全 文 ：收稿日期： 2013–05–06　　　　接受日期： 2013–06–24
基金项目： 国家自然科学基金项目(31000313)；中央级公益性科研院所业务费专项资金项目(ITBB110201)；海南省重大科技项目子课题热　带
生物种质与基因资源研究(ZDZX2013023-1)资助
作者简介： 朱家红(1982 ~ )， 男， 硕士， 助理研究员， 从事植物生理与分子生物学研究。E-mail: hjzhu1010@163.com
* 通讯作者 Corresponding author. E-mail: zzl_catas@hotmail.com
热带亚热带植物学报　2014， 22(1)： 83 ~ 88
Journal of Tropical and Subtropical Botany
巴西橡胶树两个蔗糖合成酶基因的克隆和表达分析
朱家红1,2, 徐靖3, 畅文军2, 张治礼2,3*
(1. 海南大学农学院 , 海口 570228； 2. 中国热带农业科学院热带生物技术研究所，农业部热带作物生物技术重点开放实验室，海口 571101；
3. 海南省农业科学院，海口 571000)
摘要： 为了解蔗糖合成酶在巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)生长和发育过程中的功能，利用 RACE 技术从巴西橡胶树中克
隆了蔗糖合成酶基因，并对基因的表达特征进行了分析。结果表明，从巴西橡胶树中克隆了两个蔗糖合成酶基因(HbSS1 和
HbSS2)，HbSS1 全长 2864 bp，编码 806 个氨基酸；HbSS2 全长 2815 bp，编码 811 个氨基酸。两个基因编码的蛋白具有典型的
植物蔗糖合成酶结构特征，包含 1 个磷酸化位点和两个保守的功能域。半定量 RT-PCR 分析表明，HbSS1 和 HbSS2 在各组织
器官中均有表达，其中 HbSS1 在叶中的表达量最高，HbSS2 在树皮中的表达量最高，这说明 HbSS1 和 HbSS2 可能参与了各组
织的生长和代谢过程，且功能有所分化。
关键词： 巴西橡胶树； 蔗糖合成酶； 基因； 表达
doi: 10.3969/j.issn.1005–3395.2014.01.013
Cloning and Expression Analysis of Two Sucrose Synthase Genes from
Hevea brasiliensis
ZHU Jia-hong1,2, XU Jing3, CHANG Wen-jun2, ZHANG Zhi-li2,3*
(1. College of Agronomy, Hainan University, Haikou 570228, China; 2. Key Laboratory of Tropical Crop Biotechnology, Ministry of Agriculture,
Institute of Tropical Biosciences and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101, China; 3. Hainan Academy
of Agricultural Sciences, Haikou 571100, China)
Abstract: To investigate the function of sucrose synthase in Hevea brasiliensis growth and development, two
genes encoding sucrose synthase, named as HbSS1 and HbSS2, were cloned from H. brasiliensis by RACE-PCR,
and their expression patterns were analysed by semi-quantitative RT-PCR. The results showed that the whole
length of HbSS1 cDNA was 2864 bp, encoding 806 amino acids; that of HbSS2 cDNA was 2815 bp, encoding
811 amino acids. Both HbSS1 and HbSS2 had typical characteristic of sucrose synthase in plants, containing
a conserved phosphorylation site and two conserved domains. The expressions of HbSS1 and HbSS2 were
detected in all tissues, their expressions were the highest in leaves and bark, respectively. It was suggested that
HbSS1 and HbSS2 might be involved in growth and metabolism of various tissues, and they also had functional
differentiation.
Key words: Hevea brasiliensis; Sucrose synthase; Gene; Expression
蔗糖是植物光和作用的主要产物，其通过叶片
向库器官输送碳源和能量，广泛参与植物的代谢进
程，影响植物的生长发育[1]。在库器官中，蔗糖本身
不能直接被利用，必须通过蔗糖转化酶(Invertase，
84 第22卷热带亚热带植物学报
EC 3.2.1.2)或 蔗 糖 合 成 酶(Sucrose synthase, EC
2.4.1.13)分解后才能参与植物的代谢活动[1–3]。蔗
糖合成酶作为蔗糖代谢调节中的关键酶在调节植
物细胞碳水化合物的分配，结构组成和贮藏等代谢
途径中具有重要的功能[3]。蔗糖合成酶的分解活性
与各种淀粉贮藏器官的库强度密切相关，包括马铃
薯块茎的根、胡萝卜根、玉米粒、豌豆胚等[4–8]。蔗
糖合成酶的活性也与纤维素的合成有关，参与调节
细胞壁构建、棉花纤维细胞的发育[9–11]。此外，蔗
糖合成酶的活性还与一些重要的代谢进程有关，如
糖的运输、环境胁迫响应、氮的固定等[12–13]。分离
和鉴定编码蔗糖合成酶的基因是了解其生理功能
和代谢机制的第一步，目前蔗糖合成酶基因已经
从拟南芥(Arabidopsis thaliana)[14]、棉花(Gossypium
spp.)[3]、玉米(Zea mays)[15]、水稻(Oryza sativa)[16]、小
麦(Triticum aestivum)[10]等植物中得到了克隆。
在巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)中，蔗糖是光
合产物同化碳转运和分配的主要形式，是橡胶生物
合成的初始原料。蔗糖合成酶是蔗糖代谢的关键
酶，推测其参与了橡胶生物合成的调节。目前还没
有关于巴西橡胶树蔗糖合成酶基因方面的研究报
道。在先前的研究中，通过筛选文库在橡胶树胶乳
中获得两条编码蔗糖合成酶的基因片段。在此基
础上，本研究对 2 个基因的全长 cDNA 序列进行了
扩增，并对其结构和表达特征进行了分析，为深入
研究其在胶乳蔗糖代谢中的调控作用奠定基础。
1 材料和方法
1.1 植物材料
巴 西 橡 胶 树(Hevea brasiliensis)品 种 为‘7-33-
97’，种植于中国热带农业科学院实验农场。分别
采集巴西橡胶树的根、树皮、花、叶和胶乳为样品，
置液氮中冷冻，储藏于 –70℃冰箱中备用。
1.2 巴西橡胶树RNA的提取
胶乳总 RNA 的提取参照张治礼等[17]的方法；
叶片、根、皮和花的总 RNA 提取参照全式金公司
RNA 提取试剂盒说明书。
1.3 巴西橡胶树蔗糖合成酶基因的克隆
根据先前获得的 EST 序列[18]，设计 4 条特异引
物，5SS1：5′-TCTATCACCACCAACAACTACA-3′；
5SS2：5′-CTTCACCCTGTCCAGCCTTGC-3′；3SS1：
5 ′-TTGGTGGTGATAGAAGAAAGG-3 ′；3SS2：
5′-TGGATAACAGCCCAAACAAAT-3′，分别和UPM：
5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTG-
GTATCAACGCAGAGT-3′ 配对，对两个基因的 5′
端和 3′ 端进行扩增，具体参照 CLOTECH 公司的
RACE 试剂盒说明书进行。将扩增出的片段连接
到 T 载体上进行测序，对所获得的序列和 EST 序
列进行拼接。根据拼接结果，分别在两个基因的
5′ 端 和 3′ 端 设 计 2 对 特 异 引 物 SS11：5′-AACAT-
TTTCTGATCAGAGCTATGGC-3′ 和 SS12：5′-CCC-
TCGAGTTATGTGGTTCCAC-3′；SS21：5′-GCGTC-
CAGTTCGATCATGGG-3′ 和 SS22：5′-AGTTCCAT-
TAGTGATTGTA-3′，以 cDNA 模 板 对 2 个 基 因 的
编码区进行扩增，将扩增的片段连接到 T 载体上
进行测序，将测序结果与拼接结果进行比较。利用
NCBI 数 据 库 进 行 BLAST 分 析，利 用 DNAMAN
软件对蛋白序列进行比对分析。
1.4 氨基酸序列分析和系统进化树构建
蛋白质特性分析在 http://www.expasy.org 网站
上在线完成。从 NCBI 数据库中挑选不同物种蔗
糖合成酶基因编码蛋白，利用 DNAMAN 软件进行
氨基酸序列比对分析和分子进化分析。
1.5 基因的表达分析
将不同组织的总 RNA 反转录成 cDNA，以 18S
rRNA 为内标基因进行半定量 RT-PCR 分析。用于
半定量 RT-PCR 的基因特异引物为 RTSS11：5′-CA-
GATTTCATCATCACCAGCAC-3′ 和 RTSS12：5′-
CGTAGAACATTTCAAGGTAGCG-3′； RTSS21：5′-
CTCTGGGTCACCTGGTCTACTA-3′ 和 RTSS22：
5′-CTCTGTATCCGATCATTCAACA-3′。PCR 反
应程序为：94℃预变性 5 min，然后 94℃变性 30 s，
55℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，共 25 次循环。实
验重复 3 次。
2 结果和分析
2.1 橡胶树蔗糖合成酶基因的克隆
根据已有的两条编码蔗糖合成酶的基因片
段，设计特异引物对基因的 5′ 端和 3′ 端进行了扩
增。扩增条带经回收、克隆和测序，证实得到的 5′
第1期 85朱家红等：巴西橡胶树两个蔗糖合成酶基因的克隆和表达分析
端长度分别为 1992 bp 和 1927 bp，3′ 端长度分别
为 884 bp 和 738 bp。将 5′ 端、3′ 端和已有的 EST
序列进行拼接，获得了两个含有完整阅读框架的
cDNA 序列。利用特异引物 SS11/ SS12 和 SS21/
SS22 对两个基因的编码区进行扩增，分别获得两
条长度为 2500 bp 左右的特异片段，测序结果表明
两个特异片段序列与拼接结果一致，表明获得了两
个基因的全长 cDNA 序列，将 2 个基因分别命名
为 HbSS1 和 HbSS2。HbSS1 全 长 2864 bp，包 含 1
个 2421 bp 的开放阅读框，编码 806 个氨基酸，5′
端非编码区长 161 bp，3′ 端非编码区长 282 bp；
HbSS2 全长 2815 bp，包含 1 个 2436 bp 的开放阅读
框，编码 811 个氨基酸，5′ 端非编码区长 145 bp，3′
端非编码区长 234 bp。
2.2 HbSS1和HbSS2蛋白序列分析
HbSS1 和 HbSS2 蛋白分子量分别为 92.63 kD
和 92.67 kD，理论等电点分别为 6.14 和 5.74，两者
氨基酸的同源性达 69.42%。HbSS1 和 HbSS2 与柑
橘(Citrus unshiu, BAA88904)、拟 南 芥(Arabidopsis
图 1 HbSS1/2 与其它植物中的蔗糖合成酶氨基酸序列的多重比对。箭头示丝/苏蛋白激酶磷酸化位点；实线示蔗糖合成结构域；虚线示糖基转
移结构域。
Fig.1 Multialignment of amino acid sequences of HbSS1/2 and other plant sucrose synthase. Arrow show Ser/Thr kinase phosphorylation site. Sucrose
synthetase domain and glycosyltransferase domain were marked by solid line and dotted line, respectively.
86 第22卷热带亚热带植物学报
thaliana, AED92895)、木薯(Manihot esculenta, ABD-
96570)及毛白杨(Populus tomentosa, ADW80550)中
的蔗糖合成酶具有较高的序列同源性和类似的结
构特征(图 1)，均包含 1 个磷酸化位点和两个保守
的功能域：HbSS1 和 HbSS2 蛋白的第 11 个氨基酸
(箭头处)为丝 / 苏蛋白激酶磷酸化位点；HbSS1 蛋
白的第 7 ~ 554 氨基酸，HbSS2 蛋白的第 7 ~ 556
氨基酸区段为蔗糖合成结构域(实线处)，具有合成
蔗糖的功能；HbSS1 和 HbSS2 蛋白的第 569 ~ 746
氨基酸区段为糖基转移结构域(虚线处)，行使糖基
化合物转移的功能。
2.3 蛋白序列的系统进化分析
利用 DNAMAN 软件，将 HbSS1/2 和其它植物
的蔗糖合成酶蛋白序列进行聚类分析。结果表明，
这些植物的蔗糖合成酶可以分为 3 大类：SS Ⅰ类、
SS Ⅱ类和 SS Ⅲ类(图 2)，各类中均有单子叶植物
和双子叶植物，说明蔗糖合成酶的分化可能发生在
单子叶和双子叶植物分化之前。此外，SS Ⅰ类中
的蔗糖合成酶又可以分为两个亚类，一类是单子叶
植物的蔗糖合成酶，一类是双子叶植物的蔗糖合成
酶。本研究所获得的 HbSS1 和 HbSS2 的亲缘关系
较远，分别属于 SS Ⅰ类和 SS Ⅱ类，说明它们行使
图 2 HbSS1/ 2 与其它植物蔗糖合成酶的聚类分析
Fig. 2 Phylogenetic analysis between HbSS1/2 and sucrose synthases in other plants
第1期 87朱家红等：巴西橡胶树两个蔗糖合成酶基因的克隆和表达分析
的功能可能不同。
2.4 HbSS1和HbSS2的表达分析
分别提取巴西橡胶树根、树皮、花、叶以及胶乳
的总 RNA，经反转录后进行半定量 RT-PCR 分析。
结果表明，HbSS1 和 HbSS2 在所有检测组织器官
中均有表达，其中 HbSS1 在叶中的表达量最高，胶
乳中次之，HbSS2 在树皮中的表达量最高，叶中次
之。
图3 HbSS1和HbSS2的表达。R: 根； B: 树皮； F: 花； LE: 叶； LA: 胶乳。
Fig. 3 Expression of HbSS1 and HbSS2. R: Root; B: Bark; F: Flower;
LE: Leaves; LA: Latex.
3 讨论
有研究表明，蔗糖合成酶是由一个小的多基
因家族编码，大多数植物蔗糖合成酶至少有 3 个
基因编码，不同形式的蔗糖合成酶行使不同的代谢
功能[3]。拟南芥中的蔗糖合成酶有 6 个基因编码，
atSuS1 和 atSuS4 在厌氧条件下表达增加；atSuS2
在开花后 12 d 特异性高度表达；atSuS3 在叶片失
水、渗透胁迫等条件下各个器官及后熟的种子中均
有表达；而 atSuS5 和 atSuS6 表达是组成性的，几乎
不受胁迫条件的影响[14]。此外水稻中的蔗糖合成
酶基因有 6 个[16]、棉花有 7 个[3]、玉米和柑橘各有 3
个[19–20]，各个基因家族的基因在不同器官、不同发
育阶段以及应对各种胁迫响应时的表达不同。本
研究中，从巴西橡胶树中分离到两个编码蔗糖合成
酶的基因 HbSS1 和 HbSS2，两个基因在不同器官中
均有表达，说明它们广泛参与了各组织的生长发育
和代谢过程。但两个基因的表达又有所差异，其中
HbSS1 在叶中的表达量最高，HbSS2 在树皮中的
表达量最高。此外 HbSS1 和 HbSS2 亲缘关系较远，
分别属于不同的类型，说明它们行使的功能可能不
同。
在巴西橡胶树中，乳管自身不能进行光合作
用，橡胶生物合成所需的原料(蔗糖)来自乳管外的
细胞，经乳管原生质体膜进入乳管[21]。乳管细胞以
蔗糖为起始物，大约经过 20 个酶促反应生成异戊
二烯单体[22]。研究表明，胶乳产量的第一限制因素
是乳管系统中可利用糖的含量及糖代谢的强度，蔗
糖转化为葡萄糖和果糖的反应是橡胶生物合成的
一个限制因子[23–25]。蔗糖合成酶作为蔗糖代谢调
节中的关键酶能够可逆地合成和分解蔗糖，但通常
认为主要起分解蔗糖的作用[3,26]。对胶乳中蔗糖合
成酶相关基因的研究，将有助于进一步深入了解蔗
糖合成酶调节蔗糖代谢及橡胶生物合成的机理。
在本研究中克隆获得的两个蔗糖合成酶基因在树
皮和胶乳中均有表达，树皮中含有大量的乳管细
胞，而乳管细胞和胶乳中均不能合成蔗糖，这进一
步说明 HbSS1 和 HbSS2 可能具有分解蔗糖的功能。
本研究分离获得了两个巴西橡胶树的蔗糖合成酶
基因，并对它们的表达特征进行了分析，这为进一
步研究蔗糖合成酶在橡胶树生长、发育及胶乳代谢
中的功能奠定了基础。
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