-β 基因，发现转基因植株中番茄红素的含量增长了
2 倍。在类胡萝卜素合成途径中 Lyc-β 和 Lyc-ε 基因
都可以使番茄红素发生环化作用，分别形成 β-胡萝卜
784
核 农 学 报 24 卷
素和 α-胡萝卜素。通过反义基因或 RNAi 手段来控制
他们的表达可以有效提高番茄红素的含量。万群
等［22，23］构建了 Psy 基因过表达载体与 Lyc-β 基因
RNAi 表达载体，希望从 2 个方向作用来提高番茄红素
含量，经研究发现在果实特异性启动子作用下对 Lyc-β
基因进行干扰，经分光光度计测定转基因植株中番茄
红素的含量有一定提高。Diretto 等［24，25］在马铃薯中
对类胡萝卜素合成途径做了连续研究，首先沉默了
Lyc-ε 基因，发现转基因植株中 β-胡萝卜素增长了 14
倍，总的类胡萝卜素增长了 2. 5 倍;接着在 Lyc-ε 基因
沉默的植株中同时沉默 β-胡萝卜素氢化酶 (HYD)基
因，发现 β-胡萝卜素与总类胡萝卜素含量进一步增
长，分别增长 38 倍和 4. 5 倍。
通过过表达的手段提高类胡萝卜素途径中相关物
质的含量虽然有一定效果，能够提高多个下游物质的
总量，但无法使某一物质的含量得到大大提高，还可能
产生叶片畸形等不良影响。因此，本试验希望运用
RNA 干扰的手段阻断类胡萝卜素合成途径中番茄红
素下游的番茄红素 β /ε 环化酶基因的表达来调控番
茄红素含量，同时测定下游物质 β-胡萝卜素与叶黄素
的含量。从实时 PCR 的结果可以看出，4 组干扰载体
对目的基因都有很高的干扰效果，转基因植株中目的
基因的 mRNA 含量仅分别为对照的 3. 4%、16. 4%、
15. 2%和 21. 8%。HPLC 结果显示，4 组转基因植株
中番茄红素含量有一定的增长，平均分别增加 3. 4、
2. 1、3. 4 和 2. 0μg / g。在类胡萝卜素生物合成途径中，
番茄红素可以在 LYC-β 酶和 LYC-ε 酶的作用下发生
环化作用，在番茄红素分解的 2 条支路中都有 LYC-β
酶在发挥作用，而 LYC-ε 酶只存在于叶黄素合成的支
路中(首先生成 δ-胡萝卜素、α-胡萝卜素等，最终生成
叶黄素)，因此当 Lyc-β 基因被干扰时两条支路的下游
产物 β-胡萝卜素与叶黄素都有一定程度的下降;而当
Lyc-ε 基因被干扰时下游产物叶黄素明显下降，处于另
一条支路中的 β-胡萝卜素的含量却有所增长。β-胡
萝卜素含量的增长可能因为一条支路的阻遏导致上游
物质只能通过另一条路径进行代谢作用，使得该条支
路中的物质 (β-胡萝卜素)含量有所增加。这一点也
可以解释当 Lyc-β 或 Lyc-ε 基因受到很大程度的干扰
时(mRNA 大量降解)，其上游物质 (番茄红素)的增
长量却没有达到如此大的程度。
4 结论
试验利用 RNAi 的方法分别针对 Lyc-β 和 Lyc-ε 基
因构建 4 组干扰载体，分别转化烟草获得转基因植株。
实时 PCR 鉴定的结果显示 4 组干扰载体对目的基因
具有明显的降解效果，其中 p2300-121-X1 针对 Lyc-β
基因具有较好的干扰效果，p2300-121-Y1 载体对 Lyc-ε
基因具有较好的干扰效果。利用 HPLC 检测烟草植株
中被干扰基因的相关产物含量，发现被干扰基因的上
下游物质含量均有变化，对 Lyc-β 和 Lyc-ε 基因的干扰
均可增加转基因烟草植株中番茄红素的含量。进一步
的试验将利用番茄红素 β-环化酶干扰载体 (效果较
好的 p2300-121-X1 载体)与番茄红素 ε-环化酶基因
的干扰载体 (效果较好的 p2300-121-Y1 载体)，共同
转化番茄，分析利用高效干扰载体同时阻断番茄红素
下游两条代谢支路后对番茄红素积累的影响，以期获
得高番茄红素含量的番茄植株。
参考文献:
［1 ］ Schunck C A. Different properties of lycopene and caroteniod［J］.
Proc Roy Soc，1903，72(1):165 － 168
［2 ］ 胡继军 .番茄红素的提取生产研究［D］. 南京工业大学，2006
［3 ］ Ronen G，Carmel-Goren L，Zamir D，Hirschberq J. An alternative
pathway to beta-carotene formation in plant chromoplasts discovered
by map-based cloning of beta andold-gold color mutations in tomato
［J］. Proc Natl Acad Sci USA，2000，97(20):11102 － 11107
［4 ］ Aluru M，Xu Y，Guo R，Wang Z，Li S S，White W，Wang K，
Rodermel S. Generation of transgenic maize with enhanced
provitamin A content［J］. J Exp Bot，2008，59(13):3551 － 3562
［5 ］ Axtell M J，Jan C，Rajagopalan R，Bartel D P A. A two-hit trigger
for siRNA biogenesis in plants ［J］. Cell，2006，127(3):565 －
577
［6 ］ Jutta E，Ina S T，Hardy S，Sophia S，Engelbert W，Judith S. RNA
interference-mediated repression of cell wall invertase impairs
defense in source leaves of tobacco ［J］. Plant Physiology，2008，
147(7):1288 － 1299
［7 ］ Olga S，Marcal S，Carolin H，Vincent S，Franck P，Rchus F，
Lukas S，Salome′ P，Marisa M，Merce’ F. CYP86A33-targeted
gene silencing in potato tuber alters suberin composition，distorts
suberin lamellae，and impairs the periderm’s water barrier function
［J］. Plant Physiology，2009，149(2):1050 － 1060
［8 ］ Subramanian S， Graham M Y， Yu O， Graham T L. RNA
interference of soybean isoflavone synthase genes leads to silencing in
tissues distal to the transformation site and enhanced susceptibility to
phytophthora sojae［J］. Plant Physiol，2005，137(4):1345 －
1353
［9 ］ Miki D，Itoh R，Shimamoto K. RNA silencing of single and multiple
members in a gene family of rice ［J］. Plant Physiol，2005，138
(4):1903 － 1913
［10］ McGinnis K，Murphy N，Carlson A R，Akula A，Akula C，Basinger
H，Carlson M，Hermanson P，Kovacevic N，McGill M A，Seshadri
V，Yoyokie J，Cone K，Kaeppler H F，Kaeppler S M，Springer N
884
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2010，24(3):482 ～ 489
M. Assessing the efficiency of RNA interference for maize functional
genomics［J］. Plant Physiol，2007，143(4):1441 － 1451
［11］ 王关林，方宏筠 . 植物基因工程(第二版) ［M］. 北京:科学出
版社，2002:397 － 400
［12］ 何道一，段培树，陈丽萍 . RPW2 表达载体构建及对烟草的遗传
转化［J］. 核农学报，2009，23(4):602 － 605
［13］ 李 敏 . 番茄红素提取及纯化的研究［D］. 新疆农业大学，2007
［14］ 刘国道，王东劲，侯冠彧，郑学勤 . 海南热带植物叶黄素和 β-
胡萝卜素含量分析［J］. 草地学报，2006，14(2):134 － 137
［15］ 马 超，郝青南，马兵钢 . RNA 干扰在植物中的作用机理及其应
用研究进展［J］. 西北植物学报，2008，28(9):1920 － 1927
［16］ 朱 剑，余 潮，朱友林 . RNA 沉默技术及其在植物中的应用
［J］. 遗传，2007，29(1):22 － 28
［17］ 李小平，邓 楠，马媛媛，李鹏丽，王 勇，张 韧，王宁宁 .
大豆类受体蛋白激酶基因(rlpk2)RNAi 双元表达载体的构建及
其转基因［J］. 分子细胞生物学报，2006，39(1):1 － 8
［18］ Fraser P D，Romer S，Shipton C A，Mills P B，Kiano J W，Misawa
N，Drake R G，Schuch W，Bramley P M. Evaluation of transgenic
tomato plants expressing an additional phytoene synthase in a fruit-
specific manner［J］. Plant Biology，2002，99(2):1092 － 1097
［19］ Busch M，Seuter A，Hain R. Functional analysis of the early steps
of carotenoid biosynthesis in tobacco［J］. Plant Physiol，2002，128
(2):439 － 453
［20］ Diretto G， Al-Babill S， Tavazza R， Papacchioli V， Beyer P，
Giuliano G. Metabolic engineering of potato carotenoid content
through tuber-specific overexpression of a bacterialmini-pathway
［J］. PLOS ONE，2007，2:e350
［21］ Rosati C， Aquilani R， Dharmapuri S， Pallara P，Marusic C，
Tavazza R， Bouvier F， Camara B， Giuliano G. Metabolic
engineering of beta-carotene and lycopene content in tomato fruit
［J］. Plant Journal，2000，24(3):413 － 419
［22］ 万 群，张兴国，宋 明 . 果实特异性 RNAi 介导的 Lcy 基因沉
默来增加番茄中番茄红素的含量［J］. 生物工程学报，2007，23
(3):429 － 433
［23］ 万 群，张兴国，宋 明，苏承刚 . 加强 Psy 基因表达和通过
RNAi抑制 Lcy 基因表达的载体构建［J］. 农业生物技术学报，
2007，15(3):477 － 481
［24］ Diretto G， Tavazza R，Welsch R， Pizzichini D，Mourques F，
Papacchioil V， Bever P， Giuliano G. Metabolic engineering of
potato tuber carotenoids through tuber-specific silencing of lycopene
epsilon cyclase［J］. BMC Plant Biology，2006，6(13):1 － 11
［25］ Diretto G，Welsch R，Tavazza R，Mourques F，Pizzichini D，Bever
P，Giuliano G. Silencing of beta-carotene hydroxylase increases total
carotenoid and beta-carotene levels in potato tubers［J］. BMC Plant
Biology，2007(11)，7:1 － 8
(责任编辑 王媛媛
櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀
)
(上接第 465 页)
［9 ］ 王世恒，祝水金，张 雅，王艳芳 . 航天搭载茄子种子对其 SP1
生物学特性和 SOD 活性的影响［J］. 核农学报，2004，18(4):
307 － 310
［10］ 洪香娇，高旭春，张东萍，邹桂花 . 航天茄子育种的选育初报
［J］. 现代园艺，2007，3:11
［11］ 鹿金颖，刘 敏，薛 淮，潘 毅，张纯花，Galina S Nechitailo. 俄罗
斯和平号空间站搭载的番茄随机扩增多态性 DNA 分析［J］.
航天医学与医学工程，2005，18(1):72 － 74
［12］ 张 健，李金国，王培生，王小琴，蒋兴村 . 粳稻品种秋光空间诱
变突变体的微卫星分析［J］. 西北植物学报，2003，23(9):1550
－ 1555
［13］ 宋美珍，喻树迅，范术丽，武晓军，原日红 . 棉花航天诱变的农
艺性状变化及突变体的多态性分析［J］. 中国农业科技导报，
2007，9(2):30 － 37
［14］ 周桂元，洪彦彬，林坤耀，李少雄，梁炫强 . 花生空间诱变及 SSR
标记遗传多态性分析［J］. 中国油料作物学报，2007，29(3):
238 － 241
(责任编辑 王媛媛)
984