全 文 ：文章编号 :100028551 (2009) 032423206
美洲拟鲽抗冻蛋白基因遗传转化草莓的研究
孙瑞芬1 　李天然 2 　安玉麟1 　李　3 　石慧芹3 　牛素清1 　赵京惠4
(11 内蒙古农牧业科学院生物技术中心 ,内蒙古 呼和浩特　010031 ;21 内蒙古大学生命科学学院 ,内蒙古 呼和浩特　010021 ;
31 内蒙古农牧业科学院园艺研究所 ,内蒙古 呼和浩特　010010 ;41 呼和浩特市蔬菜技术推广站 ,内蒙古 呼和浩特　010070)
摘 　要 :以草莓品种星都 2 号和全明星的无菌苗叶盘和叶柄基部为外植体 ,采用携带美洲拟鲽编码 pre、
pro 和 mature 3 种抗冻蛋白 (AFP)基因的双元载体系统的根癌农杆菌进行转化 ,获得 7 个 Km 抗性株系。
经 PCR 扩增及 PCR2Southern 杂交检测 ,6 个株系呈阳性 ,结果表明 ,编码 pre、pro 和 mature 的 AFP 基因分
别整合到了星都 2 号和全明星染色体 DNA 中 ,其中获得 pre、pro 和 mature 转星都 2 号株系各 1 个 ,转化
率分别为 1156 %、1149 %和 1167 % ; mature 基因转全明星株系 3 个 ,转化率为 4105 %。
关键词 :草莓 ;美洲拟鲽 ;抗冻蛋白 (AFP)基因 ;遗传转化 ;PCR2Southern 杂交
THE GENETIC TRANSFORMATION OF STRAWBERRY WITH WINTER FLOUNDER
ANTIFREEZE PROTEIN GENE
SUN Rui2fen1 　LI Tian2ran 2 　AN Yu2lin1 　LI Kun3 　SHI Hui2qin3 　NIU Su2qing1 　ZHAO Jing2hui4
(11Biotechnology Research Center , Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences , Huhhot , Inner Mongolia 　010031 ;
21 College of Life Science , Inner Mongolia University , Huhhot , Inner Mongolia 　010021 ;
31 Institute of Horticulture , Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences , Huhhot , Inner Mongolia 　010010 ;
41Vegetable Technology Extend Station of Huhhot , Huhhot , Inner Mongolia 　010070)
Abstract :Antifreeze protein (AFP) of Pseudopleuronectes americanus gene encoding pre , pro and mature was introduced into
strawberry ( Fragaria × ananassa cv1 Xingdu 2 and Allstar) by mediated Agrobacterium gene transfer of a binary vector ,and
the axenic leaf discs and lower part of petioles of strawberry were used as explants. The results showed that the foreign AFP
gene encoding pre , pro and mature was integrated independently into the genome of six transgenic strawberry plants by PCR
and PCR2Southern bloting analysis of seven Kmamycin2resistant transformed plants. Three regenerated Xingdu 2 lines were
positive for pre , pro and mature , and their transformation efficiency was 1156 % , 1149 %and 1167 % respectively. Three
regenerated Allstar lines were positive for mature and its transformation efficiency was 4105 %.
Key words :strawberry ; winter flounder ; antifreeze protein (AFP) gene ; gene transfer ; PCR2Southern blotting
收稿日期 :2008210228 　接受日期 :2009202217
基金项目 :内蒙古自治区科技重点攻关项目 (NK20030082)
作者简介 :孙瑞芬 (19632) ,女 ,内蒙古乌兰察布人 ,硕士 ,研究员 ,主要从事生物技术研究工作。E2mail :sunruifen3231 @sina. com　　草莓 ( Fragaria ×ananassa Duch. ) 是一种非常重要的水果经济作物 ,因其具有丰富的营养价值和重要的保健作用在国内外水果市场上占有重要的地位 ,然而低温、冻害成为寒冷地区草莓生产的主要限制因素 ,因此提高草莓的抗寒性 ,培育抗寒品种是草莓生产的迫切需要。传统的育种方法往往受到品种内遗传多样性的限制 ,而基因工程技术的发展和应用打破了物种间 的界限 ,能够将来自相同或其他不同物种的特异性状导入植物体内。目前 ,抗冷冻蛋白基因克隆和转化的成功 ,为作物抗寒育种开辟了一条新途径。抗冻蛋白 (antifreeze protein ,AFP) 是一类具有降低生物体液冰点和抑制冰晶生长的生物活性蛋白 ,在低温生物的生存中起着重要的作用。目前 ,已从鱼类、昆虫、植物、真菌中分离了许多抗冻蛋白 ,而研究最深入、
324　核 农 学 报　2009 ,23 (3) :423～428Journal of Nuclear Agricultural Sciences
应用最广泛的是鱼类抗冻蛋白。鱼类 AFP 是一些生
活在两极高纬度海域中的硬骨鱼类为保护其血液在环
境温度低于血液冰点时不致因冻结造成机体死亡而在
肝脏中合成的一类特殊的血清蛋白。鱼类 AFP 已转
入到鱼类、昆虫、植物中并获得表达 ,而特别令人瞩目
的是将鱼类 AFP 基因转入植物中提高了植物的抗寒
性。Cultur 等[1 ] 采用真空渗入法将北极鱼 AFP 基因转
入到马铃薯、油菜和拟南芥等植物的叶片中 ,使叶片和
细胞免受冻害的温度降低约 118 ℃。Strizhor[2 ] 把北极
鱼 AFP cDNA 克隆获得的 AFP 基因转入烟草中表达 ,
使烟草可耐 - 615 ℃的低温。Geroges 等[3 ] 将人工合成
的 AFP 基因 ,用电激法转入到玉米原生质体中 ,通过
CAT活性、Western 杂交及免疫学检测 ,证实 AFP 基因
在玉 米 原 生 质 体 中 表 达。美 洲 拟 鲽 ( Pseudop
leuronectes americanus) 是生活在寒带和寒温带的一种
海鱼 , 能产生大量的抗冻蛋白。黄永芬等[4 ] 采用花粉
管通道和子房注射法将美州拟鲽 AFP 基因导入番茄
中获得表达。李天然等[5 ] 将美拟鲽 AFP 基因转入甜
菜中 ,获得 AFP 基因整合表达的工程植株 , 使甜菜可
耐 - 615 ℃的低温 ,但国内外对AFP 基因转化草莓的研
究未见报道。
本研究在草莓再生体系建立[6 ] 的基础上 ,通过农
杆菌介导进行草莓优良品种转化 A FP 的研究 ,获得了
转基因植株 ,为草莓基因工程育种研究奠定了基础。
1 　材料和方法
111 　材料
草莓品种星都 2 号、全明星取自内蒙古农牧业科
学院园艺研究所草莓试验地。AFP 基因是从北极鱼
(美洲拟鲽 Pseudop leuronectes am ericanus) 的血液中提
取的 3 种抗冻肽 ,由特异的 mRNA 反转录合成 cDNA。
cDNA 包括 pre、pro 和 mature 3 部分 ,其中 mature 基因
189bp ,pro (含 mature 基因) 252bp , pre (含 pro 和 mature
基因) 310bp。3 种 AFP 基因已被分别组装于表达盒子
(expression cassette ) 上 , 并构建 到 植 物 表 达 载 体
pPCV002 中 ,用于AFP 基因的遗传转化。E. coli S1721菌
株 (带有编码 pre、pro 和 mature AFP 基因的双元载体质
粒 p PCV002 ,代号分别为 2183、2184、2185) 和农杆菌
GV3101(p Mp90Rk)由李天然教授提供 ,质粒及 AFP 基
因表达盒子见图 12A、B、C。
112 　方法
11211 　引物　选用 pre、pro 和 mature 3 个基因共有部
分的 173bp 碱基序列设计引物 ,引物由南京依贝生物
工程公司合成。序列为 :Primer 1 :5’GAC ACC GCC TCT
GAT 3’(15mer) ; Primer 2 :5’TCC GTC GAT CCT TAA
CCT CTG 3’(21mer) 。
11212 　E. coli S1721和农杆菌 GV3101 的融合 　供试菌
株 E. coli S1721的质粒 pPCV002 (分别含 pre、pro、mature)
是一种新型双元载体系统 ,含有复制和动员单位
(mob) ,它可以在 E. coli 和农杆菌间来回转移 ,具有
RK2 的辅助功能[7 ] ,所以将质粒 pPCV002 转化到含 Vir
区质粒 (pMP90RK)的根癌农杆菌 GV3101 中 ,不需要另
外的辅助质粒 ,结合程序如下 : (1) 挑取农杆菌 GV3101
( Kmr ) 单菌落 ,接种于 5ml YEB 液体培养基 (含 Km
50mgΠL、Rif 20mgΠL) 中 ,于 28 ℃以 300rΠmin 振荡培养
2d ; (2) 分别挑取含 pre、pro 和 mature 基因的 3 种 E.
coli S1721单菌落 ,接种于 5ml 含 Amp 100mgΠL 的 LB 液
体培养基中 ,于 37 ℃以 300rΠmin 水浴振荡培养过夜 ;
(3)将 GV3101 和 3 种 E. coli S1721的培养物以 5000rΠmin
离心 10min ,去上清 ,沉淀分别悬浮于 10ml YEB 和 LB
液体培养基中。(4)吸取 3 种 E. coli S1721培养物 30μl ,
分别与 50μl 农杆菌培养物混合均匀涂布于 YEB 固体
平板培养基 (不含任何抗菌素) 上 ,于 28 ℃培养过夜 ,
长菌落 ; (5) 用 1ml 无菌 ddH2O 洗脱 YEB 平板上的菌
落并用 Tip 头吸打数次 ,使其混匀 ; (6) 分别取 100μl 上
述菌液 ,用无菌 ddH2O 稀释成 10 - 1 、10 - 2 、10 - 3 、10 - 4 、
10 - 5 、10 - 6 稀释液 ; (7) 吸取各梯度稀释液 100μl ,分别
涂布于 YEB 固体培养基 (含 Amp 100mgΠL、Km 50mgΠL、
Rif 20mgΠL)上 ,28 ℃培养 2d ,长菌落。同时在同样的平
板上分别涂 GV3101、S1721 作为对照 ; (8) 挑取分离好的
单菌落划线培养于含 Amp 100mgΠL、Km 50mgΠL、Rif
20mgΠL 的 YEB 培养基上 ,28 ℃培养 2d ,得到形态、颜
色、大小均匀一致的菌落为融合的双元载体克隆。
11213 　草莓外植体的转化 　取 3 种转化农杆菌的过
夜培养物 5ml (含 Km 50mgΠL) ,用MS 液体培养基 (不加
抗生素)稀释菌液到 OD600nm值为 015 左右 ,分别侵染星
都 2 号和全明星的无菌苗叶盘及叶柄基部 5min。取出
外植体 ,用无菌滤纸吸干多余菌液 ,将其接种于不含抗
菌素的 MS(B5 有机 ,即将 MS 培养基中的有机成分换
成 B5 培养基中的有机成分) + 62BA 213mgΠL + IAA
118mgΠL 的培养基上 ,在黑暗条件下与农杆菌共培养
3d。
11214 　小植株再生和筛选　将共培养 3d 后的外植体
转入含 Km 25mgΠL、cef 500mgΠL 的相同培养基中诱导
生芽 ,将诱导出的芽转接在继代培养基 MS + 62BA
110mgΠL + NAA 0101mgΠL (含 Km 25mgΠL) 中生长并增
424 核　农　学　报 23 卷
　　　
图 1 　质粒及 AFP基因表达盒子
Fig. 1 　Plasmid and expression cassette of AFP gene
A 图 :PNOS :胭脂碱合成酶基因启动子 ;PAOCS :章鱼碱合成酶基因的多聚腺苷酸化序列 ;NPT2Ⅱ:新霉素磷酸转移酶 ;BL 和 BR :T2DNAS 的左右边界序
列 ;Pg5 :TL2DNA 基因的截短启动子。B 图 :vir :Ti 质粒的毒区 ;traTi :Ti 质粒的转移位点 ;oriTi :Ti 质粒的复制原点 ;tra1～3和 trf2 :来自辅助质粒 RK2 的
转移基因。C图 :4 En :4 个增强子 ;TLE:TMV △Ω(转译增强序列) ;P35S :CaMV35S的启动子 ;pA :CaMV35S的 polyA 中止序列
Figuer A :PNOS :promoter of nopaline synthase gene ; PAOCS :polyadenylation sequence of octopine synthase gene ; NPT2Ⅱ:neomyein phosphotransferase gene ; BL and
BR :left and right border sequences of vecter T2DNAS ; Pg5 :truncated promoter of TL2DNA gene. Figuer B :vir :toxic origin of Ti plasmid ; tra Ti :transfer site of Ti
plasmid ; ori Ti :replication origin of Ti plasmid ;tra1～3 and trf2 :transfer gene from auxiliary plasmid RK2 . Figuer C :4 En :4 enhancers ; TLE: TMV △Ω(translation
enhanced sequence) ; P35S :promoter of CaMV35S; pA :polyA pause sequence of CaMV35S
殖 ,待小植株长出 4～5 片幼叶时 ,将其转接到 MS + IBA
015mgΠL (含 Km 25mgΠL)培养基中生根。
113 　测定
11311 　3 种转化农杆菌质粒 pPCV002 的电泳检测　用
碱裂解法[8 ] 提取 3 种融合后的农杆菌质粒和 3 种 E.
coli S1721 重组质粒 ,用 110 %琼脂糖凝胶电泳检测并照
相。
11312 　转化农杆菌重组质粒中 pre、pro 和 mature 基因
的 PCR 检测 　对 E. coli S1721质粒以及转化农杆菌质粒
中 pre、pro 和 mature 基因进行 PCR 扩增。扩增条件为 :
94 ℃预变性 5min ,94 ℃变性 1min ,56 ℃退火 1min ,72 ℃延
伸 015min ,30 个循环 ,72 ℃保温 10min。215 %琼脂糖凝
胶电泳检测并照相。
11313 　转化体鉴定 　提取抗 Km 的转化植株总 DNA ,
方法按照北京天为时代科技有限公司 Plant Genomic
DNA Kit 产品说明书进行 ,以含 mature 基因的农杆菌质
粒 DNA 的扩增片断作阳性对照 , 以未转化植株的 DNA
扩增产物为阴性对照 ,PCR 扩增目的基因进行转化体的
鉴定 ,PCR 反应条件同上。
11314 　PCR2Southern 杂交检测 　探针制备是将农杆菌
重组质粒 pPCV002Πmature 的 PCR 扩增产物回收纯化 ,
以其作为模板进行标记 ,按照 Roche 产品 DIG High
Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅰ产品说明
书进行。凝胶转膜是将转化植株总DNA 的 PCR 产物和
质粒DNA 的 PCR 扩增产物 (阳性对照)以及非转化植株
总 DNA 的 PCR 扩增产物 (阴性对照) 进行 215 %琼脂糖
凝胶电泳 , Southern 吸印转移到 Total BLOT + TM Nylon
Membranes(Mandel 产品) 上。转膜按王关林等[9 ] 的方法
进行。杂交按照 DIG High Prime DNA Labeling and
Detection Starter Kit Ⅰ产品说明书进行。
2 　结果与分析
211 　转化农杆菌中重组质粒的检测
转化的农杆菌能在含有 Km、Amp、Rif 的 YEB 固体
培养基上生长 ,而对照不能生长 ,初步说明 3 种重组质
粒 pPCV002 已分别转进农杆菌中。
采用碱裂解法提取 E. coli 及转化农杆菌的 3 种质
粒并用琼脂糖凝胶电泳分析证明 ,从融合后的农杆菌
GV3101中分别获得了约 10149 kb (含 pre) 、10143 kb (含
pro) 、10138 kb(含 mature)的重组双元载体质粒 ,其迁移速
率正好与 E. coli S1721中的重组质粒一致 (图 2) ,进一步证
明 3 种重组质粒分别转进了农杆菌 GV3101 中。
212 　转化农杆菌中 pre、pro 和 mature 基因的 PCR检测
524　3 期 美洲拟鲽抗冻蛋白基因遗传转化草莓的研究
图 2 　转化农杆菌重组质粒电泳检测
Fig. 2 　Agarose gel electrophoresis of recombinant
plasmid in Agrobacterium
1、8 :λDNAΠHind Ⅲ标准样品 ;2、4、6 :含有 pre、pro 和
mature 基因的农杆菌重组质粒 ; 3、5、7 :含有
pre、pro 和 mature 基因的大肠杆菌重组质粒
1 ,8 :λDNAΠHind ⅢMarker ; 2 ,4 ,6 :recombinant plasmid
with pre , pro and mature gene in Agrobacterium ;
3 ,5 ,7 :recombinant plasmid with pre , pro and mature gene in E. coli
进一步对 pre、pro 和 mature 基因进行 PCR 扩增 ,电
泳结果表明 (图 3) ,从转化农杆菌质粒中扩增出的条带
大小与从 E. coli 质粒中扩增出的条带大小相同 ,为
173bp ,均为 mature 基因的片段 ,再一次证明含有 pre、
pro 和 mature 基因的 3 种质粒分别转化进了农杆
菌中。　　
213 　草莓外植体的转化和抗性小植株的再生
将 2 个草莓品种的叶盘和叶柄基部分别在含 pre、
pro 和 mature 基因的农杆菌中侵染 5min ,共培养 3d 后 ,
在MS 附加 62BA 213mgΠL、IAA 118mgΠL、Km 25mgΠL、cef
500mgΠL 培养基中培养 15d ,从星都 2 号和全明星的叶
柄基部切口处产生小绿点继而分化成丛芽 (图 42a、b) 。
图 3 　转化农杆菌重组质粒 PCR 检测
Fig. 3 　PCR analysis of recombinant plasmid
in Agrobacterium
1 :50bp DNA 标准样品 (北京天为时代产品) ;
2、4、6 :农杆菌质粒 pre、pro 和 mature 的 PCR 扩增 ;
3、5、7 :大肠杆菌质粒 pre、pro 和 mature 的 PCR 扩增
1 :50bp DNA Ladder Marker ;2 ,4 ,6 :PCR product of pre ,
pro and mature gene in Agrobacterium ;3 ,5 ,7 :PCR
product of pre , pro and matur gene in E. coli
再生芽长到 2～3cm 时 ,从转化的外植体上切下来 ,
转接到新鲜的具选择标记 ( Km 25mgΠL)的继代培养基中
继续培养一段时间后 ,有的小植株逐渐变黄死亡 ,这些
是非转化细胞再生的不定芽。由筛选下来的小植株扩
繁出转化芽的无性繁殖株系见图 42c、d。
图 4 　抗性芽 (a ,b)及其无性繁殖株系 (c ,d)
Fig. 4 　Km2resistant shoots (a , b) and clone lines(c ,d)
　　将各株系的小植株转移到 MS 附加 IBA 015mgΠL
和 Km 25mgΠL 生根培养基中 ,进一步筛选掉可能由于
外植体在培养过程中吸水膨胀发生弯曲而离开筛选培
养基所产生的一些假阳性植株。筛选后的植株在生根
培养基中能够很好地生根 (图 5) 。而与叶柄基部同时
转化的叶盘无转化芽产生 ,并逐渐变褐死去 ,由此也说
明叶柄基部是草莓遗传转化较合适的受体。
3 种 A FP 基因转化草莓的结果表明 ,用 pre、pro
和 marture 基因转化的星都 2 号均获得了抗性植株 ;而
转化的全明星中 ,只获得了 mature 基因转化的抗性植
图 5 　生根的转基因植株
Fig. 5 　Transgenic plants for inducing roots
株 ,最后得到 7 个转化植株的无性繁殖株系 (表 1) 。
214 　转化植株的 PCR检测
624 核　农　学　报 23 卷
表 1 　3 种 AFP基因对草莓品种的转化结果
Table 1 　The transformation results of strawberry with three different A FP genes
目的基因
target
gene
草莓品种
varieties of
strawberry
接种外植
体数量
total number
of explants
再生芽的
外植体数量
number of
explants
regenerated
shoots
再生芽数量
number of
regenerated
shoots
卡那霉素
抗性芽数量
number
of Km2
resistant
shoots
卡那霉素抗性
生根株系数量
number of
rooting
Km2resistant
lines
PCR2Southern
检测阳性
株系数量
number of
PCR2Southern
positive lines
目的基因的
转化频率
frequency of
target gene
transformation
( %)
pre 星都 2 号 Xingdu 2 64 10 10 3 1 1 1156
全明星 Allstar 62 9 9 2 0 0 0
pro 星都 2 号 Xingdu 2 67 12 12 3 1 1 1149
全明星 Allstar 71 3 3 0 0 0 0
mature 星都 2 号 Xingdu 2 60 1 3 2 1 1 1167
全明星 Allstar 74 8 8 5 4 3 4105
　　只要从 pre、pro 和 marture 转化的植株中均扩增出
mature 基因的片断 , 就可初步证明含 pre、pro 和
marture 的 AFP 基因已整合到草莓基因组 DNA 中。电
泳结果表明 (图 6) ,从 6 个转化株系中均扩 增 出 与
阳 性 对 照 大小一样的 片 段 (173bp) , 而阴性对照中
没有扩增出预期片断。
图 6 　转基因植株的 PCR 检测
Fig. 6 　PCR analysis of transgenic plants
M:50 bp DNA 标准样品 (TaKaRa 产品) ;1、6 :阳性对照 ;
2、3、4 : pre、pro 和 mature 转化星都 2 号的转基因株系 ;
5、10 :阴性对照 ;7、8、9 : mature 转化全明星的转基因株系
M:50bp DNA Ladder Marker ; 1 ,6 :positive control ;
2 ,3 ,4 :transformed lines of Xingdu 2 with pre , pro and
mature ; 5 ,10 :negative control ;7 ,8 ,9 :transformed lines
of Allstar with mature
215 　转化植株的 PCR2Southern 杂交检测
为了进一步证实 PCR 扩增产物的真实性 ,将 PCR
扩增产物电泳后印迹转移到硝酸纤维素膜上 , 以
pPCV002Πmature 质粒的 PCR 回收产物为探针进行
PCR2Sonthern 杂交 ,结果表明 ,PCR 阳性植株显示出较
强的杂交信号 (图 7) ,而阴性对照植株没有显示出杂
交信号 ,进一步证明目的基因已成功整合进草莓基因
组中 ,最终获得转基因株系 6 个 ,其中 pre、pro 和
mature 转星都 2 号株系各 1 个 ,转化率分别为 1156 %、
1149 %和 1167 % ; mature 基因转全明星株系 3 个 ,转化
率为 4105 %(表 1) 。
图 7 　转基因植株 PCR2Southern 杂交检测
Fig. 7 　PCR2Southern blotting detection of transgenic plants
1、6 :阳性对照 ;2、3、4 : pre、pro 和 mature 转化星都 2 号的转基因株系 ;
5、10 :阴性对照 ;7、8、9 : mature 转化全明星的转基因株系
1 ,6 :positive control ; 2 ,3 ,4 :transformed lines of Xingdu 2 with pre ,
pro and mature ; 5 ,10 :negative control ;7 ,8 ,9 : transformed
lines of Allstar with mature
3 　讨论
植物转化过程中 ,掌握好外植体在农杆菌中的侵
染时间是转化成功的关键之一。侵染时间太短 ,农杆
菌不能充分接种到外植体伤口表面 ,共培养时无农杆
菌生长 ,不能转化 ;侵染时间太长 ,外植体因受农杆菌
的毒害缺氧而软腐坏死。侵染时间因作物不同而不
同 ,一般不超过 30min[9 ] 。本试验中草莓外植体在农杆
菌中的最适侵染时间为 5min ,试验中也曾进行过 30 和
60min 乃至 1～2d 的侵染试验 ,但都未获得再生植株 ,
原因是在以后的培养中农杆菌过度生长致使外植体受
毒害而坏死。但有些转化研究表明 ,农杆菌侵染 2d 也
可获得理想的转化结果[5 ,10 ] 。
多数研究者用草莓的叶片作为遗传转化的受
体[11～15 ] ,而在本试验中 ,叶盘作为转化受体没有获得
转基因植株 ,而用叶柄基部作转化受体时获得了转基
因植株 ,因此认为草莓的叶柄基部可以作为草莓遗传
转化的起始受体 ,这与李天然等[5 ] 在研究 AFP 基因转
化甜菜的试验结果是一致的。
Km对转化有很大影响 ,不同的品种对 Km 的耐受
程度不同。邓馨[14 ] 在研究 Km 对草莓 M14 转化叶片
724　3 期 美洲拟鲽抗冻蛋白基因遗传转化草莓的研究
再生时 ,用 50mgΠL 的 Km 作为筛选转化细胞的浓度。
秦永华等[16 ]在研究丰香草莓遗传转化中得出适宜的
Km筛选浓度为 20mgΠL。高庆玉等[17 ] 在农杆菌介导
TCS 及 RIP 转化草莓森嘎拉和戈雷拉研究中 ,确定森
嘎拉的 Km 最终筛选压力为 20mgΠL ,戈雷拉为 25mgΠL。
朱海生等[18 ]利用带有内含子 gus 基因的瞬时表达 ,研
究影响根癌农杆菌介导鬼露甘草莓遗传转化的若干因
素 ,结果表明 :草莓叶片外植体对 Km 较为敏感 ,适宜
的筛选浓度为 20mgΠL。金万梅等[19 ] 在冷诱导转录因
子 CBF1 转化草莓的研究中用 25mgΠL Km 筛选转化植
株。本试验用 50mgΠL Km 作为筛选浓度时无转化芽产
生 ,而用 25mgΠL Km 时获得了转化植株。
关于外植体在转化前是否要进行预培养 ,不同的
植物研究结果不一致 ,一般认为对外植体进行一定时
间的培养可以促进细胞分裂 ,呈分裂状态的细胞更容
易整合外源基因 ,从而提高外源基因的瞬时表达和转
化率。朱海生等[18 ]的研究发现 ,对鬼露甘草莓叶盘进
行预培养是必要的 ,不经预培养直接用农杆菌感染 ,叶
盘会很快褐化、死亡 ,预培养时间过短 (1d) ,叶盘还未
形成感受态细胞 ,细胞转化率较低 ;若预培养超过 4d ,
伤口快要愈合 ,农杆菌难以浸染 ,转化效率降低 ,而且
即使获得不定芽 ,假阳性很高 ,经 Km 抗性选择便逐渐
白化。这可能是本试验转化效率低的原因之一。
Nehra 等[20 ]在对草莓进行转化时发现 ,将侵染后
的外植体在无抗生素的培养基中培养 10d 后 ,再加入
选择压进行筛选 ,结果转化率从 3 %提高到 7 % ,故认
为延迟选择是提高转化率的关键。秦永华等[16 ] 的研
究表明 ,延迟 2 周筛选能显著提高丰香草莓转化率。
通过延迟筛选提高转化率的方法值得我们借鉴。
近年来 ,国内外有关草莓遗传转化的报道比较多 ,
本试验用北极鱼的 3 种 AFP 基因转化草莓品种星都 2
号和全明星 ,获得的转化植株经 PCR 和 PCR2Southern
杂交检测 ,证明 pre、pro 和 mature 基因分别整合到草
莓染色体 DNA 中 ,叶柄基部可以作为草莓遗传转化的
起始受体 ,有关这方面的研究 ,国内外尚未见报道 ,而
关于 AFP 基因在转基因中的表达还需进一步进行田
间抗寒性鉴定。
致谢 : 本试验承蒙内蒙古大学生命科学学院
李天然教授悉心指导 ,在此向李天然教授表示深切的
怀念。
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