全 文 ：文章编号 :100028551 (2009) 042612205
不利用香菇多糖的香菇单核菌株的选育
王淑敏　高玉千　戚元成　申进文　邱立友
(河南农业大学生命科学学院 ,河南 郑州　450002)
摘 　要 :以香菇 939 菌株的担孢子为材料 ,应用紫外线诱变得到 1 株不能利用香菇多糖的突变株 93925 ,
其菌落形态和生长速度与未突变 H型单核菌株相同 ,多糖产量比未突变 H 型单核菌株提高 3017 % ,比
双核菌株提高 1916 %。该菌株产香菇多糖的最适碳源是淀粉 ,氮源为酵母膏 ,培养基初始 pH 值为 610 ;
Mg2 + 对其产香菇多糖有显著的促进作用 ;高溶氧水平则对产香菇多糖有明显的抑制作用。这些产香菇
多糖的特性与已报道的香菇 939 菌株的 S1 型单核菌株相同。
关键词 :香菇 ;香菇多糖 ;单核菌株 ;诱变
SCREENING OF UNUSE LENTINAN MONOKARYONTIC STRAIN OF Lentinula edodes
WANG Shu2min 　GAO Yu2qian 　QI Yuan2cheng 　SHEN Jin2wen 　QIU Li2you
( College of Life Science , Henan Agricultural University , Zhengzhou , Henan 　450002)
Abstract :An monokaryontic strain mutant named 93925 , which would not use lentinan as C source , was breeded from
basidiospores of Lentinula edodes 939 by UV2irradiation. The colony morphological character and growth rate of the mutant was
same as natural H type monokaryontic strain of Lentinula edodes 939. Lentinan yield in flask2shaking fermentation of the
mutant was 3017 % 1916 % higher than that of natural H type monokaryontic strain and dikaryotic strain 939 , respectively.
The optimum C source and N source for producing lentinan of the mutant was starch and yeast extract . While the optimum
initial pH of fermentation medium was 610 , and Mg2 + could noticeably stimulate lentinan synthesization. Furthermore , high
dissolved oxygen could inhibit lentinan producing of the mutant . The character of producing lentinan in flask2shaking
fermentation of the mutant was similar to monokaryontic strain S1 of Lentinula edodes 939 reported previously.
Key words : Lentinula edodes ; lentinan ; monokaryontic strain ; mutation
收稿日期 :2009202225 　接受日期 :2009204202
基金项目 :河南省科技攻关项目 (0524040003)
作者简介 :王淑敏 (19802) ,女 ,河南安阳人 ,硕士 ,主要从事微生物工程研究。Tel : 037126355 5175 ; E2mail :minruilove @yeah. net
通讯作者 :邱立友 (19632) ,男 ,河南信阳人 ,教授 ,博士 ,主要从事微生物工程方面研究。Tel :037126355 5175 ; E2mail :qliyou @henau. edu. cn　　香菇 ( Lentinula edodes) 是世界上生产规模最大的食用菌之一。香菇细胞壁中的葡聚糖主要是带有β21 ,6 葡聚糖分枝的β21 , 3 葡聚糖 , 称为香菇多糖(lentinan ,LN) [1 ,2 ] 。研究发现 ,香菇多糖具有抗病毒、抗肿瘤和刺激干扰素形成等多种医疗保健功效[3 ,4 ] 。已有多种剂型如水针剂、冻干粉针剂、多糖片和口服液等获准临床应用。目前香菇多糖的生产主要是从香菇子实体中提取和利用香菇菌丝体深层发酵法生产 ,由于现有香菇菌种多糖产量低 ,导致香菇多糖生产成本高、产量小、价 格昂贵 ,远不能满足临床和保健需要。所以 ,应用遗传育种手段提高香菇菌种多糖产量十分必要[5 ] 。香菇中存在多种降解 LN 的水解酶 ,在菌丝生长、子实体形成和收获后降解 LN[6～8 ] ,是影响香菇菌种多糖产量的关键因素。选育不利用多糖的突变株可能是提高香菇菌种多糖产量的一条有效途径。食用菌的担孢子或单核菌丝是进行遗传育种的良好材料 ,本试验应用紫外线诱变香菇担孢子获得 1 株不利用 LN 且高产LN 的单核菌株 ,并对该菌株产 LN 的特性进行研究。
216　 核 农 学 报　2009 ,23 (4) :612～616Journal of Nuclear Agricultural Sciences
1 　材料与方法
111 　供试材料
香菇 939 ,由河南省农业科学院食用菌研究开发
中心提供。
112 　香菇多糖溶液的制备
取香菇 939 烘干子实体粉碎过 60 目筛 ,98 ℃热水
抽提 3h ,过滤后蒸发浓缩 10 倍 ,加 4 倍体积的 95 %乙
醇过夜 ,取出 ,5000rΠmin 离心 15min ,弃上清 ,沉淀用
85 %乙醇洗 2 次 (5000rΠmin 离心 10min) ,沉淀用热水
溶解即为粗多糖溶液[9 ] 。采用 Sevage 法[10 ] 脱除粗多
糖中的蛋白质 ,在粗多糖溶液中加入相同体积的氯仿
与正丁醇的混合液 (VΠV = 4∶1) ,震荡摇匀 ,使蛋白质
形成凝胶。5000rΠmin 离心 10min ,取上清即得纯多糖
溶液 ,经真空冷冻干燥保藏备用。
113 　培养基
PDA培养基 ( %) : 马铃薯 20 ,葡萄糖 210 ,琼脂
210 ,水 100ml ,pH 自然 ;完全培养基 ( %) :葡萄糖 210 ,
蛋白胨 012 ,MgSO4·7H2O 0105 ,KH2 PO4 01046 , K2 HPO4·
2H2O 011 ,琼脂 210 ,pH 515～610 ;香菇多糖唯一碳源
培养基 ( %) : 香菇多糖 210 , (NH4 ) 2 SO4 012 , MgSO4 ·
7H2O 0105 , KCl 0105 , KH2 PO4 0105 ,VB1 0112gΠL ,琼脂
210 ,pH 自然 ;液体发酵培养基 ( %) :黄豆粉 110 ,葡萄
糖 310 ,酵母粉 015 ,MgSO4·7H2O 0105 ,KH2 PO4 011 ,VB1
01005 ,pH 610。
114 　担孢子的收集与悬液制备
采用整菇孢子弹射法[11 ] 收集香菇 939 的担孢子。
取八成熟的菇体用 70 % 酒精进行表面揩擦消毒 ,再用
无菌水冲洗 3 次。将灭菌过的孢子采集器放入超净工
作台内 ,轻轻掀开钟罩 ,把消毒后的菇体迅速插在支架
上 ,菌褶向下并对正敞口的培养皿 ,随即盖好钟罩。用
纱布将钟罩下沿塞好 ,在纱布上倒少许无菌水保湿。
静置 24h 左右 ,待孢子散落在培养皿内形成一层白色
的孢子印 ,加少量无菌生理盐水制成孢子悬液 ,血球计
数板计数稀释到 106 个Πml。
115 　担孢子的紫外线诱变
取担孢子悬液 100μl 直接均匀涂布于直径 9cm、含
有 PDA 培养基的培养皿中 ,打开皿盖 ,紫外灯下分别
照射 0、30、60、90、120、150、180、210 和 240s ,取出用黑
布包好于 25 ℃避光培养 10d - 20d ,计算紫外线对孢子
的致死率。以致死率为 70 % 左右的照射时间进行担
孢子诱变育种 ,挑取单菌落接种于 PDA 斜面和香菇多
糖唯一碳源培养基斜面 ,选取在 PDA 培养基中生长而
在香菇多糖唯一碳源培养基中不生长的单菌落 ,镜检
无锁状联合 ,在 PDA 斜面中传代 5 次且均不能在香菇
多糖唯一碳源培养基中生长者 ,即为不利用香菇多糖
的单核突变株 ,液氮低温保藏备用。
116 　摇瓶发酵培养与多糖含量测定
015L 三角瓶装入 011L 液体发酵培养基 ,接入直
径为 1cm 的单核菌株 PDA 平板培养物 ,每个处理重复
3 瓶。25 ℃、150rΠmin 摇床培养 18d ,采用苯酚2浓硫酸
法[12 ]测定培养液和菌丝体中总的多糖含量。分别进
行突变株的传代稳定性和不同碳源、不同氮源、不同金
属离子、培养基不同起始 pH 值及不同装液量对突变
株产多糖的影响试验。
2 　结果与分析
211 　紫外线对香菇担孢子的致死作用
对香菇 939 担孢子进行 0、30、60、90、120、150、180、
210 和 240s 等不同时间的紫外诱变 ,计算致死率 ,绘出
致死曲线如图 1。由图 1 可知 ,当诱变时间为 90S 时致
死率为 70 %。
图 1 　香菇 939 担孢子紫外线诱变致死曲线
Fig. 1 　Lethal curve of basidiospore of Lentinus
edodes 939 by UV2irradiation
212 　不利用LN 的单核菌株的诱变选育
从 UV 照射 90s 的平板中挑取生长的单菌落 ,接种
于香菇多糖唯一碳源培养基斜面 ,在该斜面中不能生
长的即为不能利用LN 的突变株 ,其中编号为 93925 的
菌株经在 PDA 斜面中传代 5 次均不能在香菇多糖唯
一碳源培养基中生长 ,镜检无锁状联合 ,在 PDA 平板
上培养 10d 后按申进文等[13 ] 报道的方法进行菌落形
态观察 ,该菌株菌丝绒毛状 ,气生菌丝明显 ,菌丝洁白、
均匀 ,属于绒毛气生型 ( H 型) 。该突变株在 PDA 平板
316　4 期 不利用香菇多糖的香菇单核菌株的选育
中的菌落生长速度是 0128cmΠd ,与未发生变异的 H 型
菌株相同 ,但明显低于双核菌丝生长速度 ,后者的生长
速度是 0167cmΠd。
213 　突变株 93925 产LN 的传代稳定性
将突变株 93925 在 PDA 斜面中传代 5 次 ,分别接
入液体发酵培养基摇瓶培养 18d ,测定发酵液中 LN 的
含量 ,结果见表 1。从表 1 可以看出 ,突变株 93925 LN
产量稳定 ,传代 5 次产多糖量平均值是 130314mgΠL ,显
著高于未变异 H 型单核菌株和双核菌丝 ( p < 0101)
(表 2) , LN 产量分别比后二者提高了 5917 % 和
4814 %。表明不利用LN 突变株LN 产量显著提高。
表 1 　不利用 LN单核突变株 93925 摇瓶发酵产 LN的传代稳定性试验结果
Table 1 　Passage stability of LN yield in flask2shaking fermentation by monokaryontic mutant 93925 of Lentinula edodes
传代次数
passage number
第一代
1st
第二代
2nd
第三代
3rd
第四代
4th
第五代
5th
平均值±标准差
average ±SE
突变株 93925 128211 131815 146315 133611 111616 130314 ±12418A
未突异 H型单核菌株 81813 87016 79612 83712 75812 81611 ±4213B
双核菌丝 939 82217 97913 81815 89219 87615 87810 ±6514B
214 　发酵条件对突变株 93925 产LN 的影响
21411 　不同碳源对 93925 突变株产 LN 的影响 　分别
用 3 % 的蔗糖、麦芽糖和淀粉代替液体发酵培养基中
的葡萄糖 ,以观察不同碳源对单核突变株 93925 液体
发酵产LN 的影响 ,结果见图 2。从图 2 可以看出 ,在
包括葡萄糖在内的 4 种碳源中 ,突变株 93925 以淀粉
为碳源时LN 产量最高 ,达到 150611mgΠL ,显著高于其
他 3 种碳源 ( p < 0105) 。
图 2 　碳源对单核突变株 939 - 5 产 LN 的影响
Fig. 2 　Effect of C sources on LN yield of monokaryontic
mutant 93925 in flask2shaking fermentation
21412 　不同氮源对 93925 突变株产 LN 的影响 　分别
用 115 % 的酵母膏、黄豆粉 + 酵母膏、蛋白胨、硝酸铵
和氯化铵作氮源代替液体发酵培养基中的氮源 ,观察
不同氮源对单核突变株 93925 液体发酵产 LN 的影响。
从图 3 可以看出 ,4 种氮源中 ,突变株 93925 以酵母膏
为氮源时LN 产量最高 ,达到 155418mgΠL ,显著高于其
他 3 种碳源 ( p < 0101) 。
21413 　金属离子对 93925 液体发酵产 LN 的影响 　在
液体发酵培养基中分别添加 5 种浓度均为 0115 %的金
属离子 K+ 、Mg2 + 、Fe2 + 、Fe3 + 和 Ca2 + ,以试验对突变株
产多糖的影响。结果显示 (图 4) ,Mg2 + 对突变株 93925 图 3 　氮源对单核突变株 93925 产 LN 的影响Fig. 3 　Effect of N sources on LN yield of monokaryonticmutant 93925 in flask2shaking fermentation产多糖有较大的促进作用 ,LN 产量高达 1663150mgΠL ,显著高于其他 4 种离子 ( p < 0101) 。K+ 对突变株 93925 产多糖有一定的促进作用 ,而 Ca2 + 、Fe2 + 和 Fe3 + 对产多糖则表现出一定的抑制作用。21414 　培养基初始 pH 值对突变株 93925 液体发酵产LN 的影响 　将液体发酵培养基的初始 pH值分别调至310、410、510、610、710 和 810 ,观察培养基初始 pH 值对突变株 93925 产 LN 的影响。结果表明 ,突变株 93925产LN 的最适初始 pH 是 610 ,pH 值偏酸 (pH 值为 3 和4)或中性偏碱 (pH值为 7 或 8)时 ,LN 产量显著下降 ( p< 0105) (图 5) 。21415 　不同装液量对突变株 93925 液体发酵产 LN 的影响 　015L 三角瓶分别装入 01025、01050、01100、01150 和 01200L 液体发酵培养基 ,观察发酵液溶氧浓度对 93925 产LN 的影响 ,结果如图 6 所示。从图 6 可见 ,装液量为 01150 和 01200L 时 LN 产量最高 ,可达
416 核　农　学　报 23 卷
图 4 　金属离子对单核突变株 93925 产 LN 的影响
Fig. 4 　Effect of metal ion on LN yield of monokaryontic
mutant 93925 in flask2shaking fermentation
图 5 　pH对单核突变株 93925 产 LN 的影响
Fig. 5 　Effect of pH on LN yield of monokaryontic
mutant 93925 in flask2shaking fermentation
1582110mgΠL 和 1588150mgΠL ,显著高于 01025～ 01100L
(p < 0105) 。表明高溶氧水平对 93925 产糖有明显的
抑制作用。
图 6 　装液量对单核突变株 93925 产 LN 的影响
Fig. 6 　Effect of medium volume on LN yield of
monokaryontic mutant 93925 of Lentinula edodes
in flask2shaking fermentation
3 　讨论
由于现有香菇菌种多糖产量低 ,不论是从香菇子
实体中提取还是液体发酵生产都难以达到工业化生产
的需要 ,应用遗传育种手段提高香菇菌种多糖产量十
分必要[14 ] 。陈琼华等[15 ] 应用紫外线诱变香菇原生质
体的方法获得 1 株LN 高产突变株。汪志平等[16 ] 以甲
基磺酸乙酯 ( EMS)和60 Coγ射线复合诱变钝顶螺旋藻
单细胞或原生质球 ,获得多个高产多糖新品系。以香
菇担孢子为材料选育 LN 高产菌株尚未见报道。本试
验表明 ,单细胞单核的香菇担孢子适合进行紫外线诱
变育种。
选育不利用目标产物的突变株是代谢工程育种获
得高产目标产物的有效方法 ,且在多种氨基酸如谷氨
酸、色氨酸和苏氨酸等的发酵中都获得了成功[17 ] 。本
研究通过选育不利用 LN 为唯一碳源的突变株得到 1
株稳定高产LN 的香菇单核突变株 93925 ,LN 产量比未
变异的相同菌落类型 H 型的单核菌株高 3017 % ,比其
双核菌株 939 高 1916 %。突变株 93925 不能利用 LN
可能是β21 ,32葡聚糖酶基因发生突变失去活性。尽管
在高等真菌菌丝生长和子实体形成过程中β2葡聚糖的
降解是必不可少的[18 , 19 ] ,然而 ,香菇单核突变株 93925
菌丝生长和 LN 合成没有受到影响 ,这种现象也同样
发生在不能利用色氨酸为唯一碳源或氮源而高产色氨
酸的菌株中 ,由于不能利用色氨酸 ,理论上说蛋白质便
不能合成 ,但是该菌株确能高产色氨酸[17 ] 。因此 ,在
生物体内可能存在着多种补偿途径 ,当其中一条途径
受阻时 ,另一条途径开始起作用 ,以消除对生长的影
响。但是β21 ,32葡聚糖酶基因发生突变是否影响子实
体的形成还有待进一步研究。
对香菇单核突变株 93925 产 LN 的生物学特性的
研究表明 ,该菌株产LN 的最适碳源是淀粉 ,氮源是酵
母膏 ,培养基初始 pH值为 610 ,Mg2 + 对其产LN 有显著
的促进作用 ,高溶氧水平对产 LN 有明显的抑制作用 ,
与前文[13 ]报道的香菇 939 菌株的 S1 型单核菌株产 LN
特性相同而与其双核菌丝有差别。表明突变株 93925
不利用LN 的突变对其产LN 可能没有影响。
担孢子是单细胞、单核、单倍体 ,基因变异能够表
达出来 ,不受等位基因的影响。担孢子形成过程中减
数分裂时亦可发生基因重组 ,导致担孢子某些基因发
生变异而表现出与亲本不同的性状。所以 ,本研究得
到的 93925 单核菌株不利用香菇多糖的特性可能是由
于紫外线诱变的结果 ,也可能是减数分裂过程中基因
重组的结果 ,有待进一步研究。
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