全 文 ：石榴(Punica granatum L.)为石榴科(Punicaceae)
石榴属落叶灌木或小乔木，果实酸甜可口，含有丰
富的天然活性物质，具有较高的保健价值[1]。籽粒
硬度是石榴品质的一项重要指标，直接影响着口感
和可食率，硬籽石榴籽粒较硬，可食用部分少，软籽
石榴核软可食，深受消费者喜爱。目前对石榴籽粒
硬度的研究主要集中在品种的划分上，Abdolkarim
等[2]通过破坏性试验测定石榴籽粒硬度，将其分为
热带亚热带植物学报　2015， 23(1)： 65 ~ 73
Journal of Tropical and Subtropical Botany
收稿日期： 2014–05–07　　　　接受日期： 2014–07–20
基金项目： 国家自然科学基金项目(30900971)资助
作者简介： 张水明，博士，副教授，主要从事园艺植物种质资源与生物技术研究。
* 通信作者 Corresponding author. E-mail: zhangshm893@sohu.com
石榴种皮总木质素含量及PgCOMT基因的克隆与
表达
张水明*, 龚凌燕, 曹丹琴, 张永娟, 杨健
(安徽农业大学园艺学院，合肥 230036)
摘要： 为探讨石榴(Punica granatum L.)籽粒硬度与种皮总木质素含量的相关性及种皮 COMT 基因的表达方式，利用 Texture
Analyser 质构仪和巯基乙酸法测定 6 个品种的成熟籽粒硬度及种皮总木质素含量。结果表明，6 个石榴品种的籽粒硬度与种
皮总木质素含量呈正相关，相关系数为 0.9246。采用 RACE 技术从石榴种皮中克隆得到 1 条长度为 1456 bp 的 PgCOMT 基因
cDNA 序列(GenBank 登录号为 KJ713968)。实时荧光定量 PCR 分析表明，PgCOMT 在‘红玉石籽’、‘粉皮’、‘会理软籽’、‘蒙
自甜’和‘突尼斯软籽’石榴种皮中的相对表达量与石榴籽粒硬度较为一致；随着石榴种皮的发育其表达量先下降后上升。这为
深入了解石榴软籽性状的产生机理奠定了基础。
关键词： 石榴； 籽粒硬度； 木质素； COMT 基因； 基因表达
doi: 10.11926/j.issn.1005–3395.2015.01.010
Total Lignin Content in Pomegranate Seed Coat and Cloning and
Expression Analysis of PgCOMT Gene
ZHANG Shui-ming*, GONG Ling-yan, CAO Dan-qin, ZHANG Yong-juan, YANG Jian
(College of Horticulture, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China)
Abstract: In order to understand the correlation between seed hardness and total lignin content in seed coat of
pomegranate (Punica granatum), the seed hardness and total lignin content of six cultivars were measured by
Texture Analyser and thioglycolic acid method. The results showed that the correlation coefficient was 0.9246
between seed hardness and total lignin content in seed coat. A full-length cDNA sequence of 1456 bp (GenBank
accession No.: KJ713968) was cloned from pomegranate seed coat by RACE, named PgCOMT gene. Real-
time quantitative PCR showed that the relative expression of PgCOMT in ‘Hongyushizi’, ‘Fenpi’, ‘Huiliruanzi’,
‘Mengzitian’ and ‘Tunisiruanzi’ seed coat had a similar trend with seed hardness. The relative expression of
PgCOMT declined at first, and then rose with development stage of pomegranate seed coat the last stage. These
lay a foundation for further study the mechanism of soft seed traits in pomegranate.
Key words: Pomegranate; Seed hardness; Lignin; COMT; Gene expression
66 第23卷热带亚热带植物学报
软籽、较软籽、较硬籽、硬籽四类。陆丽娟等[3]通过
测定中国主要石榴品种的鲜籽硬度，将其分为软
籽、半软籽和硬籽三类。
石榴籽粒包含假种皮、种皮和种仁 3 个部分，
通常可食用部分为假种皮，种仁中因富含多种脂肪
酸和蛋白质，也具有较高的营养价值[4]，而种皮中含
有较高的木质素[5]，是影响籽粒硬度的主要成分。
目前关于木质素生物合成途径的研究较为明确，一
般认为是从苯丙氨酸开始，进入苯丙烷途径，经过
一系列脱氨基、羟基化和甲基化等步骤，合成羟基
肉桂酸类化合物，再通过连接和还原反应生成不同
单体，单体进一步氧化聚合生成木质素[6–7]。咖啡
酸-O-甲 基 转 移 酶(Caffeic acid O-methyltransfease,
COMT)是木质素合成途径中的一个关键酶，催化
咖啡酸、5-羟基松柏醛和 5-羟基松柏醇甲基化分
别生成阿魏酸、芥子醛和芥子醇[8]。目前已从绿竹
(Bambusa oldhamii)[9]、苎麻(Boehmeria nivea)[10]、棉
花(Gossypium hirsuturm)[11]和丹参(Salvia miltiorrhiza)[12]
等植物中克隆了 COMT 基因，通过抑制 COMT 基
因的表达可使转基因植株烟草中的总木质素含量
下降[13]，将绿竹 COMT 基因反向导入烟草中，转
基因植株木质素含量均有下降，下降幅度最大达
28.7%[14]。
籽粒硬度是影响石榴口感和食用率的一项重
要品质指标，软籽石榴在市场上非常受欢迎。目
前，关于石榴软籽性状的形成机理还鲜有报道。本
研究选取 6 个籽粒硬度的石榴品种‘红玉石籽’、
‘白玉石籽’、‘粉皮’、‘会理软籽’、‘蒙自甜’和‘突
尼斯软籽’为材料，测定成熟籽粒硬度及种皮总木
质素含量并分析两者关系。同时采用 RACE 技术
克隆石榴木质素生物合成相关基因 COMT 的全长
cDNA，采用实时荧光定量 PCR 分析其在石榴种皮
中的表达，为深入了解石榴软籽性状的产生机理奠
定基础。
1 材料和方法
1.1 试验材料
供试石榴(Punica granatum L.)采自安徽农业大
学农业园石榴种质资源圃，土肥水管理水平一致。
于 2013 年 9 月 15 日分别采集‘红玉石籽’、‘白玉
石籽’、‘粉皮’、‘会理软籽’、‘蒙自甜’和‘突尼斯软
籽’成熟度一致的果实若干，置于冰盒带回实验室，
剥取石榴籽粒，部分在 4℃保存，用于籽粒硬度和总
木质素含量的测定；部分在 –80℃下保存，用于基因
克隆与表达。
2013 年 5 月 20 日起，在开花后 20、40、60、
80、100 和 120 d，分别从‘红玉石籽’树冠外围东、
西、南、北面及内膛枝条上随机摘取果实各 2 个，置
于冰盒带回实验室，剥取石榴籽粒，于 –80℃保存，
用于基因表达分析。
M-MLV 反 转 录 酶 和 SYBRTM Premix Ex Taq
购自 TaKaRa 公司，pGEM-T 载体购自 Promega 公
司，BD SMARTer™ RACE cDNA Amplification Kit
试剂盒购自 Clonetech 公司，试验所用引物均由上
海生工生物公司合成。
1.2 籽粒硬度测定
每个品种随机选取 3 个果实，剥离出籽粒，任
取 30 个石榴籽粒，去除外层假种皮，擦净待用。选
用 Texture Analyser 质构仪 P/36R 圆柱型平底探头，
采用 0.5 mm 的形变量进行硬度测定，单位为 g cm–2。
1.3 种皮总木质素含量测定
利用巯基乙酸法[15]测定石榴籽粒种皮中的总
木质素含量。每个品种随机选取 3 个石榴果实，剥
离出籽粒，任意取 100 个籽粒，去除假种皮、种仁，
仅留下种皮部分，研磨至粉末。称取 2 mg 种皮粉
末 至 2 mL 离 心 管，加 入 1.5 mL 2 mol L–1 HCl 和
0.3 mL 巯基乙酸，95℃培养 4 h，轻微震荡；样品
冰上迅速冷却，在 13225×g 下离心 10 min，弃上清
液；沉淀用蒸馏水冲洗 3 次，加入 1 mL 0.5 mol L–1
的 NaOH 在 室 温 下 震 荡 18 h；13225×g 悬 浮 离 心
10 min，上清液小心转入 2 mL 离心管；沉淀悬浮于
0.5 mL 0.5 mol L–1 的 NaOH，用力混匀，离心取上
清液；两次上清液合并与 0.3 mL 浓盐酸混合置于
4℃下 4 h，离心，弃上清液，沉淀用 1 mL 0.5 mol L–1
的 NaOH 溶解 , 溶液在 280 nm 处测定吸光值，以
0.5 mol L–1 的 NaOH 作为空白对照。将木质素标准
品 配 制 成 0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mg mL–1
共 6 个浓度梯度，测定其 OD 值，绘制标准曲线，求
得线性回归方程，每个样品 3 次重复。将样品的 OD
值代入线性回归方程中，求得样品的木质素质量
(mL)。木质素含量的计算公式为 C=m1/M×100%，
式中，m1 为样品木质素的质量，M 为样品质量。
第1期 67
1.4 PgCOMT的克隆和生物信息学分析
采用改良 CTAB 法[16]提取‘红玉石籽’种皮(去
除假种皮和种仁)的总 RNA，用 1% 琼脂糖凝胶电
泳检测其质量。参照 TaKaRa 的 M-MLV 反转录试
剂盒说明书合成 cDNA 的第一链。根据 Clonetech
公司的 BD SMARTer™ RACE cDNA Amplification
Kit 试剂盒说明书分别合成 3′ cDNA 和 5′ cDNA。
根据已知 COMT 基因的保守序列设计简并引
物 COMT-F1: 5′-AGGTCCTYATGGAGAGCTGG-
TA-3′ 和 COMT-R1: 5′-GTCGCTCCAGTCGTGGA-
GGATC-3′，以‘红玉石籽’种皮 cDNA 为模板，PCR
反应体系为 25 μL，反应程序为：94℃ 3 min；94℃
30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共 30 个循环。PCR 扩
增产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳分离后回收，连接至
pGEM-T 载体，转化大肠杆菌(Escherichia coli) DH-
5α，挑取单菌落送至上海生工生物公司进行测序。
根据目的片段序列设计 3′ RACE 扩增的特异
引 物 3′ GSP1: 5′-GACATACAAGGGCTTTGAGG-
GC-3′和 3′ GSP2: 5′-GCCGTGCTCAGTATGATCG-
TGG-3′，分别与通用引物 UPM: 5′-CTAATACGA-
CTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGC-
AGAGT-3′ 和 NUP: 5′-AAGCAGTGGTATCAACG-
CAGAGT-3′ 进 行 3′ cDNA 末 端 扩 增。 设 计 5′
RACE 扩增的特异引物 5′ GSP1: 5′-CCGACATTC-
CCCTATTGAAGACCT-3′ 和 5′ GSP2: 5′-CGAACG-
CAGTCATTCCGTAGGC-3′，分别与通用引物 UPM
和 NUP 进行 5′ cDNA 末端扩增。操作步骤参照
BD SMARTer™ RACE cDNA Amplification Kit 试
剂盒说明书完成。PCR 产物经回收连接到 pGEM-T
载体后转化至大肠杆菌 DH-5α，挑取单菌落送上海
生工生物公司进行测序。
利 用 DNAstar 软 件 对 获 得 的 序 列 进 行 初 步
分 析、比 对 与 拼 接，得 到 COMT 基 因 全 长 序 列，
运用 NCBI 网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查找
和 翻 译 开 放 阅 读 框(Open Reading Frame, ORF)；
Protparam 软件(http://web.expasy.org/protparam/)分析
编码蛋白的氨基酸序列组成、分子量、等电点等理
化性质；运用 NCBI 数据库中的 BLASTX 对氨基
酸序列进行同源性搜索和比对；氨基酸多重序列比
较采用 DNAMAN 软件。
1.5 PgCOMT的表达分析
分别以 6 个品种的石榴种皮 cDNA 为模板，以
石榴组成型表达基因 Actin 为内参，设计荧光引物
PgACTIN-PF: 5′-AGTCCTCTTCCAGCCATCTC-3′
和 PgACTIN-PR: 5′-ACTGAGCACAATGTTTC-
CA-3′、PgCOMT-PF: 5′-GTGCTGCGCTTTCAACA-
CCTAC-3′ 和 PgCOMT-PR: 5′-CGTCCCATTAACC-
ACCACAAGA-3′，根 据 TaKaRa 公 司 的 SYBRTM
Premix Ex TaqTM 试 剂 盒 说 明 书，使 用 ABI
STEPONE 荧光定量 PCR 仪对 PgCOMT 基因进行
实时定量 PCR 检测。PCR 扩增程序为：95℃预变
性 30 s；95℃变性 5 s，60℃退火 1 min，共 40 个循
环，每个样品 4 次重复检测，使用 2–△△Ct 法，求得待
测样品相对表达量。
以花后 20、40、60、80、100 和 120 d 的‘红
玉石籽’种皮 cDNA 为模板，以石榴 Actin 为内参基
因，按照同样的方法检测 PgCOMT 基因在果实不
同发育时期的表达量。
2 结果和分析
2.1 石榴不同品种籽粒硬度和种皮总木质素含量分析
采用 Texture Analyser 质构仪 P/36R 圆柱型平
底探头，在 0.5 mm 形变量下，6 个品种的籽粒硬度
不同，‘红玉石籽’、‘白玉石籽’和‘粉皮’硬度较大，
分别为 4435、4237、4123 g cm–2；‘会理软籽’和‘蒙
自甜石榴’的居中，分别为 3859、3515 g cm–2；‘突
尼斯软籽’的最小，仅为 1991 g cm–2 (图 1)。
用巯基乙酸法测定 6 个品种的石榴种皮总木
质素含量(图 2)，‘红玉石籽’、‘白玉石籽’和‘粉皮’
种皮总木质素含量较高，分别为 9.25%、9.25% 和
8.66%；‘会理软籽’和‘蒙自甜石榴’的相近，分别为
7.57% 和 7.99%；‘突尼斯软籽’的最低，仅为 6.36%。
采用 SPSS 统计软件进行相关性分析，结果表
明籽粒硬度与种皮总木质素之间呈正相关性，相关
系数为 0.9246。
2.2 PgCOMT基因的克隆
根据其他物种 COMT 基因的保守序列设计
简并引物，以‘红玉石籽’种皮 cDNA 为模板，经
PCR 扩增克隆得到一条长 419 bp 的目的片段(图
3: A)。经测序和比对初步确定其是 COMT 基因
片 段。 根 据 此 片 段，参 照 BD SMARTer™ RACE
cDNA Amplification Kit 试剂盒说明书分别设计 3′
RACE 和 5′ RACE 引物进行 cDNA 末端的扩增。3′
张水明等：石榴种皮总木质素含量及PgCOMT基因的克隆与表达
68 第23卷热带亚热带植物学报
图 1 不同品种石榴籽粒硬度
Fig. 1 Seed hardness of different pomegranate cultivars
图 2 不同品种石榴籽粒种皮总木质素含量
Fig. 2 Total lignin content in seed coat of different pomegranate cultivars
图 3 COMT 基因的目的片段(A)、3′ RACE (B)和 5′ RACE (C)
Fig. 3 PCR of fragment (A), 3′ RACE (B) and 5′ RACE (C) of COMT
第1期 69
RACE 获得 1 条特异谱带(图 3: B)，经回收克隆并
测序，该片段的长度为 689 bp，其中包含 37 个碱基
的 polyA 尾巴和 3′ 端接头引物序列，说明已经到
达 3′ 末端。5′ RACE 获得 1 条特异谱带(图 3: C)，
测序表明该片段长度为 621 bp，其 5′ 端有起始密
码子。
将获得的两端序列与目的片段序列进行拼接，
得到 1 条完整的 cDNA 序列，长度为 1456 bp。将
其命名为 PgCOMT，GenBank 登录号为 KJ713968。
2.3 PgCOMT基因的生物信息学分析
通过 NCBI 的 ORF Finder 分析，PgCOMT 基
因的全长 cDNA 为 1456 bp，其中包含 5′ 非编码区
116 bp，3′ 非编码区 227 bp 和开放阅读框 1113 bp，
编码一个含有 370 个氨基酸的蛋白质，起始密码子
为 ATG，终止密码子为 TAA (图 4)。
采 用 Protparam 分 析 其 理 化 性 质，推 测
PgCOMT 的分子式为 C1804H2846N464O527S26，相对分
子 量 为 40300.8，等 电 点(pI)为 5.61。 将 PgCOMT
基因编码的氨基酸序列进行同源性分析(图 5)，
结果表明，该氨基酸序列与很多植物 COMT 的氨
基酸序列具有较高的同源性。PgCOMT 的氨基
酸 序 列 与 仙 女 扇(Clarkia breweri) CbCOMT 的 同
源 性 最 高，为 90.0%，与 蓖 麻(Ricinus communis)、
图 4 PgCOMT 的核苷酸序列及推测的氨基酸序列。ATG: 起始密码子； TAA: 终止密码子。
Fig. 4 cDNA sequence of PgCOMT and deduced amino acid sequence. ATG and TAA present start codon and stop codon, respectively.
张水明等：石榴种皮总木质素含量及PgCOMT基因的克隆与表达
70 第23卷热带亚热带植物学报
图 5 PgCOMT与其他植物COMT的氨基酸序列比较。CbCOMT: 仙女扇; RcCOMT: 蓖麻; PdCOMT: 扁桃; PpCOMT: 毛桃; RchCOMT: 月季;
EcCOMT: 赤桉; EgCOMT: 冈尼桉; FvCOMT: 野草莓; JcCOMT: 麻风树; BpCOMT: 垂枝桦; BnCOMT: 苎麻; BpCOMT: 白桦; MdCOMT: 苹果;
PtCOMT: 毛白杨; PtrCOMT: 毛果杨; PkCOMT: 杂交白杨。
Fig. 5 Amino acid alignment of PgCOMT with COMT in other plants. CbCOMT: Clarkia breweri; RcCOMT: Ricinus communis; PdCOMT: Prunus
dulcis; PpCOMT: P. persica; RchCOMT: Rosa chinensis; EcCOMT: Eucalyptus camaldulensis; EgCOMT: E. gunnii; FvCOMT: Fragaria vesca;
JcCOMT: Jatropha curcas; BpCOMT: Betula pendula; BnCOMT: Boehmeria nivea; BpCOMT: Betula platyphylla; MdCOMT: Malus domestica;
PtCOMT: Populus tomentosa; PtrCOMT: P. tremuloides; PkCOMT: P. kitakamiensis.
第1期 71
扁 桃(Prunus dulcis)、毛 桃(Prunus persica)、赤 桉
(Eucalyptus camaldulensis)、垂枝桦(Betula pendula)、
月 季(Rosa chinensis)、野 草 莓(Fragaria ananassa)、
冈 尼 桉(E. gunnii)、麻 风 树(Jatropha curcas)、白 桦
(B. platyphylla)、苎麻(Boehmeria nivea)、苹果(Malus
pumila)、毛 白 杨(Populus tomentosa)、杂 交 白 杨
(Populus kitakamiensis)和 毛 果 杨(P. trichocarpa)的
分 别 为 87.30%、87.0%、87.0%、86.6%、86.0%、
85.9%、85.9%、85.7%、85.5%、85.5%、85.1%、
84.9%、83.8%、83.8% 和 83.5%。
2.4 不同品种PgCOMT的表达分析
PgCOMT 在 6 个石榴品种种皮中均有表达，在
图 6 PgCOMT 在不同品种石榴种皮中的相对表达量
Fig. 6 Relative expression of PgCOMT in seed coat of different pomegranate cultivars
图 7 PgCOMT 在石榴种皮不同发育时期的相对表达量
Fig. 7 Relative expression of PgCOMT in pomegranate seed coat at different developmental stages
‘红玉石籽’中的表达量最高，其次是‘粉皮’、‘会理
软籽’、‘蒙自甜’和‘突尼斯软籽’，与石榴籽粒硬度
和总木质素含量的大小较为一致。但‘白玉石籽’
的表达量最低。以‘粉皮’的表达量为 1，‘红玉石籽’
的是其 1.26 倍，‘突尼斯软籽’石榴的表达量仅为
‘粉皮’的 0.16 (图 6)。
2.5 不同发育时期PgCOMT的表达分析
荧光定量 PCR 分析 PgCOMT 在‘红玉石籽’
种皮不同发育时期的表达情况，结果表明(图 7)，
PgCOMT 在花后 20 d 的种皮中表达量最高，且随
着果实的发育，PgCOMT 表达量逐渐下降，在花后
120 d 的 PgCOMT 表达量反而上升。
张水明等：石榴种皮总木质素含量及PgCOMT基因的克隆与表达
72 第23卷热带亚热带植物学报
3 讨论
石榴自古就有软籽和硬籽之分，但如何划分
目前却无明确标准，籽粒硬度也仅凭模糊的“软”和
“硬”等词进行界定。Jalikop 等[17]曾测定多个品种
的石榴籽粒硬度，并对其进行了硬度划分，但其所
测定的为干种子，并不能真实反映新鲜石榴在食
用中的硬度。陆丽娟等[3]用 YD-1 型果实硬度计测
定中国多种鲜食品种的硬度，一定程度上反映了
我国部分鲜食品种的硬度，本研究中利用 Texture
Analyser 质构仪测定成熟鲜籽硬度，符合人们通常
的鲜食口感和对于鲜食石榴的硬度判定，且能有效
避免人为操作误差对于实验结果的影响，可信度
高。
石榴硬度产生机理比较复杂，山东农学院在枣
庄的调查发现石榴树随着更新次数的增加，果实种
子有退化变软现象[18]。陆丽娟等[3]在研究中国代表
性石榴品种的硬度时指出石榴种子硬度性状可能
是多基因控制，且可能存在主效基因，同时发现光
照、树体营养等环境因素对种子硬度也具有一定影
响。Frczek 等[19]通过对不同植物种子的种皮厚度
与硬度进行测定，认为种皮厚度是种子硬度产生的
一个主要因素。本研究首次通过测定 6 个石榴品
种籽粒的硬度和种皮总木质素含量，发现两者呈显
著正相关性。
木质素是由一组相关联的苯基丙烷单元-木质
素单体聚合而成，木质素单体的合成过程极其复
杂，存在多基因、多途径交互作用[6]。COMT 是其
合成途径中一个重要的甲基转移酶，参与 S-木质
素的合成[20–21]。本研究从石榴籽粒中克隆出一个
COMT 基因，经核酸和氨基酸序列比对，发现其与
已知的许多物种中的 COMT 基因具有很高的同源
性。定量结果表明 PgCOMT 在‘红玉石籽’、‘粉皮’、
‘会理软籽’、‘蒙自甜’和‘突尼斯软籽’石榴种皮中
的表达量的高低与石榴籽粒硬度及总木质素含量
大小较为一致，而‘白玉石籽’除外。在石榴种皮的
发育进程中，PgCOMT 的表达量呈先下降后上升
的趋势。木质素的生物合成受木质素合成途径中
多个酶基因、转录调控因子及各种环境因子的影
响[22]，对于石榴种皮木质素的生物合成尚需进一步
研究。
籽粒硬度是石榴一个重要的品质因素，本研究
初步明确了石榴籽粒硬度与种皮总木质素含量呈
正相关，同时克隆得到了石榴木质素生物合成途径
中的一个关键基因 COMT 并分析了其表达特性。
研究结果为深入了解和调控石榴软籽性状奠定了
基础。
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