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EMS mutagenesis in vitro and screening of calli from strawberry leaves of resistance to Botrytis cinerea Pers

EMS离体诱变及抗草莓灰霉病愈伤组织的筛选



全 文 :文章编号 :100028551 (2009) 0120090205
EMS 离体诱变及抗草莓灰霉病愈伤组织的筛选
罗 静1 ,2 ,3  周厚成2  王永清3  赵 霞2
(11 重庆农科院果树研究所 ,重庆 402260 ; 21 中国农业科学院郑州果树研究所 ,河南 郑州 450009 ;
31 四川农业大学 ,四川 雅安 625014)
摘  要 :用甲基磺酸乙酯 ( EMS)处理草莓愈伤组织后通过草莓灰霉病病原毒素 (Toxin) 离体筛选获得抗病
愈伤组织并诱导成苗。EMS 诱变处理‘幸香’草莓离体叶片产生的愈伤组织 ,用经毒力检测的草莓灰霉
菌毒素粗提液进行离体筛选 ,通过在愈伤组织继代培养中附加不同浓度毒素粗提液 ,以确定适宜的抗病
选择压 ,获得抗灰霉病突变体材料。结果表明 ,将愈伤组织直接进行 EMS 处理的成活率高于将愈伤组
织切割成小块继代培养后再经 EMS 处理的愈伤组织 ;且 012 % EMS 处理 1h 为最佳选择。在含 80 %毒
素粗提液的培养基中培养 10 d 为抗性筛选的适宜选择压。诱变处理后的 867 块愈伤组织 ,在经不连续
二次筛选后有 195 块成活 ,成活率 2215 % ,其中有 82 块再生出了不定芽 ,再生率为 4211 %。不定芽经生
根后移栽至田间进一步进行抗性鉴定。
关键词 :草莓 ;甲基磺酸乙酯 ( EMS) ;诱变 ;离体筛选 ;抗灰霉病愈伤组织
EMS MUTAGENESIS in vitro AND SCREENING OF CALLI FROM STRAWBERRY LEAVES
OF RESISTANCE TO Botrytis chinerea Pers.
LUO Jing1 ,2 ,3  ZHOU Hou2cheng2  WANG Yong2qing3  ZHAO Xia2
(11 Fruit Research Institute , Chongqing Academy of Agricultural Sciences , Chongqing  400716 ;
21 Zhengzhou Fruit Research Institute , CAAS , Zhengzhou , Henan  450009 ;
31Sichuan Agricultural University , Ya’an , Sichuan  625014)
Abstract :Calli from leaves of strawberry ( Fragaria ananassa Duch. cv. Sachinoka) leaves were mutagenized in vitro by EMS
( Ethyl methyl sulfonate) and screened by toxin extracts after the toxicity testing of Botrytis cinerea Pers. on strawberry. The
results showed that the calli treated by EMS directly had higher survival rate than that of subcultured calli from small callus
pieces and treated by EMS. The appropriate treatment was 012 % EMS and for 1 hour , and the appropriate selection pressure
was that the callus pieces were cultured for 10 days in medium supplemented with 80 % of the toxic culture filtrate. There were
195 survival in 867 callus pieces after mutation and twice discontinuous screening the survival rate was 2215 % , and of which
82 were regenerated adventitious shoots , regeneration rate was 4211 %. Some of resistant calli produced shoots were cultured ,
rooted and then transferred to field to test the resistance to Botrytis cinerea Pers.
Key words :strawberry ;ethyl methyl sulfonate ( EMS) ;induced mutants ; in vitro selection ;mutation resistant callus to Botrytis
cinerea Pers.
收稿日期 :2008206224  接受日期 :2008208228
基金项目 :河南省科技攻关重点项目 (0423012100 ,08102330034) ,郑州市科技攻关项目 (064SGYN17192)
作者简介 :罗静 (19802) ,女 ,四川乐山人 ,硕士 ,研究方向为果树生物技术。E2mail :jillus07 @yahoo. com. cn
通讯作者 :周厚成 (19742) ,男 ,河南信阳人 ,在读博士生 ,助理研究员 ,研究方向为果树生理与生物技术。Tel :0371265330972 ; E2mail :hchzhou @163.
com
09  核 农 学 报 2009 ,23 (1) :90~94Journal of Nuclear Agricultural Sciences
  草莓灰霉病 ( Botrytis cinerea Pers. ) 是我国草莓产
区发现最早、发生最普遍、危害较严重的一种病害 ,设
施栽培更易发生此病 ,因此 ,选育抗病品种具有重要意
义。利用化学诱变处理并定向筛选出抗性品种在作物
品种改良上已得到广泛应用[1~10 ] 。利用 EMS 处理草
莓愈伤组织 ,并通过病原毒素 ( Toxin) 离体筛选抗病突
变体也是草莓抗病育种的途径之一[1~3 ] 。本研究通过
化学诱变剂甲基磺酸乙酯 ( Ethyl methyl sulfonate , EMS)
对草莓外植体进行离体诱变 ,用灰霉病菌毒素筛选出
抗灰霉病的草莓愈伤组织并进一步诱导成苗 ,为草莓
抗病育种探索一条简单可行的新途径 ,也为创造草莓
抗病新种质奠定基础。
1  材料与方法
111  供试材料与培养基
供试材料为‘幸香’草莓 ( Fragaria ananassa Duch.
cv. Sachinoka)试管苗叶片。
愈伤组织的诱导培养基为 MS + TDZ 410mgΠL +
NAA 011mgΠL [11 ,12 ] ;继代培养基 :MS + TDZ 210mgΠL +
NAA 011mgΠL ; Peberdy 培养基 :葡萄糖 10mgΠL ,柠檬酸
钠 3mgΠL , KH2 PO4 5mgΠL ,NH4NO3 2mgΠL ,MgSO4 ·7H2O
012mgΠL , CaCl2·2H2O 011mgΠL , 酵 母 膏 0125mgΠL ,
pH410 ;增殖培养基 :MS + BA 015mgΠL + IBA 011mgΠL。
112  方法
11211  草莓愈伤组织的诱导  采用文献 [ 11 ]的方法
诱导草莓叶片愈伤组织。
11212  3 种 EMS 诱变处理方式  将诱导形成的叶片
愈伤组织用 EMS 进行诱变处理。处理的愈伤组织分
为 3 种类型 : Ⅰ是接种 8 周后直接进行处理 ; Ⅱ是接种
8 周后切割成直径为 2mm 左右的小块 ,在继代培养基
中培养 1 周后进行处理 ; Ⅲ是接种 8 周后将愈伤组织
切割成小块 ,继代培养基中培养 2 周后进行处理。
11213  EMS 诱变处理方法  分别用浓度为 0105 %、
011 %、012 %、014 %和 018 %的 EMS 溶液 (磷酸缓冲液
配制)浸泡各类型愈伤组织 015、110 和 210h ,处理完后
用无菌水冲洗 6 遍 ,再接种于继代培养基中继续培养
15d ,调查愈伤组织成活率。
11214  灰霉菌素的提取和毒力检测  取草莓病果上
的灰霉菌菌丝体分离纯化 ,制成孢子悬液后按 1 %接
种量接种到 Peberdy 培养基中静置培养 20d ,三层纱布
过滤后取滤液进行高压灭菌 ,得毒素粗提液。以 Perdy
培养基为对照 ,将此毒素粗提液分别用 50 %、100 %浓
度浸泡愈伤组织 2h ,用 011 %台盼蓝 (trypan blue) 染液
染色观察细胞活力 ,确定毒素粗提液对愈伤组织的毒
力。以 Peberdy 培养基为对照 ,同时将 Peberdy 培养基、
灰霉菌孢子悬浮液与毒素粗提液分别进行田间接种观
察 ,接种方法为 :选择转色期的果实 ,分别用移液枪刺
伤并注入 2μl 不同处理液 ,将处理后果实进行套袋 ,1
周后统计其感病情况。
11215  抗性选择压的筛选  将毒素粗提液按照 10 %、
20 %、40 %和 80 %的浓度加入到再生培养基中 ,将接种
6 周的愈伤组织置于添加毒素粗提液的培养基中培
养 ,分别在 0、5、10、15 和 20d 测其鲜重 ,绘制生长曲
线 ,以愈伤组织相对生长量为 0 时的毒素浓度和培养
时间作为筛选抗病突变体的选择压[9 ] 。
11216  愈伤组织的抗性筛选和分化  将经过和未经
过 EMS 诱变处理的愈伤组织同时用 11215 确定的毒素
粗体液抗性选择压进行抗病性筛选。为提高筛选的可
靠性 ,将经过适宜选择压选择后的愈伤组织转入未添
加毒素的再生培养基中培养 10d 后 ,再添加浓度为
80 %的毒素粗提液进行第二次抗性筛选。将筛选出的
抗性愈伤组织转入再生培养基中诱导分化 ,分化出的
不定芽转入增殖培养基中增殖。
2  结果与分析
211  EMS 处理后愈伤组织的成活率
EMS诱变处理后 3 种类型的愈伤组织成活率见表
1。Ⅰ类愈伤组织经 EMS 处理后成活率高于 Ⅱ、Ⅲ类 ,
大多数愈伤组织保持绿色、致密的状态。经切割后愈
伤组织褐变严重 ,即使成活下来也褐化疏松 ,仅有少数
能重新长出白色的新愈伤组织。Ⅲ类愈伤组织成活率
虽然低于 Ⅰ类 ,但高于 Ⅱ类 ,说明机械损伤致使愈伤组
织对 EMS 的抵抗能力下降 ,但能在切割后的继代培养
中得到一定程度的恢复。
由表 1 可见 ,这 3 类愈伤组织在 EMS 浓度为
0105 %~014 % ,处理时间为 015 - 1h 时 ,存活率波动
较大 ,当剂量增大到 018 %处理 2h 时 ,存活率均在
40 %左右。随处理浓度和时间的增加 ,不同类型愈伤
组织的成活率均呈下降趋势。诱变过程中常以 EMS
的半致死剂量作为 EMS 处理的最适宜剂量[13 ,14 ] ,考虑
到实际试验中半致死剂量只能在成活率为 50 %左右
的范围内而无法精确确定 ,因此 ,就本试验而言 , Ⅰ类
愈伤组织以 012 %~014 % EMS 处理 1 - 2h 较为适宜 ,
Ⅱ类愈伤组织以 011 %~012 % EMS 处理 1h 较为适
宜 ,而 Ⅲ类愈伤组织则适合用 011 %~018 % EMS 处理
1h。综合考虑 ,确定 3 种类型愈伤组织 EMS 处理的适
19 1 期 EMS离体诱变及抗草莓灰霉病愈伤组织的筛选
宜选择为 012 %处理 1h。
表 1  愈伤组织经 EMS处理后的成活率
Table 1  The survival rate of callus after EMS treatment
( %)
愈伤组织
类型
callus types
处理时间
treatment
time (h)
EMS浓度 EMS concentration ( %)
0105 011 012 014 018
015 9612 8812 8412 7817 6218
Ⅰ 110 8913 8710 7219 6010 4419
210 8218 7716 6510 5913 4119
015 7414 6413 5711 5516 5513
Ⅱ 110 6513 5319 4911 4017 3819
210 4416 3611 3715 3313 3416
015 7915 6714 6411 6513 6718
Ⅲ 110 7411 5518 5415 4818 3912
210 5318 4411 4517 3914 3413 212  灰霉菌毒素毒力的检测从毒素粗提液处理后的愈伤组织细胞经台盼蓝染色观察可以看出 ,用 Perberdy 培养基浸泡的愈伤组织仅细胞团的外围细胞被染上蓝色 (图 12A) ,而 50 %、100 %粗提液浸泡后的愈伤组织细胞分别有约 50 %、90 %以上的细胞被染成蓝色 (图 12B、C) 。因为只有死亡的细胞才能被台盼蓝染成蓝色 ,而活的细胞则呈淡黄色 ,上述结果说明毒素粗提液在细胞水平上对草莓愈伤组织是有致死效果的。经过田间果实接种观察 ,各处理对草莓果实造成的感病情况表现出较大差异 (表 2) 。其中灰霉菌孢子悬浮液和毒素粗提液处理的果实均有一半以上感病 ,且后者处理的果实感病情况最为严重 ,说明毒素粗提
液具备对‘幸香’草莓果实较强的致病能力。
图 1  经不同浓度毒素粗提液浸泡后的愈伤组织细胞染色结果
Fig. 1  The stained calli cells after toxic culture filtrate treatment
A :Peberdy 培养基 ;B :50 %毒素粗提液 ;C :100 %毒素粗提液
A :Peberdy medium ;B :50 % toxic culture filtrate ; C :100 % toxic culture filtrate
表 2  ‘幸香’草莓果实经田间接种后的感病情况
Table 2  In vivo testing for the disease occurrence
on fruit after treatment with toxin
处理
treatment
接种果
实数 (个)
fruit
inoculated
感病数
(个)
fruit
susceptible
感病率
susceptibility
rate ( %)
病斑长度
speckle
length
灰霉菌孢子悬浮液
spore suspension
20 11 5510 + + +
粗提液
toxic culture filtrate
17 13 7615 + +
Peberdy 培养基
Peberdy medium
15 2 1313 +
注 : + + + :病斑长度≥1cm ; + + :病斑长度 (015~1cm) ; + :病斑长度 ≤
015cm
Note: + + + : Speckle length ≥1cm ; + + : Speckle length ( 015~1cm) ; + :
Speckle length ≤015cm
  通过对细胞染色和田间果实接种观察 ,证明毒素
粗提液无论在细胞水平还是植株水平都能对‘幸香’草
莓造成毒害 ,说明在发酵培养过程中灰霉菌体中的毒
素已充分释放到培养原液中 ,用此原液作为选择剂对
抗灰霉菌突变体进行离体筛选 ,是可行而可靠的。
213  抗性选择压的选择
由愈伤组织生长曲线可看出 (图 2) ,毒素粗提液
能充分抑制愈伤组织的生长 ,随浓度的增大 ,抑制效果
愈明显。毒素粗提液浓度小于 40 %的处理 ,在前 10d
的抑制效果不明显 ,10d 以后 ,各处理中的愈伤组织相
对生长量差异较大。从愈伤组织表观状态上看 ,第 10
天 ,20 %、40 %毒素处理的愈伤组织开始变褐 ,组织变
得松散 ,到第 20 天几乎完全褐化死亡 ,此后生长量几
乎没有增加。毒素粗提液浓度为 80 %的处理 ,第 5 -
10 天间愈伤组织重量只增加了 6 % ,细胞处于缓慢甚
至停止生长的状态 ,而从第 10 - 15 天 ,愈伤组织重量
反而减少了 5 % ,可能是此时细胞已经开始解体 ,内含
29 核 农 学 报 23 卷
物释放到培养基中 ,造成重量减轻。因此 ,80 %毒素粗
提液浓度处理 10d 可视为大部分细胞生长的一个拐
点 ,故在抗性突变体的筛选试验中使用含 80 %毒素粗
提液的培养基作为选择培养基。
图 2  不同浓度毒素处理对愈伤组织相对生长量的影响
Fig. 2  The callus fresh weight after treatment of
toxin in different concentrations
214  抗灰霉病愈伤组织筛选
经含 80 %毒素粗提液培养基两轮筛选后的愈伤
组织成活率和再生率见表 3。试验结果表明 ,经 EMS
不同浓度和不同时间处理后 ,经毒素粗提液筛选所产
生抗灰霉病愈伤组织的频率不具备规律性 ,这可能是
因为 EMS 对愈伤组织细胞诱变作用是随机发生的 ,但
是 Ⅰ类愈伤组织在抗病筛选过程中无论成活率和再生
率上都最高 , Ⅲ类愈伤组织在经筛选后的虽然成活率
高于 Ⅱ类愈伤组织 ,但再生率低于 Ⅱ类愈伤组织。
经诱变处理后的 867 块愈伤组织在抗灰霉病筛选
后有 195 块材料成活 ,成活率为 2215 % ,其中有 82 块
再生出了不定芽 ,再生率为 4211 %(表 3) ;而未经 EMS
处理的 85 块愈伤组织在用毒素粗提液经抗病筛选后
仅有 1 块成活 ,说明经 EMS 诱变处理过的植物细胞可
能发生了突变 ,并且部分抗灰霉病毒素粗提液的突变
基因得到表达 ,从而能在灰霉菌毒素粗提液的临界致
死浓度下生存下来。
表 3  愈伤组织经抗性筛选后的成活率和再生率
Table 3  Survival rate of calli after toxin screening and adventitious regeneration rate
愈伤组织类型
calli types
总愈伤块数
total No.
成活愈伤块数
survival No.
成活率
survival rate
( %)
平均成活率
mean survival
rate ( %)
再生愈伤块数
regeneration No.
再生率
regeneration
rate ( %)
平均再生率
mean regeneration
rate ( %)
Ⅰ 281 78 2718 40 5113
EMS 处理 EMS treatment Ⅱ 318 58 1812 2215 28 4813 4211
Ⅲ 268 59 2210 14 2317
Ⅰ 30 1 313 0 0
未经 EMS处理 control Ⅱ 28 0 0 112 0 0 0
Ⅲ 27 0 0 0 0
3  讨论
在诱变处理过程中 ,为使愈伤组织细胞能充分接
触到诱变剂 ,通常需要将诱导形成的愈伤组织团切割
成小块。本试验采用 3 种不同处理的愈伤组织材料 ,
虽然 Ⅰ类在处理后成活率较高 ,能得到较多材料 ,但很
可能在处理过程中材料并未完全地受到诱变剂的作
用 ,只是外围细胞发生了突变 ,在抗性选择时也有可能
由于材料内部的细胞未接触到选择剂 ,导致筛选出的
材料实际上并不具有抗性 ,增加了试验的不确定性。
Ⅱ、Ⅲ类愈伤组织经切割后能在一定程度上避免 Ⅰ类
材料存在的问题 ,但由于切割造成机械损伤很容易引
起褐变 ,导致愈伤组织自身成活率降低 ,影响突变筛选
的效率。黄俊生等[8 ]在对菠萝愈伤组织进行诱变处理
时认为 ,经切割后的愈伤组织继代培养时间 (5 - 30d)
越长 ,对 EMS 的抵抗能力就越强。本试验也证明了这
一点 ,如 Ⅲ类愈伤组织经处理后的成活率较高 ,但愈伤
组织继代培养时间过长会导致死亡或分化 ,所以本试
验愈伤组织继代时间最长只到两周。此外 EMS 还明
显降低了 Ⅲ类愈伤组织的分化率 ,但是朴铁夫等[15 ] 认
为在较低浓度下 ,EMS 能刺激愈伤组织的生长和植株
的分化。由于化学诱变剂是接触性作用试剂 ,主要靠
其活性基团引起 DNA 化学变化 ,更多在分子水平上作
用 ,形成点突变 ,对生物分子的影响是局部的和个别
的 ,因此引发的突变是偶然而不可控制的。本试验中 ,
经过诱变处理的愈伤组织材料 ,其对灰霉病的抗性突
变的发生不表现规律性。但是刘进平等[18 ] 利用 EMS
对胡椒无菌实生苗茎尖进行诱变处理后 ,发现随着
EMS 浓度和处理时间的增加 ,再生植株中具有抗病和
39 1 期 EMS离体诱变及抗草莓灰霉病愈伤组织的筛选
中抗水平的再生植株比率有显著提高。相反 ,随着
EMS浓度和处理时间的增加 ,材料的成活率相应降低。
因此在应用中 ,应通过试验来摸索不同材料诱变的半
致死剂量。EMS 对生物大分子诱变作用的具体机制 ,
还有待进一步研究。
朱宝成等指出灰霉菌在生长过程中向培养基中释
放了毒素 ,能使愈伤组织中毒死亡[17 ] ,周毓君等用灰
霉菌孢子悬液、培养滤液对草莓果实进行田间接种 ,结
果也表明灰霉菌对果实的致病力确由所产毒素引
起[18 ] 。本试验中 ,灰霉菌粗提液不仅提取简单 ,而且
效果明显 ,以灰霉菌毒素为筛选压力选育抗病突变体
的途径是可行的。
本研究中得到的抗性愈伤组织 ,在经过诱导分化
和继代扩繁后生长成苗 ,其在田间的具体抗性表现 ,还
有待进一步试验鉴定。
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简讯 :
中国核学会第七次会员代表大会在北京召开
中国核学会第七次会员代表大会于 2008 年 11 月 3 日至 5 日在北京国谊宾馆召开 ,出席大会的有来自下属
19 个分会的各地代表近 300 人。第六届理事会理事长王乃彦院士作了学会的工作报告、傅满昌秘书长作了学会
章程修改说明、财务工作报告等。会议选举产生了第七届理事会、常务理事会及理事长、副理事长和秘书长。第
七届理事会由 169 位理事组成 ;李冠兴当选为第七届理事会理事长 ;丁中智、孙汉虹、杨长利、邱爱慈、贺禹、康克
军、彭先觉、穆占英当选为第七届理事会副理事长 ,潘传红当选为第七届理事会秘书长。中国原子能农学会有三
位同志被选为理事 ,他们是徐步进、华跃进和王志东 ,其中徐步进为常务理事 ,华跃进被聘为学术工作委员会委
员 ,王志东同志再次被聘为学会工作委员会委员。大会对包括我原子能农学会高美须同志在内的 19 位来自核学
会专业分会和地方核学会的“优秀学会工作者”进行了表彰。(徐步进供稿)
49 Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2009 ,23 (1) :90~94