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GC/MC Analysis of Volatile Oil of Perrilla frutenscens L. and Evaluation of Its Inhibiting Ability to Bacteria

紫苏挥发油化学成分GC/MS分析及抑菌评价研究



全 文 :文章编号 :100028551 (2009) 032477205
紫苏挥发油化学成分 GCΠMS 分析及抑菌评价研究
林 硕 邵 平 马 新 孙培龙
(浙江工业大学生物与环境学院 ,浙江 杭州 310014)
摘  要 :采用水蒸汽蒸馏法分别提取紫苏叶和花中挥发油 ,运用毛细管气相色谱2质谱联用法结合计算机
检索对其挥发油进行化学成分分析 ,采用面积归一法测定了挥发油中各种成分的相对质量分数 ,利用抑
菌贴片法、MIC法和光电浊度法分别对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌进行了抑菌性研究。结果显示 ,从紫苏
叶和花水蒸汽蒸馏所得挥发油中分别检测出 12 种和 10 种化合物 ,其中叶中主要成分为紫苏醛
(75188 %) 、柠檬烯 (3182 %) 、石竹烯 (9187 %) 和法呢烯 (3121 %) ;花中主要成分为紫苏醛 (49123 %) 、石
竹烯 (18153 %) 、法呢烯 (8199 %) 、芳樟醇 (1113 %)和姜黄二酮 (4155 %) 。紫苏精油对两种细菌均有很强
的抑制作用 ,但对枯草芽孢杆菌的抑制能力要明显强于对大肠杆菌的抑制能力。
关键词 :紫苏挥发油 ; 水蒸汽蒸馏 ; GCΠMS 分析 ;抑菌能力
GCΠMS ANALYSIS OF VOLATILE OIL OF Perrilla frutenscens L.
AND EVALUATION OF ITS INHIBITING ABILITY TO BACTERIA
LIN Shuo  SHAO Ping  MA Xin  SUN Pei2long
( College of Biological and Environmental Engineering , Zhejiang University of Technology , Hangzhou , Zhejinag  310014)
Abstract :The constituents of essential oils extracted with steam distillation from leaves and flowers of Perrilla f rutenscens L.
were analyzed by GCΠMS technique and their relative concentration was acquired with the methods of area normalization. The
inhibiting ability to bacteria of the oils was also studied with a gram2positive bacteria Bacillus subtilis and a gram2negtive
bacteria Escherichia coli as the objects by disc diffusion method , MIC and scattered light turbidity method. The results showed
that 12 and 10 compounds were identified respectively from the leaves and flowers , and the main components from the leaves
were perillaldehyde ( 75188 %) , limonene ( 3182 %) , caiyophilene ( 9187 %) , and farnesene ( 3121 %) ; the main
components from the flowers were perillaldehyde ( 49123 %) , caiyophilene ( 18153 %) , farnesene ( 8199 %) , linalool
(1113 %) , curdione (4155 %) . Moreover , the essential oils showed strong inhibiting activity against both bacteria , but
having higher ability against Bacillus subtilis than that against Escherichia coli .
Key words : Perrilla f rutenscens L. ; essential oil ;steam distillation ; GCΠMS analysis ;antibacterial ability
收稿日期 :2008210227  接受日期 :2008212218
作者简介 :林硕 (19832) ,男 ,浙江仙居人 ,硕士研究生 ,主要从事食品加工方面研究。
通讯作者 :孙培龙 (19642) ,男 ,浙江龙游人 ,博士 ,教授 ,主要从事食品资源高效利用研究。E2mail : sun
-
pl @zjut . edu. cn
  紫苏 ( Perilla f rutescens L. ) ,又称桂荏、赤苏、白苏、
回回苏、香苏等 ,属于唇形科紫苏属一年生草本植物 ,
主要分布在东南亚 ,在我国华北、华中、华南、西南及台
湾都有野生和栽培种种植历史的悠久。紫苏的茎、叶、
种子和果实等含有多种对人类非常有价值的生物活性
物质 ,尤其是紫苏叶 ,因其特有的香气和营养成分 ,被
用作中药材和海鲜烹饪的佐料。紫苏茎叶中所含的活
性物质具有非常好的抗氧化活性和抗过敏活性[1~5 ] 。
紫苏精油 ,又称紫苏挥发油 ,是紫苏香气成分经过
蒸馏冷凝之后形成的重要混合物 ,多见于紫苏茎、叶和
花之中 ,含量一般为 0155 %~0158 % ,主要含有紫苏
醛、柠檬烯等成分 ,其中含量最高的一般为紫苏醛。紫
774 核 农 学 报 2009 ,23 (3) :477~481Journal of Nuclear Agricultural Sciences
苏醛可以用来制造甜味剂 ,其甜度约为蔗糖的 2000
倍 ,紫苏精油中的其他物质还可以用作各种食品配料。
研究表明 ,芳香植物精油组分中具有众多的强抑菌物
质 ,可用于治疗细菌感染病症。如百里香 ( thymus
vulgaris) 中的百里香酚、香芹酚、石竹烯 ; 薰衣草
(lavandula officinalis)中的香叶醇、薰衣草醇、芳樟醇等 ,
已有不少国家将芳香精油运用在疾病治疗、保健美容
上。在紫苏精油抗菌防腐性能研究方面 , Gisho 发现 ,
紫苏精油中的紫苏醛和柠檬烯有协同抑制细菌生长的
作用[7 ] ; Kang 等采用蒸馏法用甲醇提取紫苏茎叶精
油 ,发现其中的紫苏醛与蓼二醛对多种细菌有协同抑
制的作用[8 ] 。但是对干紫苏叶和花挥发油成分的 GCΠ
MS 分析比较及抑菌评价研究还鲜见报道。
水蒸汽蒸馏法设备简易 ,操作简便 ,是目前常用的
精油蒸馏方法。香料与水构成精油与水的互不相溶体
系加热时 ,随着温度的增高精油和水均要加快蒸发 ,产
生混合体蒸气 ,其蒸气经锅顶鹅颈导入冷凝器中得到
水与精油的液体混合物 ,经过油水分离后即可得到精
油产品。本试验采用水蒸汽蒸馏法分别提取紫苏叶和
花中挥发油 ,运用毛细管气相色谱2质谱联用法结合计
算机检索对挥发油进行化学成分分析 ,采用面积归一
法测定了挥发油中各种成分的相对质量分数 ,利用抑
菌贴片法、MIC法和光电浊度法分别对枯草芽孢杆菌
和大肠杆菌进行了抑菌性研究 ,为区分紫苏叶与花香
气在感官上的差异提供了科学依据 ,对紫苏叶的表观
抑菌作用提供科学指导。
1  材料与方法
111  材料和仪器
紫苏叶、花于 2007 年 9 月采自浙江江山。大肠杆
菌和枯草芽孢杆菌由浙江工业大学微生物实验室提
供。所用仪器有 Finnigan Trace DSQ 型气相色谱2质谱
计算机联用仪 (美国 Thermo 公司产品) ,自制的水蒸汽
蒸馏装置 (处理量为 20~30g) ;自制的挥发油提取装
置。所用试剂无水硫酸钠、正己烷均为分析纯。所用
培养基包括营养肉汤培养基和营养琼脂培养基[9 ] 。
112  精油的 GCΠMS 分析
11211  挥发油提取  将鲜紫苏叶与紫苏花洗净 ,于室
温下晾干 ,粉碎后过 013mm 孔径筛。分别取花和叶粉
末 20100g ,置于蒸馏用 500ml 三口烧瓶中 ,加水 300ml ,
浸泡 115h 后加入少量沸石 ,连续缓慢蒸馏 5h。蒸馏结
束后 ,取蒸馏所得芳香水 ,用 20ml 正己烷连续萃取 2
次 ,合并萃取液 ,用无水硫酸钠干燥过夜。用针筒小心
吸取过夜后的正己烷溶液 ,进行有机膜抽滤 ,得到约
35ml 左右的待测液体 ,此液体均一透明 ,除具有正己
烷气味外 ,分别具有明显的紫苏叶花香气。
11212  提取物分析  用 GCΠMS 分析提取的紫苏挥发
成分正己烷溶液 ,将气相色谱分离的每个组分的质谱
和计算机系统储存的已知物质的质谱进行比较。色谱
条件 :BP25 毛细管色谱柱 ;载气为氦气 ,流速为 1mlΠ
min ;柱温 : 80 ℃保持 3min , 5 ℃Πmin 升到 110 ℃保持
10min , 2 ℃Πmin 至 160 ℃保持 20min ,再以 5 ℃Πmin 升温
至 220 ℃保持 10min。进样口温度 :250 ℃;传输线温度 :
250 ℃。进样方式 : 1μl 不分流进样。质谱条件 : EI 电
离方式 , 离子源温度 : 220 ℃, 质谱扫描范围 : 50 ~
550mΠz ,电子倍增电压 :1972mV。
113  精油抗菌试验
11311  菌种活化及灭菌处理  将大肠杆菌和枯草芽
孢杆菌冷藏菌种分别接入 5 支营养琼脂斜面培养基活
化 ,37 ℃培养 24h。斜面上菌种长出后于 4 ℃冰箱中保
存备用。培养皿、三角瓶、试管、培养基、直径 019cm 的
自制滤纸片、移液枪头、稀释用蒸馏水等均在 120 ℃下
湿热高压灭菌 20min。
11312  紫苏叶挥发油定性抗菌试验  采用抑菌贴片
法 ,将活化后的菌种接入营养肉汤培养基 ,37 ℃摇床培
养 24h。同时制作营养琼脂平板。将培养所得的菌悬
液按 10 - 5到 10 - 1倍浓度梯度用无菌蒸馏水进行稀释 ,
各梯度的稀释液各取 100μl 均匀涂抹到培养平板中。
每平板加入 3~4 片滤纸片 (酌情加减) ,在滤纸片上分
别滴加紫苏精油 5μl ,每平板留 1 滤纸片作为空白对
照 ,所有平板放在 37 ℃培养箱中培养 24h 后进行观察
记录。抗菌圈试验判定标准 :抗菌圈直径大于 20mm
为极敏感 ;15~20mm 为高敏感 ;10~15 mm ,为中敏感 ;
7~9mm 为低敏感 ;小于 7mm 为不敏感[10 ] 。
11313  紫苏叶挥发油最低抗菌浓度的测定  将紫苏
叶精油在营养肉汤培养基中设置 6 个浓度梯度 :011、
012、014 、016、018 和 110μlΠml。因为精油与水不相混
溶 ,所以选用无水乙醇作为介质 ,其与精油的体积比
为 :精油∶乙醇为 5∶95。因为乙醇本身就具备一定的
抑菌能力 ,所以还进行了乙醇最低抑菌浓度的试验 ,发
现乙醇在 0102mlΠL 时抑菌效力不明显。因此 ,在每个
50ml 的营养肉汤药品培养基内 ,乙醇使用量控制在
0199 ~0109ml 之间。每个浓度梯度设置 2 个重复和 1
个空白对照以及 1 个酒精对照 ,37 ℃下摇床培养 24h。
培养结束后明显混浊的摇瓶证明已有菌生长 ,对于透
明的摇瓶则进行涂布和平板计数的研究。
11314  紫苏叶精油抑制细菌生长曲线的测定  采用
874 核 农 学 报 23 卷
光电浊度法 ,在细菌生长过程中 ,每隔一定时间测定菌
液在 560nm 下的吸光度 ,即可通过菌悬液的吸光度来
反映细菌在当前的生长情况 ,以评估精油的总体抑菌
效果。根据 11313 试验的结果 ,选取 015μlΠml 的精油
浓度 ,于 37 ℃摇床下培养 24h ,期间每隔 2h 进行一次
原菌悬液和抑制剂菌悬液的吸光度测定 ,记录数据并
绘制细菌的生长曲线及细菌在精油作用下的抑制生长
曲线。
2  结果与分析
211  紫苏叶、花的成分比较
紫苏花与叶由 GCΠMS 分离鉴定所得气相色谱总
离子流图见图 1 和图 2。紫苏花与叶由 GCΠMS 分离鉴
定出的挥发性成分比较见表 1。
图 1  紫苏叶香气成分气相色谱总离子流图
Fig. 1  Total ion chromatogram of aromatic components of leaves from Perrilla f rutenscens
图 2  紫苏花香气成分气相色谱总离子流图
Fig. 2  Total ion chromatogram of aromatic components of flowers from Perrilla f rutenscens
  比较图 1、图 2 可知 ,紫苏花、叶香气成分的气相
色谱总离子流图在 6161、11140、19100、21142、23137、
24180 和 29190min 这几个保留时间段左右同时出峰 ;
紫苏叶总离子流图在保留时间 5116、8189 、24146、
29165min 左右单独出峰 ,而紫苏花总离子流图则在保
留时间 11121 、37197min 左右有单独的物质峰出现。
212  紫苏叶精油抑菌试验分析结果
21211  抑菌贴片试验  紫苏精油抑菌贴片试验所得
培养基抑菌圈照片见图 3 和图 4。由图 3 和图 4 可以
看出 ,紫苏叶精油的定性抗菌试验结果表明 ,紫苏叶精
油对所选 2 种典型菌种均有较好的抗性。枯草芽孢杆
菌抑菌圈直径为 2818 ±018mm ,大肠杆菌抑菌圈直径
为 2410 ±114mm ,对枯草芽孢杆菌的抗性较强 ,对大肠
杆菌的抗性稍弱。而在 2 种菌的空白对照滤纸片周
围 ,没有检测到抑菌圈。
图 3  紫苏挥发油对枯草芽孢杆菌形成的抑菌圈
Fig. 3  Zones of growth inhibition for Bacillus subtilis
974 3 期 紫苏挥发油化学成分 GCΠMS分析及抑菌评价研究
表 1  紫苏花与叶由 GCΠMS分离鉴定出的挥发性成分比较
Table 1  Comparison of components and relative contents
of essential oils extracted from the leave and
flowers of Perrilla f rutenscens by GCΠMS method
化合物
compounds
保留时间
remaining
time (min)
相对分子质量
molecular
mass(Da)
相对百分含量
relative percentage ( %)
叶 leaves 花 flowers
D2柠檬烯
D2lemonene 5116 136 3182 —
芳樟醇
linalool
6161 154 2101 1113 %
松油醇
terpineol
8189 154 014 —
12羟甲基24 异
丙烯基环己烷
trans2shisool 11121 154 — 1143 %
紫苏醛
perillaldehyde
11140 150 5188 % 49123 %
紫苏醇
perilla alcohol
12124 152 2108 % —
石竹烯
isocaryolphillene
19100 204 9187 % 18153 %
α2红没药烯
α2bisabolene 21142 204 0189 % 1155 %
α2荜澄茄烯
α2cubebene 23137 204 0149 % 2167 %
β2榄香烯
elenene
24146 204 0125 % —
β2法呢烯
farnesene
24180 204 3121 % 8199 %
斯巴醇
spathulenol
29165 220 0118 % —
石竹烯氧化物
Isocaryolphillene
epoxide
29190 220 0192 % 1176 %
姜黄二酮
neocurdione 37197 236 — 4155 %
图 4  紫苏挥发油对大肠杆菌形成的抑菌圈
Fig. 4  Zones of growth inhibition for Escherichia coli
21212  最低抑菌浓度试验 (MIC)  紫苏精油最低抑菌
浓度试验所得各菌种最低抑菌浓度值 (MIC 值) 见表
2。从表 2 中看出 ,紫苏叶精油对于枯草芽孢杆菌的抗
性较强 ,当达到 016μlΠml 时已没有菌落被检测出来 ,而
其在精油浓度为 112μlΠml 的摇瓶中有少量菌体长出 ,
考虑到 110、018、016μlΠml 的菌悬液中均无菌体长出 ,
可将其视为不可知原因导致的试验误差 ;而紫苏叶精
油对大肠杆菌的抗性稍弱 ,最低抑菌浓度为 018μlΠml。
所有空白对照和酒精对照中均出现明显的大量混浊 ,
可视为加入的精油助溶剂 ———酒精并没有产生任何的
抑菌效果 ,从而对试验结果的可信度没有产生影响。
表 2  紫苏叶精油对供试菌种的 MIC值
Table 2  Minimum inhibitory concentration (MIC)of
essential oils from Perilla Frutescense leaves
菌种
microorganism
精油浓度 concentration of essential oil (μlΠml)
112 110 018 016 014 012 011
大肠杆菌
E. coli
— — — + + + + + + + + + +
枯草芽孢杆菌
B . subtilis
+ — — — + + + + + + + +
注 : —表示无菌生长 , + 表示少量菌落生长 , + + 表示较多菌落生长但可
计数 , + + + 表示菌落无法计数。
Note : —means no microorganisms ; + means only a few microorganisms ; + +
means many microorganisms but countable ; + + + means a lot of microorganisms
and uncountable.
21213  紫苏挥发油抑制细菌生长曲线的试验  根据
微生物学的基本原理 ,细菌生长曲线一般可以分为 4
个阶段 :调整期、对数期、平稳期及衰落期。由以上结
果可以看出 ,紫苏叶精油的存在对于 2 种供试菌均有
不同程度的抑制作用。对枯草芽孢杆菌而言 ,在其生
长曲线中 ,并没有显示出其生长曲线的调整期 ,可能是
因为其调整期比较短 ,在开始检测的时候菌悬液已经
进入对数生长阶段所致 ,而在其抑制生长曲线中 ,因为
精油浓度已经接近其最低抑菌浓度 ,所以菌体生长异
常缓慢 ,其调整期明显延长 ,对数生长期并不明显甚至
可以说基本没有对数生长期 ,这与 MIC 试验的结果基
本一致 ;而对大肠杆菌而言 ,最初的 2~3h 可以视为其
微生物的生长调整期 ,菌体数量没有明显增加 ,而精油
的加入也没有对调整期的时长产生影响 ,进入对数生
长期以后 ,精油作为防腐剂的作用才体现出来 ,宏观上
表现为抑制生长曲线 ,宏观上因菌体数量的增大幅度
明显而不如原生长曲线 ,因为精油浓度比其最低抗菌
浓度要低一些 ,所以其抑制作用没有对枯草芽孢杆菌
那么明显。
3  结论与讨论
通过 GCΠMS 分析鉴定出的 14 个化合物中 ,紫苏
084 核 农 学 报 23 卷
图 5  紫苏叶精油对枯草芽孢杆菌的抑制生长曲线
Fig. 5  The growth of B . subtilis with the essential oil
图 6  紫苏叶精油对于大肠杆菌的抑制生长曲线
Fig. 6  The growth of E. coli with the essential oil
叶、花共有的成分有芳樟醇 (叶 2101 % ,花 1113 %) 、紫
苏醛 (叶 75188 % ,花 49123 %) 、石竹烯 (叶 9187 % ,花
18153 %) 、红没药烯 (叶 0189 % ,花 1155 %) 、α2荜澄茄
烯 (叶 0149 % , 花 2167 %) 、法呢烯 (叶 3121 % , 花
8199 %) 、石竹烯氧化物 (叶 0192 % ,花 1176 %)共 7 种 ;
紫苏叶特有的香气成分为 D2柠檬烯 (3182 %) 、松油醇
(014 %) 、紫苏醇 (2108 %) 、榄香烯 (0125 %) 和斯巴醇
(0118 %) ,共 5 种 ;紫苏花特有的香气成分有 2 种 :12羟
甲基24 异丙烯基环己烷 (trans2shisool ,1143 %) 和姜黄
二酮 (4155 %) 。
其中芳樟醇、紫苏醛、石竹烯、α2红没药烯、α2荜澄
茄烯、β2法呢烯各具独特香气 ,在很多篇研究中都有检
测到[11~14 ] ,是紫苏叶花香味的主要贡献物质。紫苏花
中的芳樟醇、石竹烯和β2法呢烯含量明显高于叶中同
样物质的含量 ,同时 ,紫苏花中还含有 2 种特有成分 :
trans2shisool 和姜黄二酮 ,这些物质都会对紫苏花香产
生影响。
通过一系列抑菌试验的鉴定 ,证明紫苏叶精油对
革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌
均有一定的抑制作用 ,其中对于革兰氏阳性菌枯草芽
孢杆菌的抑制作用较强 ,对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌
的最低抑菌浓度分别为 016 和 018μlΠml。
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