全 文 ：文章编号 :100028551 (2009) 042592205
60 Coγ辐照对霍山石斛悬浮培养原球茎
生长和生物碱积累的影响
洪萨丽　金　青　黄　蓓　蔡永萍　林　毅
(安徽农业大学生命科学学院 ,安徽 合肥　230036)
摘 　要 :以霍山石斛原球茎为材料 ,研究 5、10、20 和 30Gy 的60 Coγ辐照处理对原球茎悬浮培养生物碱积
累的影响。结果表明 ,60 Coγ辐照处理能提高悬浮培养原球茎生物碱含量 ,且适宜辐照剂量为 10Gy。
10Gy 处理的原球茎培养 36d 时 ,原球茎鲜重为 26154gΠ瓶 ,生物碱含量为 01035 % ,此时培养液 pH和原球
茎电导率变化较小 ,培养液环境适合原球茎继续培养 ;同时辐照处理可促进 POD、SOD、CAT和 PAL 酶活
性 ,抑制 PPO 酶活性 ,从而促进石斛原球茎生长和生物碱合成。
关键词 :60 Coγ辐照 ;霍山石斛 ;原球茎 ;生物量 ;生物碱
EFFECTS OF 60 Coγ2RAYS IRRADIATION ON CELL GROWTH AND AL KALOID ACCUMULATION OF
PROTOCORM2LIKE BODIES IN SUSPENSION CULTURES FROM Dendrobium huoshanense
HONG Sa2li 　J IN Qing 　HUANG Bei 　CAI Yong2ping 　Lin Yi
( School of Life Sciences , Anhui Agricultural University , Hefei , Anhui 　230036)
Abstract :Protocorm2like bodies (PLBs) in suspension cultures from Dendrobium huoshanense were irradiated by 60 Coγ2rays at
doses of 5 , 10 , 20 and 30Gy , and alkaloid accumulation of PLBs was studied. The results showed that 60 Coγ2rays irradiation
could improve the alkaloid content of PLBs , and the suitable dose was 10Gy. The fresh weight of 10Gy irradiated PLBs was
26154gΠflask , and the alkaloid content was 01035 % on the 36th day. The medium pH and electric conductivity of 10Gy
irradiated PLBs changed slightly during the suspension culture period. The results suggested such cultural environment was
suitable for PLBs growth continuely. Results also showed that 60 Coγ2rays irradiation could increase the activities of POD ,
SOD , CAT , PAL and decrease the activity of PPO , these were responsible for the improvement of cell growth and alkaloid
accumulation in PLBs.
Key words :60 Coγ2rays irradiation ; Dendrobium huoshanense ; protocorm2like bodies ; biomass ; alkaloid
收稿日期 :2009201203 　接受日期 :2009204213
基金项目 :安徽省教育厅重点项目 (2006KJ054A)及安徽省教育厅十五人才基金
作者简介 :洪萨丽 (19842) , 女 ,安徽宿州人 ,硕士 ,研究方向遗传生理。E2mail :sallyzhuhong @1631com
通讯作者 :蔡永萍 (19642) , 女 , 安徽太湖人 ,博士 ,教授 ,研究方向植物生物技术。E2mail :swkx12 @ahau. edu. cn　　石斛属 ( Dendrobium) 为兰科中的第二大属 ,全球大约有 l 500 种 ,我国有 76 种 ,主要分布在华南及西南地区[1 ] 。安徽省霍山境内野生石斛有 3 种 :霍山石斛D . huoshanense C NH1 Z Tang et S T Cheng (当地称米斛) 、铁皮石斛 D . candidum Wallex Lindl . 、铜皮石斛D . moniliforme (L. ) SW. ,其中霍山石斛为石斛中的上品 ,是重要的常用中药材 ,含有生物碱、多糖、抗癌菲、 类黄酮等多种化学成分 ,具有抗肿瘤、治疗白内障、清咽护嗓、增强机体免疫力、扩张血管及抗血小板凝集等作用[2 ] 。其成分生物碱还具清音明目、养胃清热、止痛、降低心率、血压、减慢呼吸 ,并可解巴比妥中毒等[3 ] 。自然生长条件下 ,石斛生境狭窄 ,只能生长在300～700m 的山区阴凉环境中 ,繁殖困难 ,从野生植物获取其有效成分十分困难。此外 ,生物碱的有机合成
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过程也十分复杂 ,且产率较低。
近年来 ,利用细胞培养技术生产生物碱为解决生
物碱药源短缺问题提供了一条有效途径。细胞培养的
关键是如何增加细胞生物量和次生代谢产物的含量。
利用合理的外界条件促进细胞生长 ,并利用合适的胁
迫条件使细胞从初生代谢转向次生代谢是提高次生代
谢产物含量的常用手段之一[4 ] 。自 l9 世纪发现天然
放射性物质以来 ,核辐射的生物学效应引起了人们极
大的关注 ,辐照技术应用的研究也取得了长足的进
展[5 ] ,将辐照技术与细胞培养技术相结合 ,增加细胞生
物量和次生代谢产物的含量 ,越来越受到重视[5 ,6 ] 。
霍山石斛悬浮培养原球茎周期较长 ,培养过程中 ,
原球茎易发生褐变 ,使细胞生长减缓[7 ,8 ] 。本试验通过
研究60 Coγ辐照对霍山石斛原球茎生长和生物碱合成
的影响 ,分析细胞中过氧化物酶、多酚氧化酶以及次生
代谢相关酶苯丙氨酸解氨酶的活性变化 ,为解决霍山
石斛原球茎增殖缓慢问题提供试验依据 ,为提高霍山
石斛悬浮培养原球茎的有效药用成分生物碱含量提供
新技术手段和技术参数。
1 　材料与方法
111 　试验材料
霍山石斛 ( D . huoshanense C. Z. Tang et S. T. Cheng)
取材于安徽省霍山县石斛基地 ,原球茎由安徽农业大
学生命科学学院石斛课题组诱导。
112 　材料处理
取实验室保存的、已继代 10 代、稳定培养 400d 后
(40dΠ代[9 ] )的生长疏松、淡黄色的原球茎接种于装有
40ml 改良的 1Π2MS 培养基 (1Π2MS + 0125mgΠL NAA +
0130mgΠL 62BA + 40gΠL 蔗糖) (1Π2MS 指大量元素减半)
的 100ml 三角烧瓶中 ,接种量均为 710gΠ瓶。在安徽农
业大学大杨店辐射中心 ,分别用 5、10、20 和 30Gy 剂量
辐照处理 ,以未辐照的原球茎为对照 ,辐照处理后 ,置
于漫射光条件下 ,恒温摇床培养 ,培养转速 120rΠmin ,
培养温度 (25 ±2) ℃,光强 2μmolΠ(m2·s) ,相对湿度 (60
±10) %。每个处理组 5 瓶 ,重复 3 次 ,共 15 瓶。综合
原球茎生长量和生物碱含量 ,确定适宜的辐照剂量。
再次取新鲜原球茎 (同前所述) ,用上述确定的适宜辐
照剂量处理后 ,培养一个生长周期 ,共 44d[9 ] ,以未辐
照的原球茎为对照 ,每 4d 随机取样一次 ,研究原球茎
生长量和生物碱积累的动态变化 ,每个处理组 15 瓶 ,
重复 3 次 ,共 45 瓶。
113 　指标测定
取样测定以上各种处理原球茎的生长量、生物碱
含量、苯丙氨酸解氨酶 (PAL) 、过氧化物酶 ( POD) 、超氧
化物歧化酶 ( SOD) 、过氧化氢酶 ( CAT) 、多酚氧化酶
(PPO)活性 ,以及培养液 pH、原球茎相对电导率。每处
理取 3 瓶测定 ,重复 3 次。适宜辐照剂量处理的原球
茎一个生长周期内 ,每 4d 随机取样一次 ,测定原球茎
生长量和生物碱含量 ,每次取 3 瓶 ,共取 12 次。
11311 　原球茎生长量测定 　取出原球茎 ,抽滤 ,称其
鲜重 (FW) ,随后将原球茎于 60 ℃下烘干至恒重 ,称取
干重 (DW) 。每处理称取 3 瓶 ,重复 3 次。
11312 　生物碱含量测定 　标准曲线的制作 :精确称取
石斛碱 1100mg ,加氯仿配成 100ml。分别取 015、110、
210、310、410、510、610、710ml 置分液漏斗中 ,加氯仿至
1010ml ,加入 pH415 的邻苯二甲酸氢钾2氢氧化钠缓冲
液 510ml 和 0104 %溴甲酚氯溶液 110ml ,剧烈振摇
5min ,静置 30min ;过滤氯仿层 ,并用干净的刻度试管取
滤液 610ml ,加 0101molΠL 氢氧化钠2无水乙醇溶液 (用
无水乙醇溶解氢氧化钠) 110ml ,摇匀 ;以氯仿 1010ml
同样处理后做空白对照 ,采用 TU21800SPC 紫外可见分
光光度计于 620nm 波长处分别测定吸光度[10 ] 。标准
曲线线性回归方程为 : y ( OD 值) = 010838 x + 010012 ,
R2 = 01998433 。
样品处理 :精确称取霍山石斛原球茎干品 014g ,
用研钵磨成粉末置于圆底烧瓶中 ,用适量浓氨水润湿
后密塞 30min ,加氯仿 1010ml ,称重 ,置水浴中加热回
流 2h ,冷却后用氯仿补至原重 ,过滤 ,取续滤液 ,此即
待测液。采用 TU21800SPC 紫外可见分光光度计 ,
620nm 波长下测定样品吸光度。
样品中生物碱的含量 (gΠDW·flask) = C ×V T ×n
×10 - 6Π( Vs ×DW )
式中 : C 为待测样品对应的标准曲线值 (μg) ; V T 为提
取液总体积 (ml) ; DW 为样品干重 (g) ; Vs 为测定时加
样量 (ml) ; n 为样品稀释倍数。
11313 　PAL 活性测定 　称取 3g 新鲜材料 ,用 011molΠL
硼酸缓冲液 (pH818) 10ml 研磨提取 , 4 ℃、12000rΠmin
离心 15min 得粗酶液。PAL 测定反应液总体积为 5ml ,
内含 011molΠL 硼酸缓冲液 (pH818) 3ml ,0102molΠL L2苯
丙氨酸 1ml ,粗酶液 1ml ,40 ℃水浴反应 60min ,加 012ml
6molΠL HCl 终止反应 ,290nm 测 OD 值 ,以 OD 值变化
0101 为一个酶活性单位[11 ] 。
11314 　抗氧化物酶 ( POD、SOD、CAT) 活性测定 　称取
2g 新鲜材料 ,加 pH718 的磷酸缓冲液 ,冰浴研磨 ,4 ℃、
12000rpm离心 15min ,上清定容至 5ml ,取部分上清经
稀释用于酶活测定。SOD 用 NBT 光化还原法测定 ;
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POD 用愈创木酚氧化法测定 ; CAT 用紫外吸收法测
定[12 ] 。
11315 　PPO 活性测定 　称取 1g 新鲜材料 ,加 5ml 磷酸
缓冲液 (0105molΠL pH710) ,冰浴研磨 ,12000rpm 离心
5min ,上清液即为粗酶液。取 319ml 磷酸缓冲液 ,1ml
011molΠL 邻苯二酚和 011ml 酶液 ,以煮过失活的酶液
为对照 ,重复两次 ,37 ℃反应 10min ,迅速冰浴 ,立即加
2ml 20 %三氯乙酸终止反应 ,9000rpm 离心 10min ,收集
上清并适当稀释 ,于波长 525nm 处测定吸光值 ,以每克
每分钟变化 0101 为一个酶活单位 ,按 UΠ(gFW·min) 换
算[13 ] 。
11316 　培养液 pH的测定 　培养液 pH 值采用精密 pH
计 (HI8424NEW 北京哈纳)测定。
11317 　原球茎相对电导率的测定 　采用 DDS211A 型
电导率仪测定[12 ] 。将处理组与对照组原球茎各取 2g ,
蒸馏水冲洗 2 次 ,再用洁净滤纸吸净表面水分 ,装入小
烧杯中。各加入 10ml 的蒸馏水 ,放入真空干燥箱中用
真空泵抽气 10min。将以上小烧杯置室温保持 1h ,其
间摇动多次。1h 后分别将各小烧杯内溶液充分摇匀 ,
用电导仪测其电导值 ( S1 ) 。测毕 ,将各小烧杯置沸水
浴中 10min ,以杀死植物组织。取出后自来水冷却至
室温 ,并在室温下平衡 10min ,摇匀 ,测其终电导值
( S2 ) 。另取一只装有 10ml 蒸馏水的空白小烧杯做对
照 ,测其电导值 ( S0 ) 。相对电导率 ( L ) = ( S1 - S0 )Π
( S2 - S0 )
114 　数据处理
所有数据用 DPS v7155 软件处理并统计分析。
2 　结果与分析
211 　60 Co2γ射线对霍山石斛原球茎生长量和生物碱
积累的影响
不同辐照剂量下 ,原球茎生长量和生物碱含量变
化如图 1。随着辐照剂量的增加 ,原球茎生长量呈缓
慢下降趋势 ,鲜重由 21172gΠ瓶递减到 16155gΠ瓶 ;干重
变化不大 ,由 1167gΠ瓶微降到 1129gΠ瓶。10Gy 时 ,原球
茎生长量分别为 18199 gΠ瓶 (FW)和 1153 gΠ瓶 (DW) ,比
对照降低了 13157 %和 8139 % ,60 Coγ辐照主要是影响
原球茎的鲜重量 ,对干重量影响不大。随着辐照剂量
的增加 ,生物碱含量呈先上升后下降趋势 ,辐照处理的
原球茎生物碱含量均比对照高。10Gy 时 ,原球茎生物
碱含量达最大值 ,为 01036gΠ(DW·flask) ,比对照提高了
130132 %。经统计分析 ,10Gy 辐照处理的原球茎的鲜
重和干重 ,与其他处理组的差异不显著 ,但生物碱含量
与其他组相比有极显著差异 ( p < 0105) 。
图 1 　60 Coγ辐照对霍山石斛原球茎
生物量和生物碱含量的影响
Fig. 1 　Effects of 60 Coγ2rays irradiation on biomass
and alkaloid content of D . huoshanense PLBs
表中同一列数据中有相同字母者表示
差异不显著 ( p = 0105) ,下表同。
The same letters in the same column indicated that the
difference was not significant at p = 0105 , The same as following tables.
由此可见 ,辐照剂量对原球茎生长有一定影响 ,促
进了生物碱的积累。为进一步了解辐照剂量对原球茎
生长的影响程度 ,本试验对培养液 pH 和原球茎电导
率进行了测定分析。
212 　60 Coγ辐照对霍山石斛原球茎培养液 pH的影响
从图 2 可以看出 ,辐照处理对培养液 pH 影响较
小 ,各组间差异不显著。随着辐照剂量的增加 ,pH 值
呈上升趋势。对照组 pH 值为 6115 ;10Gy 时 ,pH 值为
6156 ;30Gy 时 ,pH 值为 6174。辐照处理后 ,霍山石斛
原球茎一个生长周期后的培养液 pH 值均在 518～710
之间 ,表明培养液环境能适合原球茎继续培养[14 ] 。
图 2 　60 Coγ射线辐照对霍山石斛原球茎培养液 pH的影响
Fig. 2 　Effects of 60 Coγ2rays irradiaiton
on medium pH of D . huoshanense PLBs
213 　60 Coγ辐照对霍山石斛原球茎电导率的影响
从图 3 可见 ,对照组相对电导率为 16189 % ,5 和
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10Gy处理的原球茎相对电导率分别为 17124 %和
17142 % ,差异不显著 ,表明低剂量60 Coγ辐照对石斛原
球茎细胞损伤不大。而超过 10Gy ,原球茎相对电导率
迅速上升 ,30Gy 处理后 ,相对电导率达到 18158 % ,呈
显著性差异 ( p < 0105) ,表明细胞膜受损严重 ,此剂量
对原球茎有很大损伤作用。
图 3 　60 Coγ辐照对霍山石斛原球茎相对电导率的影响
Fig. 3 　Effects of 60 Coγ2rays irradiation on
relative electrical conductivity of D . huoshanense PLBs
由上可见 ,10Gy 60 Coγ辐照对霍山石斛原球茎影
响不大 ,且一个生长周期后 ,培养基仍适合原球茎继续
培养 ,是原球茎辐照处理的适宜剂量。为进一步了解
辐照剂量对原球茎生长的影响程度 ,对原球茎抗氧化
酶和相关次生代谢酶进行测定分析。
214 　60 Coγ辐照对霍山石斛原球茎抗氧化酶的影响
60 Coγ辐照处理原球茎可以有效提高抗氧化物酶
POD、SOD、CAT活性。图 4 可知 ,10Gy 60 Coγ辐照处理
后 ,POD、SOD、CAT活性均达到最大值 ,且与其他处理
组均成显著性差异 ( p < 0105) ,分别为 26167UΠ(gFW·
min) ,比对照提高了 135139 % ;64185UΠ(gFW·min) ,比
对照提高了 66188 % ; 35UΠ(gFW·min) ,比对照提高了
94144 %。说明 10Gy 处理后 ,原球茎清除自由基的能
力增强 ,从而防止细胞衰老 ,促进细胞生长和生物碱的
合成。
图 4 　60 Coγ辐照对霍山石斛原球茎抗氧化物酶活性的影响
Fig. 4 　Effects of 60 Coγ2rays irradiation on
resistant2oxide enzymes activity of D . huoshanense PLBs
215 　60 Coγ辐照对霍山石斛原球茎 PAL 和 PPO 活性
的影响
由图 5 可以看出 ,10Gy 60 Coγ辐照处理原球茎后 ,
PAL 活性显著提高 ,与其他各组呈显著性差异 ( p <
0105) , 为 43159 UΠ( gFW ·min ) , 比 对 照 提 高 了
215145 %。因 PAL 是次生物质代谢途径苯丙烷代谢途
径的关键酶 ,随着 PAL 活性的提高 , 生物碱含量得以
积累 ,生物碱含量也得以提高。
图 5 　60 Coγ辐照对霍山石斛原球茎 PAL 活性的影响
Fig. 5 　Effects of 60 Coγ2rays irradiation on
PAL activity of D . huoshanense PLBs
60 Coγ辐照处理原球茎抑制 PPO 的活性。由图 6
可知 ,随着辐照剂量的加大 ,PPO 活性逐渐降低 ,10Gy
时 , PPO 活性为 23150UΠ( gFW ·min) , 仅为对照的
75180 %。
图 6 　60 Coγ辐照对霍山石斛原球茎 PPO 活性的影响
Fig. 6 　Effects of 60 Coγ2rays irradiation on
PPO activity of D . huoshanense PLBs
216 　60 Coγ辐照对霍山石斛原球茎生长和生物碱积
累的动态影响
通过筛选 ,以适宜剂量 10Gy 辐照处理原球茎 ,研
究 10Gy 辐照对霍山石斛原球茎生长和生物碱积累的
动态影响。由图 72A 可以看出 ,与对照相比 ,以 10Gy
60 Coγ辐照诱变处理的原球茎生长较快 ,在 36d 左右
提前达到生长高峰 ,为 26154gΠ瓶 ,高于对照最大生长
量。由图 72B 可知 ,10Gy 60 Coγ辐照诱变处理后 ,生物
碱积累速度增快 ,产量增高 ,在 40d 左右达到最大值 ,
此时 ,生物碱含量为 01035g (DW·flask) ,比对照提高了
81176 %。
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图 7 　60 Coγ辐照对霍山石斛原球茎生长 (A)和生物碱积累 (B)的动态影响
Fig. 7 　Kinetics of 60 Co2γ irradiation on the cell growth (A) and
accumulation of polysaccharides (B) of D . huoshanense PLBs
3 　结论与讨论
以上研究结果表明 ,60 Coγ辐照诱变处理霍山石
斛原球茎的适宜剂量为 10Gy。随着辐照剂量增加 ,原
球茎鲜重、干重缓慢递减 ,这是由于石斛为了抵御60 Co
γ照射的伤害 ,部分初生代谢产物转化为次生代谢物
质。辐照剂量在达到某一适宜值时产生的次生物质最
多 ,超过这一适宜值 ,随着60 Coγ射线剂量的加大 ,60 Co
γ射线对石斛原球茎细胞的伤害程度加强 ,高强度的
射线损伤细胞 ,导致部分细胞衰老甚至死亡 ,新陈代谢
能力下降 ,表现为生物量下降 ,生物碱含量降低[6 ] 。
随着60 Coγ辐照剂量的加大 ,培养液电导率上升 ,
60 Coγ辐照对细胞的伤害程度加重。10Gy 60 Coγ辐照
处理霍山石斛原球茎时 ,培养液 pH 和原球茎电导率
变化不大 ,表明 10Gy 60 Coγ辐照处理对培养液影响不
大 ,适合继续培养。
抗氧化物酶 POD、SOD、CAT是清除氧自由基的重
要酶系。10Gy 60 Coγ辐照处理原球茎后 , POD、SOD、
CAT活性提高 ,说明此时细胞清除自由基的能力增强 ,
抗氧化能力加强[15 ] ,从而防止细胞衰老 ,促进细胞生
长和生物碱的合成。
苯丙烷代谢途径是植物细胞中许多防御性次生物
质代谢的共同途径 , PAL 是这一途径的第一关键酶。
在各种生物逆境胁迫下 ,植物细胞的特征反应之一是
苯丙烷代谢途径的激活 ,因此 ,苯丙烷代谢途径的关键
酶 PAL 活性被广泛用为植物中防御性次生代谢反应
强弱的指标[16 ] 。本试验结果表明 ,10Gy 60 Coγ辐照对
霍山石斛原球茎的辐射诱导 ,激活了 PAL 活性 ,使其
催化次生代谢反应 ,从而导致生物碱含量提高。PPO
可催化分子态氧将酚类化合物氧化为醌类物质。醌类
物质的积累会抑制细胞中多种酶的活性 ,使细胞生长
受到抑制。10Gy 60 Coγ辐照处理原球茎后 ,PPO 活性
降低 ,酶活性被抑制 ,防止了细胞衰老 ,从而促进细胞
生长和生物碱的合成。
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