全 文 ：热带亚热带植物学报　2013， 21(3)： 247~252
Journal of Tropical and Subtropical Botany
收稿日期： 2012–11–14　　　　接受日期： 2013–02–04
基金项目： 国家自然科学基金项目(30760114)； 中国热带农业科学院橡胶研究所基本科研业务费项目(1630022011002)； 国家天然橡胶产业技
术体系育种项目(CRAS-34)资助
作者简介： 周斌辉(1986 ~ )，男，硕士研究生。E-mail: zhoubinhui@126.com
* 通讯作者 Corresponding author. E-mails: chaorongtang@126.com; crtang0527@hotmail.com
蔗糖作为大多数高等植物光合作用的主要产
物，为植物提供了能量来源和生物大分子合成的原
料[1]。蔗糖自身溶解度高，粘度底，非还原性的理
化性质使其能够经过韧皮部的长距离运输，从源到
巴西橡胶树HbSUT3和HbSUT5 mRNA在嫩茎和中
脉中的原位杂交分析
周斌辉1,2, 秦云霞2, 周率2, 唐朝荣2*
(1. 海南大学农学院，海口 570288； 2. 中国热带农业科学院橡胶研究所，海南 儋州 571737)
摘要： 为研究巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)中 HbSUT3 和 HbSUT5 基因的功能，采用地高辛标记的 RNA 探针与橡胶树嫩茎和
中脉两种组织切片分别进行 RNA 原位杂交，对这 2 种 SUT 基因在组织中的表达区域与表达特点进行了分析。结果表明，在橡
胶树嫩茎中，两个 SUT 基因主要在树皮的韧皮部和皮层细胞中表达；在中脉中，两个 SUT 基因在除木质部导管系统外的其它部
位均有表达；HbSUT3 基因在嫩茎和中脉中的表达量相近，而 HbSUT5 基因在嫩茎中的表达量远高于中脉。这些揭示 HbSUT3
和 HbSUT5 基因可能广泛参与韧皮部装载、蔗糖运输与库细胞供给等活动，同时两个 SUT 基因也存在功能分化。
关键词： 巴西橡胶树； HbSUT3； HbSUT5； RNA 原位杂交； 表达模式
doi: 10.3969/j.issn.1005–3395.2013.03.010
In situ Hybridization Analysis of HbSUT3 and HbSUT5 mRNAs in
Young Stems and Midribs of Hevea brasiliensis
ZHOU Bin-hui1,2, QIN Yun-xia2, ZHOU Lü2, TANG Chao-rong2*
(1. College of Agronomy, Hainan University, Haikou 570228, China; 2. Rubber Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural
Sciences, Danzhou 571737, China)
Abstract: In para rubber tree (Hevea brasiliensis), HbSUT3 plays the role of key sucrose transporter (SUT) in
sucrose loading into laticifers and rubber productivity, whereas HbSUT5 is putatively involved in the regulation
of sucrose loading into laticifers. To further investigate the functions of the two SUT genes, digoxigenin-labeled
cRNA probes were prepared, and used by in situ hybridization to detect the distribution patterns of HbSUT3 and
HbSUT5 mRNAs in tissues of rubber young stems and midribs. The results showed that the two SUT genes were
mainly expressed in phloem and cortex of barks in young stems, whereas they were expressed in all tissues of
midribs except for xylem. The expressions of HbSUT3 were similar between young stems and midribs, while the
expression of HbSUT5 in young stems was much higher than that in midribs. It was suggested that HbSUT3 and
HbSUT5 could involve in activities, such as phloem loading, sucrose transportation and supply to sink cells, and
they also had functional differentiation.
Key words: Hevea brasiliensis; HbSUT3; HbSUT5; RNA in situ hybridization; Expression pattern
248 第21卷热带亚热带植物学报
达库，为不同的组织所利用[2]。蔗糖可以通过共质
体途径和质外体途径两种方式进出韧皮部筛管分
子。共质体途径主要是通过胞间连丝装卸，蔗糖无
需经过跨膜过程。而质外体途径的运输中，蔗糖主
要依赖于质膜上的蔗糖转运蛋白(SUT)的主动运输
装卸，因此 SUT 在蔗糖转运过程中起着极为重要
的作用[3]。在巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)中，蔗
糖是乳管系统进行新陈代谢、维持正常生理功能，
尤其是合成天然橡胶的所需原料[4]，在乳管中经过
一系列酶促反应后合成橡胶，因此蔗糖与橡胶树的
产胶能力密切相关。但是，由于乳管与周围薄壁
细胞之间缺乏胞间连丝介导的共质体运输途径，
因此胶乳合成所需蔗糖必须依赖于 SUT 基因介导
的跨膜转运。阳江华等[5]从巴西橡胶树中克隆了
6 个 SUT 基因，分别命名为 HbSUT1、HbSUT2A、
HbSUT2B、HbSUT3、HbSUT4 和 HbSUT5。 国 内
外的相关基因表达与功能分析研究表明，HbSUT3
(= HbSUT1B)基因是橡胶树中决定乳管蔗糖供给的
关键 SUT 基因[6–7]，而 HbSUT5 基因可能参与对乳
管蔗糖供给能力的调控[8–9]。
RNA 原位杂交技术具有安全、稳定、实验周期
短的特点，在动植物基因的组织、细胞表达分析中
应用广泛，是基因功能解析的重要技术之一。该技
术是利用非放射性的生物素(BIO)和地高辛(DIG)
或放射性的同位素(32P)标记单链反义 RNA 探针，
与组织或细胞中特定基因的 mRNA 发生杂交，通
过反义探针定位的分布检测特定基因的表达区
域[10]。本文利用 RNA 原位杂交技术分析 HbSUT3
和 HbSUT5 基因的 mRNA 在橡胶树嫩茎和主中脉
两种组织中的表达区域及表达特点，为进一步研究
这些基因的功能提供科学参考。
1 材料和方法
1.1 材料
巴 西 橡 胶 树(Hevea brasiliensis)品 系 为‘热 研
7-33-97’，定植于中国热带农业科学院橡胶研究所
的苗圃，于 2011 年 4 月采集巴西橡胶树新生的嫩
茎和叶片两种幼嫩组织。pGEM-T Easy 载体购自
Promega 公 司，Taq DNA 聚 合 酶 和 DNA Marker
购 自 TIANGEN 公 司 , 大 肠 杆 菌(Escherichia coli)
DH-5α 菌株和橡胶树胶乳 cDNA 为本实验室保存。
DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)购自罗氏公司，其
他试剂购自 Sigma 公司。引物合成和 DNA 测序均
由上海 Invitrogen 贸易有限公司负责完成。
1.2 材料处理
样品采集　　用剪刀剪取巴西橡胶树新鲜的
嫩茎和叶片，用新刀片将嫩茎横切成 1 cm 左右的
小段；用刀片沿着叶片中脉两边 5 mm 处纵切，将
长条状的中脉切成 1 cm 左右的小段，用纸擦净样
品流出的胶乳。
切片制备　　以预冷的 4% 多聚甲醛固定材
料， 4℃过夜(12 ~ 16 h)。利用常规方法对材料进行
脱水、透明、浸蜡及包埋处理[11–14]。切片用 DEPC-
H2O 在 45℃下展片、贴片，于 42℃烘烤过夜
[15–16]。
标记探针的制备　　采用 DNAMAN 软件分
析 HbSUT3 和 HbSUT5 基因的 cDNA 全长序列，选
择同源性低的序列作为模板设计引物，用于探针片
段的扩增。HbSUT3 和 HbSUT5 基因探针扩增所
用的引物对分别为 in situ P3-F (5′-CAAATCCGAC-
CCAACTATGTACAAAACCACCTCT-3′)和 in situ
P3-R (5′-TCTAAGCTTGCTTGAAGCGGGTGGT-
GGAGGAACT-3′)、in situ P5-F (5′-ACGGGTGGAA-
ACCAAAGTGAGT-3′)和 in situ P5-R (5′-GGTGGT-
CTAGCCCTGGCTCGGT-3′)。以橡胶树胶乳 cDNA
为模板进行 PCR 扩增，将扩增产物纯化回收后克
隆到 pGEM-T Easy 载体上，送公司测序验证后提
取重组质粒 pGEM-SUT3 和 pGEM-SUT5。
分 别 以 构 建 的 pGEM-SUT3 和 pGEM-SUT5
重 组 质 粒 为 模 板，用 载 体 特 异 性 引 物 RV-M (5′-
GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′) 和 M13-
47 (5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′) 进
行 PCR 扩增，获得包含 SP6 和 T7 RNA 聚合酶识
别启动子的探针模板片段。扩增产物用酚氯仿抽
提、异丙醇和醋酸钠冰浴沉淀回收[17]，取 1 μL 回收
产物进行凝胶电泳来检测模板浓度。
RNA 探针制备　　参照 Roche 公司地高辛标
记试剂盒的说明书，具体操作步骤如下：以地高辛
标记的 NTP 为原料，分别用 T7 RNA 聚合酶及 SP6
RNA 聚合酶转录出两条互补的双向探针，其中与
mRNA 互补的为反义探针。标记体系为：2 μL 10 ×
NTP；2 μL 10 × 转 录 Buffer；1 μL RNA 酶 抑 制 剂
(20 U)；2 μL RNA 聚合酶(SP6 或 T7)；2 μL DNA 探针
模板片段，补水至 20 μL 后混匀。37℃温育 2 ~ 3 h
后加 2 μL DNase I 于 37℃水浴 30 min 消化模板
第3期 249
DNA 片段。加 2 μL 0.5 mol L–1 EDTA (pH 8.0)终止
反应，取探针和 RNA Marker(试剂盒中自带)各 1 μL
进行 1.5% TBE 凝胶电泳检测浓度。
1.3 RNA原位杂交
预杂交　　将干燥的石蜡切片在二甲苯中
脱蜡 2 次，每次 30 min，在二甲苯 ： 乙醇(1 ： 1)、
100%、 95%、 70%、 30% 乙醇、 DEPC-H2O 中复水，
每 级 2 min。0.2 mol L–1 HCl 中 处 理 20 min 后 在
2 × SSC 中 70℃孵育 15 ~ 20 min，用蛋白酶 K(终
浓度为 10 μg mL–1)于 37℃消化 30 min，4% 多聚
甲醛再固定 10 min。依次在 100 mL 的 3 × PBS、
100 mL 的 1 × PBS、500 mL 的 0.1 mol L–1 三乙醇
胺(pH 8.1)中室温孵育 5 min，在三乙醇胺中加入
1.24 mL 乙酸酐，混匀后再孵育 5 min。重复 1 次后
室温用 500 mL 2 × SSC 清洗载玻片 2 min。再经
30%、 50%、 70%、 95%、 100% 乙醇梯度脱水，每次
2 min，室温晾干。每张片子滴加 100 μL 预杂交缓
冲液(不加探针)， 45℃避光温育 2 h[18]。
杂交　　去除杂交缓冲液，每张片子取 5 μL
探针用甲酰胺稀释至 30 μL， 70℃变性 10 min 后立
即冰浴。加入 30 μL 2 × 杂交缓冲液后将混合液滴
加在载玻片上，轻轻地盖上杂交片。置于湿盒内于
60℃杂交过夜(12 ~ 16 h)[19]。
杂交后处理和封阻反应　　杂交后的载玻片
于 2 × SSC 中清洗去除杂交片。置于含有 50% 甲
酰胺的 2 × SSC 中漂洗(50℃, 20 min, 2 次) → 2 ×
马来酸缓冲液室温清洗 15 min → 0.5 × 马来酸清洗
缓冲液 65℃清洗 1 h → 1% 封闭液室温封闭 1 h →
把载玻片放在 0.1% 封闭液中室温清洗 5 min。用
0.1% 封闭液按 1 ： 500 稀释 Anti-Digoxigenin-AP，
每张载玻片滴加 60 μL 抗体混合液，轻轻盖上杂交
片。置于湿盒中室温孵育 2 h 或 4℃ 12 h(过夜)[20–21]。
显色反应　　用 0.1% 封闭液室温清洗 15 min
去除杂交片。换新的 0.1% 封闭液室温清洗 1 h，
重复 3 次。加显色缓冲液(Tris-HCl 100 mmol L–1；
NaCl 150 mmol L–1；MgCl2 50 mmol L
–1；10% PVA；
pH 9.5)室温预处理 15 min。在 1 mL 显色缓冲液中
加 40 μL NBT/BCIP 混合液，混匀后每张片子滴加
60 μL 显色液，置于湿盒中室温避光孵育 3 h 或更
久直到显色完成。然后用 0.5 mol L–1 EDTA 终止
显色反应，再用 ddH2O 清洗去除杂交片
[22–23]。
封片及观察　　将切片置于灭菌的双蒸水中
清洗干净后用 50% 甘油封片。在 Leica 光学显微
镜下进行观察和拍照，组织切片内的蓝紫色沉淀为
阳性反应。
2 结果和分析
2.1 DNA探针模板的扩增
以巴西橡胶树胶乳 cDNA 为模板，通过 PCR
扩 增 得 到 HbSUT3 和 HbSUT5 两 个 SUT 基 因 的
DNA 探针片段(图 1: A,B)。将该探针片段克隆到
pGEM-T Easy 载体上，转化大肠杆菌感受态细胞
DH-5α，通过测序确定携带正确插入片段的阳性克
隆，并提取重组质粒 pGEM-SUT3 和 pGEM-SUT5。
以这两个质粒为模板，分别用载体引物 RV-M 和
M13-47 进行扩增，得到两端分别含有 T7 和 SP6 启
动子序列的探针模板 HbSUT3-T 和 HbSUT5-T，取
1 μL 回收产物进行凝胶电泳检测(图 1: C)，电泳图
中有两条单一条带，表明回收产物具有较高的纯
度，符合原位杂交探针制备的要求。
2.2 RNA探针的制备
按照 DIG RNA Labeling Kit 说明书配制探针
转录体系，于 37℃反应 3 h 后加 2 μL DNase I 消
化 DNA 探针片段 30 min，再加入 2 μL 0.5 mol L–1
EDTA (pH 8.0)终止反应。用甲酰胺稀释 5 倍后取
探 针 2.5 μL 与 RNA Marker 1 μL 用 1.5% TBE 凝
胶 电 泳 检 测(图 1: D)，其 中 RNA Marker 浓 度 为
100 ng μL–1，根据亮度对比推测目的探针浓度约为
40 ng μL–1。从图 1: D 可见，RNA 探针的电泳条
带清晰，无弥散现象，表明制备的探针没有被降解，
可以进行后续实验。
2.3 HbSUT3和HbSUT5在嫩茎和中脉中的表达
用反义 RNA 探针与橡胶树两种组织切片进行
杂交，结果表明原位杂交质量较好，细胞轮廓清楚，
有明显的阳性信号——紫红色或蓝紫色沉淀物，而
且在组织中的不同部位的细胞中信号存在明显差
异；而正义 RNA 探针与切片杂交后组织细胞中没
有出现明显的紫红色或蓝紫色沉淀物，只有一些较
弱的背景信号。进一步分析表明，在嫩茎中两个
SUT 基因的转录产物主要分布于树皮中，特别是树
皮的韧皮部和皮层细胞，而其他部位包括木质部中
都没有明显的阳性信号(图 2: A,C)；在中脉中，两个
周斌辉等：巴西橡胶树HbSUT3和HbSUT5 mRNA在嫩茎和中脉中的原位杂交分析
250 第21卷热带亚热带植物学报
SUT 基因表达的部位比较广泛，除木质部导管系统
外的其它部位均有表达(图 2: I,K)。此外， HbSUT3
基因在嫩茎中的杂交信号较强(图 2: E)，在中脉中的
信号相对较弱且阴性对照背景较深(图 2: M,N)；而
HbSUT5 基因在嫩茎和中脉中的表达量相差不大，
嫩茎(图 2: G)中的杂交信号比中脉(图 2: O)中的略
强，同时中脉的阴性对照(图 2: P)的背景比较深。
3 讨论
研究基因的表达模式是探索基因功能的一个
重要环节，RT-PCR 技术可以在分子水平检测特定
基因在不同组织和不同时期的表达情况，但是若要
确定基因在显微或亚显微水平上的时空表达模式，
RNA 原位杂交技术是一种非常重要和有效的手段。
该技术经常被用于检测动物或植物某种组织中特
定基因 mRNA 的分布状况[24] 。黄德宝[8]利用半定
量 RT-PCR 分析了 6 个 SUT 基因的组织表达特性，
认为 HbSUT3 和 HbSUT5 是巴西橡胶树树皮中表
达丰度较高的两个 SUT 基因，而本文采用 RNA 原
位杂交技术进一步研究了它们在橡胶树嫩茎和中
脉两种组织中的表达区域及表达量。结果表明(图
2)，在嫩茎中两个 SUT 基因主要在韧皮部和皮层细
胞中表达，而在中脉中两个 SUT 基因的表达部位
比较广泛，除木质部导管系统外均有表达；同时，在
嫩茎组织中 HbSUT3 基因的表达量比 HbSUT5 基
因高。此外，就同一种 SUT 基因在不同组织中表
达的比较来看，HbSUT5 基因在嫩茎中的表达量高
于中脉，主要在嫩茎中表达；而 HbSUT3 基因在嫩
茎中的表达量比中脉略高。这些结果，不仅与已有
研究[8]结果相符，同时进一步明确了两个 SUT 基因
在组织中的表达区域。HbSUT3 和 HbSUT5 在巴西
橡胶树嫩茎和中脉组织的多个部位细胞中均有表
达信号，反映它们的生理功能可能具有多样性，可
能广泛参与巴西橡胶树中蔗糖的韧皮部装载、运输
与库细胞(例如乳管细胞)供给等多种活动，这在其
它植物 SUT 基因的研究中亦有类似报道[4]。最近，
Dusotoit-Coucaud 等[6]报道 SUT1 类基因(HbSUT1 和
HbSUT3)主要在巴西橡胶树树皮的软皮中表达，而
在木质部无表达信号，这也与本文研究结果相似。
在 正 常 割 胶 的 巴 西 橡 胶 树 中，Tang 等[7]与
Dusotoit-Coucaud 等[25]均证明 HbSUT3 基因是决定
采胶部位——茎干树皮中乳管细胞蔗糖供给的关
键 SUT 基因。本研究结果表明(图 2)，在橡胶树嫩
茎的韧皮部中 HbSUT3 基因的表达信号比 HbSUT5
强，且嫩茎中的初生乳管细胞正是分布在韧皮部
中[26]，推测它们共同参与嫩茎中初生乳管细胞的发
育与产胶调控，同时进一步证明 HbSUT3 基因是乳
管细胞蔗糖供给的关键基因。
割胶明显影响采胶部位树皮的解剖结构，特别
是影响乳管的分化和发育，从而显著促进产胶与排
胶[27]，进一步利用 RNA 原位杂交技术分析正常割
胶树采胶部位树皮中这两个 SUT 基因的表达区域
与表达特点，有助于深入研究相应 SUT 基因在胶乳
再生调控中的功能，以及对橡胶树生产调控的应答
特点，这还有待于进一步的研究。
图 1 原位杂交探针的制备。A. HbSUT3 基因探针模板的扩增； B. HbSUT5 基因探针模板的扩增； C. 带 T7 和 SP6 启动子序列的 HbSUT3
和 HbSUT5 探针模板的扩增。1. HbSUT3； 2. HbSUT5; A ~ C: M = 100 bp DNA Ladder; D. RNA 探针检测。1. HbSUT3 的正义 RNA 探针； 2.
HbSUT3 反义 RNA 探针； 3. HbSUT5 的正义 RNA 探针； 4. HbSUT5 的反义 RNA 探针；M 为 RNA 分子量标准，箭头示目标扩增条带。
Fig. 1 Preparation of probes for in situ hybridization. A. Amplification of HbSUT3 probe template; B. Amplification of HbSUT5 probe template; C.
Amplification of HbSUT3 (1) and HbSUT5 (2) probe templates with T7 and SP6 promoter sequence; D. Detection of RNA probes. 1,2. Sense and
antisence probes of HbSUT3, respectively; 3,4. Sense and antisence probes of HbSUT5, respectively. M show 100 bp DNA ladder in A – C, and RNA
standard in D. The arrowheads in A – C indicate target bands.
第3期 251
致谢　　感谢中国科学院遗传与发育生物学研究所周奕华
研究员在实验过程中给予的技术指导。
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图 2 HbSUT3 和 HbSUT5 基因转录产物在橡胶树嫩茎和中脉中的原位杂交。嫩茎(A, B, C, D, E, F, G, H)和中脉(I, J, K, L, M, N, O, P)的横切片
分别用反义探针(HbSUT3 基因，A, E, I, M； HbSUT5 基因，C, G, K, O)和正义探针(HbSUT3 基因，B, F, J, N； HbSUT5 基因，D, H, L, P)杂交。
E, F, G, H, M, N, O, P 分别是 A, B, C, D, I, J, K, L 中黑色方框部分的放大。E、 G、 M、 O 中箭头所指是反义探针杂交呈现的部分阳性信号位置，
呈现蓝紫色沉淀；F、 H、 N、 P 中箭头所指的是与阳性信号相同部位的正义探针杂交结果。Cp. 皮层； Cz. 形成层； Mp. 髓状组织； Ph. 韧皮部；
Sc. 厚壁组织 ; X-y. 木质部。探针浓度为 3 ng μL–1。
Fig. 2 In situ hybridization (ISH) of HbSUT3 and HbSUT5 transcripts in young rubber stem and midrib. Transversal sections (young stem: A, B, C,
D, E, F, G, H; midrib: I, J, K, L, M, N, O, P) were hybridized with antisense (HbSUT3, A, E, I, M; HbSUT5, C, G, K, O) or sense (HbSUT3, B, F, J,
N; HbSUT5, D, H, L, P) probes. Transcripts of HbSUT3 and HbSUT5 are presented blue-purple precipitate. The images of E, F, G, H, M, N, O and
P magnified rectangle regions in images of A, B, C, D, I, J, K, and L, respectively. Sense probe control was used to indicate unspecific background
signaling. Cp. Cortical parenchyma; Cz. Cambium zone; Mp. Medullar parenchyma; Ph. Phloem; Sc. Sclerenchyma; X-y. Xylem vessel. The red
arrowheads indicate the positive (E, G, M, O) and negative (F, H, N, P) signal of ISH. The probe concentration was 3 ng μL–1.
周斌辉等：巴西橡胶树HbSUT3和HbSUT5 mRNA在嫩茎和中脉中的原位杂交分析
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