全 文 ：© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
文章编号 :100028551(2009) 052820205
药用菊花 SRAP2PCR 反应体系的优化
邵清松1 ,2 　郭巧生1 　房海灵1
(11南京农业大学中药材研究所 ,江苏 南京　210095 ;21浙江林学院 ,浙江 杭州　311300)
摘　要 :基于方差分析方法 ,利用正交试验从 Taq 酶、Mg2 + 、dNTP、引物和模板 DNA 等 5 因素 4 水平对药用
菊花反应体系进行优化。结果表明 :药用菊花 SRAP2PCR 的最佳反应体系为 :在 20μl 的反应体系中 ,模板
DNA 60 ng , Taq 酶 1100 U ,Mg2 + 2100 mmolΠL ,dNTP 0120 mmolΠL ,引物 0140μmolΠL。Taq 酶、Mg2 + 、dNTP 和引
物对 SRAP 反应结果有显著影响。所建立的药用菊花 SRAP 反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、
检测多态性能力较强、重复性好等特点 ,可用于药用菊花的遗传多样性研究。
关键词 :药用菊花 ;SRAP 反应体系 ;正交设计 ;方差分析 ;优化
OPTIMIZATION OF SRAP2PCR REACTION SYSTEM FOR Chrysanthemum
morifolium Ramat BASED ON THE ANALYSIS OF VARIANCE
SHAO Qing2song1 ,2 　GUO Qiao2sheng1 　FANG Hai2ling1
(1. Institute of Chinese Medicinal Materials , Nanjing Agricultural University , Nanjing 　210095 ;
2. Zhejiang Forestry College , Hangzhou 　311300)
Abstract :Based on the analysis of variance , an orthogonal design was made to optimize the SRAP2PCR amplification system on
Chrysanthemum morifolium Ramat using five factors (template DNA , Taq polymerase , Mg2 + , dNTP and primer) at four levels
of concentrations respectively1 The results showed that :a suitable SRAP reaction system was constructed with the 20μl reaction
system containing 1100 U Taq polymerase , 2100 mmolΠL Mg2 + , 0120 mmolΠL dNTP , 0140μmolΠL primer and 60ng template
DNA. SRAP2PCR was significantly influenced by Taq polymerase , Mg2 + , dNTP and primer. These SRAP2PCR systems could
provide clear reliable abundant polymorphisms molecular markers and were proved suitable for the study of the genetic diversity of
Chrysanthemum morifolium Ramat .
Key words : Chrysanthemum morifolium Ramat ; SRAP reaction system; orthogonal design ; analysis of variance ; optimization
收稿日期 :2009202222 　接受日期 :2009204227
基金项目 :国家“十一五”科技支撑计划项目(2006BAI06A12211) ,浙江省自然科学基金项目( Y2090175)
作者简介 :邵清松(19802) ,男 ,浙江人 ,博士研究生 ,主要从事药用植物遗传多样性及中药资源开发与利用方面的研究。
通讯作者 :郭巧生(19632) ,男 ,江苏人 ,博导、教授 ,主要从事中药材规范化生产研究。Tel :025 - 84396591 ;E2mail : gqs @njau. edu. cn　　序列相关扩增多态性 ( sequence2related amplifiedpolymorphism, SRAP) 是 Li 等[1 ] 于 2001 年开发的基于PCR 的分子标记技术 ,该标记通过独特的引物设计对可读框 (open reading frames , ORFs)进行扩增。上游引物长17 bp ,5′端的前 10 bp 是一段填充序列 ,紧接着是 CCGG,组成核心序列及 3′端 3 个选择碱基 ,对外显子进行特异扩增。下游引物长 18 bp ,5′端的前 11 bp 是一段填充序列 ,紧接着是 AATT ,组成核心序列及 3′端 3 个选择碱基 ,对内含子区域、启动子区域进行特异扩增。因不同 个体、物种的内含子、启动子及间隔区长度不同而产生多态性 ,SRAP 具有多态性高、重复性好、在基因组中分布均匀、引物通用性强等优点 ,适合于遗传多样性分析、种质鉴定、遗传连锁图的构建、基因定位和比较基因组学研究等诸多研究领域[2～7] 。目前已经在石斛[8 ] 、仙茅[9 ] 、青牛胆[10] 、黄花蒿[11] 、丹参[12] 等药用植物研究中应用 ,在药用菊花研究中未见报道。药用菊花为菊科菊属植物菊 Chrysanthemum morifolium Ramat 的干燥头状花序 ,为常用中药 ,具有散风清热 ,平肝明目等功效。用于
028　 核 农 学 报　2009 ,23(5) :820～824Journal of Nuclear Agricultural Sciences
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风热感冒 ,头痛眩晕 ,目赤肿痛 ,眼目昏花[13] 。
我国药用菊花具有悠久的历史 ,分布广泛 ,类型多
样 ,根据产地不同 ,主要有杭菊、贡菊、亳菊、滁菊、怀菊、
济菊和祁菊等类型。由于经过长期的相互引种栽培 ,造
成了地区间药用菊花类型的混杂。据初步调查 ,药用菊
花种质资源在形态特征、内在质量和产量等方面均有较
大差异 ,但彼此间遗传背景、亲缘关系尚不清楚 ,故有必
要运用新的技术手段加强药用菊花种质资源遗传多样
性研究。
本研究基于方差分析方法 ,采用正交设计方法对影
响药用菊花 SRAP2PCR 反应体系的 5 个主要因素 (模板
DNA、Taq 酶、Mg2 + 、dNTP、引物)在 4 个水平上进行优化
试验 ,选取最佳因素水平 ,以建立药用菊花 SRAP2PCR
最佳反应体系 ,为开展药用菊花种质资源多样性评价、
新品种鉴定和亲缘关系分析等提供技术支撑。
1 　材料与方法
111 　材料
供试材料为搜集到的我国药用菊花主产区的 35 份
种质 ,经郭巧生教授鉴定。材料取自南京农业大学中药
材研究所药用菊花种质资源圃。采取幼嫩叶片 ,液氮速
冻后置于 - 70 ℃冰箱保存备用。
112 　方法
11211 　基因组 DNA 提取　采用改良的 CTAB 法[14] 提取
基因组 DNA ,018 %琼脂糖凝胶电泳检测 ,用 Eppendorf
公司生产的Bio Photometer 核酸检测仪检测 DNA 溶液浓
度与纯度 ,并将浓度稀释至 30 ngΠ8μl。
11212 　SRAP2PCR 反应体系的正交试验 　以黄药菊
DNA 为试材 ,针对影响 PCR 反应的 Taq 酶、Mg2 + 、dNTP、
引物、模板 DNA 5 个因素 ,选用L16 (45 )正交表在 4 个水
平上试验 ,L16 (45 )正交设计方案见表 1。
将表 1 的 16 个处理重复 2 次 ,在M J Research 公司
生产的 PTC2200TM型扩增仪上进行扩增 ,反应体系为 20
μl ,引物组合为 Em 17 ( GACTGCGTACGAATTTAG ) ,Me 20
(TGAGTCCAAACCGGCAT) ,除上述变化因素外 ,还含有 1
×PCR buffer。反应程序为 :94 ℃预变性5 min ,94 ℃变性
1 min ,35 ℃复性 1 min ,72 ℃延伸 115 min ,5 个循环 ;94 ℃
变性 1 min ,50 ℃复性 1 min ,72 ℃延伸 115 min ,35 个循
环 ,72 ℃延伸 7 min ;4 ℃保存。扩增产物用 8 %聚丙烯酰
胺凝胶分离 ,电泳缓冲液为 1 ×TBE ,电压 120V ,电泳时
间为 50～60 min。电泳后银染 ,银染方法 :固定液 (10 %
醋酸 50 ml + 无水乙醇100 ml + 水 850 ml) 固定 12 min ,
012 %AgNO3 染色 12 min ,水洗 1 min ,显色剂 (414 ml 甲
醛 + 6g NaOH + 400 ml 水)显色。
表 1 　PCR扩增体系各成分因素2水平正交设计表 L16 ( 45 )
Table 1 　Orthogonal design for PCR
factor
No
Taq 酶
Tap
polymerase
(U)
Mg2 +
(mmolΠL) dNTP(mmolΠL) 引物primer(μmolΠL) 模板 DNAtemplateDNA(μl)
1 0150 1150 0110 0120 1100
2 0150 2100 0115 0130 2100
3 0150 2150 0120 0140 3100
4 0150 3100 0125 0150 4100
5 1100 1150 0120 0150 2100
6 1100 2100 0125 0140 1100
7 1100 2150 0110 0130 4100
8 1100 3100 0115 0120 3100
9 1150 1150 0125 0130 3100
10 1150 2100 0120 0120 4100
11 1150 2150 0115 0150 1100
12 1150 3100 0110 0140 2100
13 2100 1150 0115 0140 4100
14 2100 2100 0110 0150 3100
15 2100 2150 0125 0120 2100
16 2100 3100 0120 0130 1100
11213 　优化体系应用　根据以上试验结果确定 SRAP2
PCR 的最佳反应体系 ,对我国不同产地的 35 份药用菊
花种质材料进行 DNA 扩增 ,对筛选出的体系进行稳定
性检测。
2 　结果与分析
211 　正交试验结果及数据处理
根据L16 (45 )正交试验 PCR 产物电泳结果 (图 1) ,按
照遗传多样性分析要求 ,依据扩增出的谱带特异性与敏
感性即谱带多少、亮度的强弱和杂带的有无对 PCR 扩
增结果从高到低依次打分。谱带越多、亮度越强、又无
杂带则评分越高。最好的处理 (谱带最多、亮度最强、无
杂带)定为 16 分 ,最差的处理 (谱带最少、亮度最弱、有
杂带)定为 1 分 ,以这 2 个处理的结果为比较标准 ,再将
其他处理的谱带结果与这 2 个标准比较依次评分 ,对 2
次重复分别独立统计 ,依处理得到的 2 次记分结果分别
为 :7 ,11 ,12 ,14 ,16 ,15 ,10 ,13 ,9 ,8 ,1 ,2 ,4 ,6 ,3 ,5 ;7 ,12 ,13 ,
11 ,16 ,15 ,10 ,14 ,9 ,8 ,1 ,2 ,6 ,5 ,3 ,4。
212 　各因素对 SRAP2PCR 反应影响的方差分析
用 SPSS 1310 统计软件对正交试验结果进行方差
分析 (表 2)表明 : Taq 酶、Mg2 + 、dNTP 和引物对试验结
果有极显著的影响 ( P < 0101) ,模板 DNA 对试验结果
128　5 期 药用菊花 SRAP2PCR 反应体系的优化
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图 1 　SRAP2PCR 正交试验结果
Fig. 1 　Electrophoresis of SRAP2PCR orthogonal design
1～16 序号如表 1 ; M:pUC18
1～16 :Treatment number (as Table 1) ;M: pUC18 marker
表 2 　PCR 反应各因素正交设计方差分析
Table 2 　Variance analysis of the factors of PCR reaction
变异来源
sources of
variation
自由度
degree of
freedom
均方
mean
square
F
显著水平
significant
level
Taq 酶
Tag polymerase
3 1601417 2851185 01000
Mg2 + 3 171250 301667 01000
dNTP 3 141833 261370 01000
引物 primer 3 291750 521889 01000
模板 DNA
template DNA
3 11417 21519 01095
误差 error 16 01563
无显著性影响 ( P > 0105) ,进一步对各因素的不同水
平进行多重比较。
21211 　Taq 酶浓度的影响 　对 Taq 酶用量进行因素
内多重比较 ,均值极差分析结果为 18125 ,是 5 个影响
因子中极差值最大的 ,说明 Taq 酶用量是影响 SRAP2
PCR 的最重要因素。在 20μl 反应体系中 , Taq 酶各反
应梯度之间均有显著差异。从图 2 反应结果均值与酶
量的关系图中可以看出 , Taq 酶活性过低 ,PCR 反应的
敏感性差 ,扩增的条带少 ,所能提供的信息少。酶量在
0150～1100 U 之间时 ,PCR 结果均值随酶量的增加而
递增 ,在 1100U 时 ,达到最高 ,继续增加酶量 ,均值下
降 ,故选择 1100U 作为 SRAP2PCR 反应体系中酶的最
佳浓度。
21212 　Mg2 + 浓度的影响 　Mg2 + 主要是通过改变聚合
酶的活性对 PCR 反应结果产生影响。对 Mg2 + 进行因
素内多重比较 ,结果表明 ,20μl 反应体系中 ,Mg2 + 的反
应梯度只有在 1150 mmolΠL 和 2100 mmolΠL 之间差异不
显著 , P 值为 01086 ,其余梯度之间差异都显著。从图
3 反应结果均值与 Mg2 + 浓度的关系图中可以看出 ,
Mg2 + 浓度在 1150～2100 mmolΠL 之间时 ,PCR 结果均值
图 2 　PCR 结果均值与 Taq 酶活性的关系
Fig. 2 　The relationship of Taq polymerase
concentration and the result of SRAP2PCR
随着 Mg2 + 浓度的增加而增加 ,在 2100～2150 mmolΠL
之间时 ,PCR 结果均值随 Mg2 + 浓度的增加而递减 ,在
2100 mmolΠL 时为最高。故在 20μl 反应体系中 ,选择
2100 mmolΠL 作为 SRAP2PCR 反应体系中 Mg2 + 的最佳
浓度。
图 3 　PCR 结果均值与 Mg2 + 浓度的关系
Fig. 3 　The relationship of Mg2 +
concentration and the result of SRAP2PCR
21213 　dNTP 浓度的影响 　dNTP 作为 PCR 反应的原
料 ,量太少会使扩增反应进行不完全 ,而用量过多会使
dNTP 分子中的磷酸基团定量地与 Mg2 + 结合 ,使实际
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反应中 Mg2 + 的浓度下降而影响聚合酶的活力。对
dNTP进行因素内多重比较 ,结果表明 ,20μl 反应体系
中 ,dNTP 的各反应梯度之间均有显著差异。从图 4 反
应结果均值与 dNTP 浓度的关系图中可以看出 ,dNTP
浓度在 0110～0120 mmolΠL 之间时 ,PCR 结果均值随着
dNTP 浓度的增加而递增 ,在 0120～0125 mmolΠL 之间时 ,
PCR结果均值随着 dNTP 浓度的增加而递减 ,在 0120
mmolΠL 时为最高。故在 20μl 反应体系中选择 0120
mmolΠL 作为 SRAP2PCR 反应体系中 dNTP 的最佳浓度。
图 4 　PCR 结果均值与 dNTP浓度的关系
Fig. 4 　The relationship between dNTP
concentration and the result of SRAP2PCR
21214 　引物浓度的影响 　引物浓度过低可能会无扩
增带 ,而浓度过高则会出现非特异性扩增 ,产生模糊小
片断和引物二聚体。对引物浓度进行因素内多重比
较 ,结果表明 ,20μl 反应体系中 ,引物的反应梯度只有
在 0140 和 0150μmolΠL 之间差异不显著 ,P 值为 01452 ,
其余梯度之间均有显著差异。从图 5 反应结果均值与
引物浓度的关系图中可以看出 ,引物浓度在 0120～
0140μmolΠL 之间时 ,PCR 结果均值随着引物浓度的增
加而递加 ,在 0140～0150 mmolΠL 之间时 , PCR 结果均
值随引物浓度的增加而递减 ,在 0140μmolΠL 时为最
高。故在 20 μl 反应体系中选择 0140 μmolΠL 作为
SRAP2PCR 反应体系中引物的最佳浓度。
图 5 　PCR 结果均值与引物的关系
Fig. 5 　The relationship of primer concentration
and the result between SRAP2PCR
21215 　模板 DNA 浓度的影响 　适宜模板量是保证特
异性扩增的前提 ,模板量过多会降低特异扩增效率 ,增
加非特异性产物。对模板 DNA 进行因素内多重比较 ,
结果表明 ,20μl 反应体系中 ,模板 DNA 的各反应梯度
均无显著差异。从图 6 反应结果均值与模板 DNA 的
关系图中可以看出 ,SRAP2PCR 反应对模板 DNA 浓度
要求的范围通常较宽 ,考虑节约模板与试验操作的准
确性 ,本试验采用模板 DNA 浓度为每 20μl 反应体系
60ng。
图 6 　PCR 结果均值与模板 DNA 的关系
Fig. 6 　The relationship of DNA concentration and
the result of SRAP2PCR
213 　SRAP2PCR 反应体系应用
根据以上试验结果确定的 SRAP2PCR 最佳反应体
系 ,对 35 份药用菊花种质材料进行 DNA 扩增 ,以检测
确定的 SRAP2PCR 反应体系的应用可靠性。结果如图
7 所示 ,从图 7 可看出 ,35 份药用菊花种质材料上都能
扩增出清晰、重复性好、多态性高的 DNA 谱带 ,表明已
确立的 SRAP2PCR 反应体系稳定可靠 ,可用于药用菊
花遗传多样性分析、种质资源鉴定等研究。
3 　讨论
目前在 SRAP2PCR 中使用 2 种扩增程序。第 1 种
由Li 等[1 ]提出 ,为让 2 个引物与 DNA 模板部分配对 ,
最初 5 个循环的退火温度设为 35 ℃,后 30 个循环的退
火温度升高为 50 ℃。当退火温度一直设为 35 ℃时 ,扩
增结果的重复性很差。第 2 种是Budak 等[15 ]所使用的
程序 :94 ℃变性 1 min ;47 ℃退火 1 min ;72 ℃延伸 1 min
(35 个循环) ;72 ℃,5 min。前者因为后 30 个循环中所
用退火温度比后者高 ,扩增结果更稳定。本试验中采
用第 1 种程序 ,获得了较理想的试验结果。
以往对 PCR 体系的优化试验 ,大多采用单因素梯
度试验来进行最佳水平的摸索 ,不能兼顾到各因素间
的交互作用 ,且多数单因素试验仅对扩增结果作直观
分析 ,并未进行统计分析 ,无从考察各组分不同水平对
扩增结果影响的差异显著性。本研究基于方差分析方
法 ,采用正交设计L16 (45 ) 对影响药用菊花SRAP2PCR
328　5 期 药用菊花 SRAP2PCR 反应体系的优化
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图 7 　35 份药用菊花种质 SRAP扩增的结果
Fig. 7 　The SRAP amplification results of the tested thirty five Chrysanthemum morifolium Ramat
1 :早小洋菊 ;2 :晚小洋菊 ;3 :大洋菊 ;4 :异种大白菊 ;5 :小汤黄 ;6 :小白菊 ;7 :红心菊 ;8 :大白菊 ;9 :长瓣菊 ;10 :黄菊 ;11 :大黄菊 ;12 :香溢菊 ;13 :金菊 1
号 ;14 :金菊 2 号 ;15 :金菊 3 号 ;16 :金菊 4 号 ;17 :早贡菊 ;18 :晚贡菊 ;19 :黄药菊 ;20 :小亳菊 ;21 :大亳菊 ;22 :特种亳菊 ;23 :怀小白菊 ;24 :怀大白菊 ;
25 :怀小黄菊 ;26 :滁菊 ;27 :济菊 ;28 :祁菊 ;29 :麻城菊 ;30 :中江菊 ;31 :甘野菊 ; 32 :紫花野菊 ;33 :毛华菊 ;34 :菊花脑 ;35 :野菊 ;M:为 pUC18
1 : C. morifolium‘Hangju’( Zaoxiaoyangju) ; 2 : C. morifolium‘Hangju’( Wanxiaoyangju) ; 3 : C. morifolium‘Hang ju’(Dayangju) ; 4 : C. morifolium‘Hangju’
( Yizhongdabaiju) ;5 : C. morifolium‘Hangju’(Xiaotang huang) ;6 : C. morifolium‘Hangju’(Xiaobaiju) ;7 : C. morifolium‘Hangju’( Hongxinju) ;8 : C. morifolium
‘Hangju’(Dabaiju) ;9 : C. morifolium‘Hangju’(Changbanju) ;10 : C. morifolium‘Hangju’(Huangju) ;11 : C. morifolium‘Hangju’(Dahuangju) ;12 : C. morifolium
‘Hangju’(Xiangyiju) ;13 : C. morifolium‘Hangju’(No 1 of jinju) ;14 : C. morifolium‘Hangju’(No 2 of jinju) ;15 : C. morifolium‘Hangju’(No 3 of jinju) ;16 : C.
morifolium‘Hangju’( No 4 of jinju) ; 17 : C. morifolium‘Gongju’( Zaogongju ) ; 18 : C. morifolium‘Gongju’( Wangongju ) ; 19 : C. morifolium‘Gongju’
(Huangyaoju) ;20 : C. morifolium‘Boju’( Xiaoboju) ; 21 : C. morifolium‘Boju’(Daboju) ; 22 : C. morifolium‘Boju’( Tezhongboju) ; 23 : C. morifolium‘Huaiju’
(Huaixiaobaiju) ;24 : C. morifolium‘Huaiju’(Huaidabaiju) ;25 : C. morifolium‘Huaiju’( Huaixiaohuangiju) ;26 : C. morifolium‘Chuju’;27 : C. morifolium‘Jiju’;
28 : C. morifolium‘Qiju’;29 : C. morifolium‘Machengju’;30 : C. morifolium‘Zhongjiangju’;31 : C. eticuspe ; 32 : D. zawadskii ;33 : D . vestitum ( Hemsl . ) Ling ;
34 : C. nankingense Hm ;35 : C. indicum L ; M. pUC18 marker
反应体系的 5 个因素 (模板 DNA , Taq 酶 ,Mg2 + ,dNTP ,
引物)在 4 个水平上进行优化 ,系统地研究了不同因素
和不同水平对 SRAP2PCR 的扩增结果影响 ,建立了药
用菊花 SRAP2PCR 反应体系 ,即在 20μl 的反应体系
中 ,模板 DNA 60ng , Taq 酶 1100U ,Mg2 + 2100 mmolΠL ,
dNTP 0120 mmolΠL ,引物 0140μmolΠL。所取得的结果包
含了更多的信息 ,且工作量较小 ,数据分析简易 ,并可
分析交互作用。但该方法也存在局限性 ,如对试验结
果本身的评价带有主观成分 ,打分的先后次序直接影
响分析结果 ,使影响因素最佳反应水平的确定缺乏可
靠性。如何建立对 PCR 扩增结果评判的客观标准 ,提
高试验结果的可信度和易操作性 ,对于促进 SRAP2PCR
技术的发展具有重要价值。另外 ,PCR 反应不是一个
孤立的部分 ,它和基因组 DNA 提取、聚丙烯酰胺凝胶
的制备、银染等步骤构成了一个有机的整体 ,它们每一
步的变化都会导致试验结果的差异。因此 ,在试验过
程中 ,严格遵守操作规范的同时 ,应灵活处理所遇到的
问题 ,适时调整试验条件 ,确保整个试验顺利进行。
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