全 文 ：热带亚热带植物学报 2016, 24(3): 273 ~ 279
Journal of Tropical and Subtropical Botany

收稿日期: 2015–11–10 接受日期: 2015–12–16
基金项目: 国家自然科学基金项目(31270287, 31570398)；广东省自然科学基金重点项目(2015A030311023)资助
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31270287, 31570398), and the Key Program of Natural
Science Foundation of Guangdong Province (Grant No. 2015A030311023).
作者简介: 张启雷(1990~ )，男，硕士研究生，研究方向: 植物生理生态。E-mail: dalei45666@163.com
* 通信作者 Corresponding author. E-mail: pengchl@scib.ac.cn




内源抗坏血酸对水稻种子萌发及幼苗生长的影响

张启雷, 刘强, 高辉, 陆俐娜, 彭长连*
(广东省植物发育生物工程重点实验室，华南师范大学生命科学学院，广州 510631)

摘要：为了解内源抗环血酸在水稻(Oryza sativa)种子中的作用，以野生型品种‘中花 11’ (ZH-11)、抗坏血酸合成关键酶 GLDH
基因的上调(超表达)株系 GO-2 及下调(干涉)株系 GI-2 为材料，研究了抗环血酸含量对其种子萌发和幼苗生长的影响。结果
表明，GO-2 株系的种子萌发率比野生型 ZH-11 高 6%，比干涉型 GI-2 高 60%。外源添加 1 mmol L–1抗坏血酸后，干涉型
GI-2 萌发率提高了 22%，GO-2 及 ZH-11 则没有明显增加。GO-2 株系在幼苗的根长、株高、分蘖数和鲜重等指标上均高于
ZH-11 和 GI-2。实时荧光定量测定结果表明，GO-2 株系叶片的 GLDH 基因表达量显著上调，而 GI-2 株系则显著下调。这
说明抗坏血酸有助于维持水稻种子活力和促进水稻种子发芽和幼苗生长。
关键词：抗坏血酸；GLDH 基因；水稻；种子萌发；幼苗生长
doi: 10.11926/j.issn.1005-3395.2016.03.005

Effects of Endogenous Ascorbic Acid on Seed Germination and Seedling
Growth of Rice

ZHANG Qi-lei, LIU Qiang, GAO Hui, LU Li-na, PENG Chang-lian*
(Guangdong Provincial Key Laboratory of Biotechnology for Plant Development, School of Life Science, South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

Abstract: The aim was to understand the function of endogenous ascorbic acid in rice (Oryza sativa) seeds. The
homozygote transgenic lines GO-2 with the up-regulated GLDH (the key enzyme that catalyzes the final step of
Asc biosynthesis in plants gene) and GI-2 with the down-regulated GLDH had been established from the cultivar
‘Zhonghua 11’ (ZH-11). The effect of endogenous ascorbic acid on seed germination and seedling growth of rice
was studied among ZH-11, GO-2 and GI-2. The results showed that the germination rate of GO-2 was 6% and
60% higher than that of wild type (ZH-11), and GI-2, respectively. After treatment with 1 mmol L–1 exogenous
ascorbic acid, the germination rate of GI-2 increased by 22%, but no significant effect was observed in that of
GO-2 and the wild type (ZH-11). The root length, plant height, tiller number and fresh weight of seedling in GO-2
were higher than those in ZH-11 or GI-2. The expression of GLDH gene in GO-2 leaves was higher than that in
ZH-11 or GI-2, too. So, these indicate ascorbic acid plays an important role in maintaining seed vigor and
improving germination and seedling growth of rice.
Key words: Ascorbic acid; GLDH gene; Oryza sativa; Seed germination; Seedling growth

抗坏血酸在植物体内具有非常广泛的作用，在细
胞水平上它能促进线粒体的呼吸作用和叶绿体的光
合磷酸化作用[1]，在个体水平它能促进植物的种子萌
发及幼苗生长，改善受精作用和提高作物的产量[2]。
274 热带亚热带植物学报 第 24 卷

作为个体生长的开始，种子萌发是一个非常复
杂而有序的生理过程和形态发生过程，涉及很多代
谢途径，而影响种子萌发的因素有很多，包括光照、
温度、重金属和 CO2 等。如何提高种子活力和萌发
率是农业生产上面临的重要问题，前人已开展了一
系列的探索工作[3]。近年来，随着分子生物学技术
发展，已开始借助分子生物学研究手段探究种子萌
发机理和调控种子萌发过程[4–5]。据报道，外源添
加抗环血酸可以改善植物种子萌发及幼苗生长状
况[6]，这种改善作用可能与抗氰呼吸有关[7]。
L-半乳糖途径是抗环血酸(AsA)合成的重要
途径，其中的 L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶(GLDH)
是该途径的限速酶。通过分子生物学技术手段 ,
水稻(Oryza sativa)的 L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶
基因(GLDH)上调和下调株系已经成功构建[8]。由
于 GLDH 基因的表达发生变化，水稻中的抗坏血
酸含量与野生型具有显著差异。本研究拟通过测
定不同株系的种子萌发率和发芽过程中抗坏血酸
含量的变化，观察不同株系幼苗生长状况，并统
计分蘖数，研究了抗坏血酸与种子萌发及幼苗生
长之间的关系，为探究抗坏血酸对种子萌发作用
机理的研究提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 植物材料
水稻(Oryza sativa)粳稻品种‘中花 11’ (ZH-11)
和在ZH-11遗传背景下构建的GLDH基因超表达株
系 GO-2 和干涉株系 GI-2。水稻种子由华南农业大
学彭新湘教授实验室提供。

1.2 种子萌发
将种子置于 5% (V/V)次氯酸钠溶液中消毒 15~
20 min，然后用超纯水冲洗 3~4 次至无次氯酸钠气
味残留，再置于超纯水中浸泡 12 h 后，放入烧杯于
水浴锅中隔水恒温 36℃萌发。

1.3 育苗
将萌发 3~4 d 的水稻种子均匀地播种在泡制好
的拟南芥土中，盖上一层保鲜膜保湿，放置在人工
气候培养箱中培养, 控制白天温度 33℃，晚上 28℃，
日周期 12 h，湿度 80%。待子叶长出土面后去除保
鲜膜，继续培养，期间适当浇水。待幼苗长至 15 cm
左右，移苗于实验田或培养盆中进一步培养。

1.4 萌发率的测定
挑选 3 个株系饱满的种子各 100 粒，将挑选的
种子经过消毒、冲洗、浸泡之后，置于铺好湿滤纸
的培养皿中，加盖双层湿润滤纸，设置 4 个重复。
将培养皿置于培养箱培养，3 d 后统计萌发率。萌
发率 GR=(发芽种子数/供试种子总数)×100%。

1.5 抗坏血酸含量的测定
3 种水稻种子进行萌发处理，3 d 后取发芽一致
及未发芽的种子各25粒。参照Gillespie等[9]的方法。
称取 0.1 g 种子，用 1 mL 预冷的 6%三氯乙酸充分
研磨、震荡混匀，4℃、16300×g 离心 10 min，取上
清液加入 2 mL 反应体系中，37℃水浴 1 h，用分光
光度计检测 525 nm 的吸光值，每次测定重复 3 次。

1.6 幼苗株高及根长的测量
将萌发后的种子播种在拟南芥土中，放于人工
培养箱培养，10 d 后测量各株系的株高。将萌发的
种子放于装有沙子的试管中，用木村培养液浇灌,
将试管置于人工气候箱培养。5 d 后流水冲去试管
内沙子，取出幼苗测量各株系根长。

1.7 分蘖及鲜重的统计
将水稻移栽于水稻培养盆中，以 3×3 形式共计
移栽 9 株水稻，设置 8 盆水稻作为重复。将移栽好
的水稻置于楼顶温室中培养，30 d 后观察并统计水
稻各株系分蘖数。将长势一致的各株系水稻幼苗移
栽于试验田，试验田常规水肥管理，于移栽后 30 d
统计各株系鲜重情况。

1.8 基因的表达
取移栽后 30 d 的水稻叶片进行基因表达量的测
定，GLDH 引物分别为 GLDH-F: 5′-CGGCGGCATCA-
TTCAGGTT-3′，GLDH-R: 5′-AAGCCCACAGCGAG-
CAAGATA-3′，内参引物为 OsUBQ-F: 5′-CCAGGA-
CAAGATGATCTGCC-3′, OsUBQ-R: 5′-AAGAAGCT-
GAAGCATCCAGC-3′。用7500 Real Time PCR System
进行 PCR 扩增，结果分析按照 Kenneth 等[10]的方法。

1.9 数据分析
采用 Excel 2010 进行数据处理，SPSS 19.0 软件
第 3 期 张启雷等: 内源抗坏血酸对水稻种子萌发及幼苗生长的影响 275


进行单因素方差分析和 LSD 检验，用 SigmaPlot12.5
绘图。

2 结果和分析

2.1 种子的萌发
超表达株系 GO-2 和野生型株系 ZH-11 的种子
在催芽后第 2 天开始大量萌发，而干涉型株系 GI-2
只有少量萌发(图 1: A)。在第 3 天时 GO-2 和 ZH-11
的根与芽显著长于 GI-2 (图 1: B)，GO-2 和 ZH-11
萌发率均显著高于 GI-2，GO-2 与 ZH-11 萌发率则
没有显著差异(图 1: C)。
未发芽种子的还原型抗坏血酸及总抗坏血酸
含量均很低，但 GO-2 和 ZH-11 的显著高于 GI-2 (图
2: B)。催芽后第 3 天 3 个株系已经发芽的种子中总
抗坏血酸含量无显著差异，但还原型抗坏血酸含量
存在差异：GO-2 显著高于 GI-2，而 ZH-11 与 GO-2
和 GI-2 均差异显著(图 2: A)。

图 1 种子表型和萌发率。柱上不同英文字母表示差异显著(P<0.05)。下图同。
Fig. 1 Phenotypic and germination rate of seeds. Different letters above column indicate significant difference at 0.05 level. The same is following Figures.

图 2 种子抗坏血酸含量。A: 发芽种子；B: 未发芽种子。
Fig. 2 Ascorbic acid content in seeds. A: Germination seed；B: Ungermination seed.

以蒸馏水作对照，用 1 mmol L–1 抗坏血酸溶液
浸泡 3 种株系水稻的种子 12 h 后，GO-2 和 ZH-11
的萌发率没有明显的增加，但 GI-2 发芽率略有升高
(图 3)。

2.2 3 种株系水稻幼苗的生长状况
萌发 10 d 后，干涉型株系 GI-2 幼苗非常瘦小，
超表达型株系 GO-2 幼苗比较粗壮，野生型株系
ZH-11 幼苗生长状况居两者之间(图 4: A)。GO-2
种子萌发速度快，出芽迅速、齐整，幼苗生长速度
快，其株高显著高于野生型及干涉型植株。干涉型
株系萌发速度慢，出芽不齐，幼苗生长速度缓慢，
株高显著低于野生型及超表达型植株(图 4: B)。从
根长结果(图 4: C)可知：GO-2 和 ZH-11 根长均明
显长于 GI-2，GO-2 根长短于 ZH-11，但两者间无
显著差异。
276 热带亚热带植物学报 第 24 卷


图 3 外源抗坏血酸处理后种子发芽率的变化
Fig. 3 Changes in germination rate treated by 1 mmol L–1 ascorbic acid
2.3 幼苗移栽后生长状况
水稻秧苗移栽 30 d 后，GO-2 的分蘖数显著高
于 ZH-11 和 GI-2 (图 5: B)。ZH-11 与 GO-2 的生长
状况明显好于 GI-2 (图 5: A)，ZH-11 与 GO-2 茎秆
粗壮，生长旺盛，分蘖较多，叶片较绿，株高明显
高于 GI-2，而 GI-2 植株矮小，分蘖数少，叶片发
黄，生长状况很差，部分秧苗黄化后死亡。秧苗株
高和鲜重均表现为超表达型株系 GO-2>野生型株
系 ZH-11>干涉型株系 GI-2, 且他们之间的差异均
显著(图 5: C, D)。


图 4 10 d 幼苗的生长状况和株高及 5 d 幼苗的根长
Fig. 4 Growth and height of 10-day seedlings and root length of 5-day seedlings


图 5 移栽 30 d 后水稻秧苗的表型、分蘖数、株高及鲜重
Fig. 5 Phenotypic, tiller number, height and fresh weight of rice seedlings transplanted after 30 days
第 3 期 张启雷等: 内源抗坏血酸对水稻种子萌发及幼苗生长的影响 277


2.4 秧苗叶片 GLDH 基因的表达
水稻移栽实验田 30 d 后，ZH-11 与 GO-2 的生
长状况在表型上明显好于 GI-2 (图 5: A)，叶片的
GLDH 基因表达量也是 GO-2 显著高于 ZH-11 和
GI-2，而 ZH-11 又高于 GI-2 (图 6)，这表明 3 个株
系水稻的不同抗坏血酸含量是由于 GLDH 基因表
达量的差异导致的。


图 6 移栽 30 d 后水稻叶片 GLDH 基因的相对表达量
Fig. 6 Relative expression of GLDH gene in rice leaves transplanted after
30 days

3 讨论

L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶(GLDH)是抗坏血酸
(AsA)生物合成途径最后一步的关键酶[11]，GLDH
活性在调节抗坏血酸含量过程中起重要作用[12]。种
子萌发是高等植物生长发育的起点, 是植物生命史
的关键阶段[13]。外源抗坏血酸处理能够提高植物种
子的萌发率[14–16], 这可能与抗坏血酸增强种子的呼
吸作用有关。本研究中超表达株系的发芽率显著高
于野生型株系和干涉型株系(图 1)，这与前人报道通
过外源施加抗坏血酸的结果一致[2]。外源抗坏血酸
对种子萌发的影响与其浓度有关，用 0.5 mmol L–1
抗坏血酸处理黄芩(Scutellaria baicalensis)种子，促
进萌发的作用最明显, 浓度过高的促进效果反而不
佳[17]。在水稻种子萌发过程中，随着外源抗坏血酸
浓度的增加种子的呼吸作用增强，抗坏血酸浓度为
0.01%时最好，浓度过高会抑制种子的活力[2]。本研
究用 1 mmol L–1 外源抗坏血酸处理 3 个株系水稻种
子后，GI-2 株系的发芽率提升了 22% (图 3)，而超
表达型株系和野生型株系的发芽率没有明显增加,
表明维持一定水平的抗环血酸含量是保障水稻种
子正常萌发的基础，抗坏血酸在种子萌发过程中起
着非常重要的作用。种子在储存过程中会不断地衰
老，种子在老化过程中内部会发生一系列的变化,
包括膜脂被氧化和破坏、核酸损伤、酶活性降低、
有毒物质的积累等，最终导致种子活力下降[18]。而
抗坏血酸是一种抗氧化物质，能够清除细胞中的活
性氧，而且植物中的抗坏血酸含量与抗逆性呈正相
关, 提高抗坏血酸含量或促进氧化态抗坏血酸的还
原都能提高植物的抗逆性[19]。植物通过合成还原型
抗坏血酸来增加总抗坏血酸的含量，同时也提高了
还原型抗坏血酸的比例[19–20]。本研究结果还表明,
水稻发芽种子的还原型抗坏血酸含量与种子萌发
率呈正相关(图 1, 2)。另一方面，抗坏血酸能够促进
细胞周期的进行，使感受态细胞由 G1 期进入 S 期，
进而加快细胞的分裂[19]。因此，在一定范围内提高抗
坏血酸含量有利于增强种子活力，提升种子萌发率。
在细胞分裂、分化及伸长的过程中，抗坏血酸
可作为多种酶的辅助因子起到促进的作用[20]。在本
研究中，GO-2 株系是通过超表达方法提高 GLDH
基因表达量，高的 GLDH 表达量(图 6)提高了 GLDH
活性和抗坏血酸的合成量。有研究表明，高抗坏血
酸含量能增强细胞的生长能力[21]，因此 GO-2 株系
表现出分蘖多、幼苗植株较高等特征(图 5)。相反，
由于 GLDH 表达量低(图 6)导致抗环血酸合成量下
降，干涉型株系 GI-2 表现出幼苗矮小、分蘖少等特
征。抗坏血酸参与具有调节细胞周期进程功能的富
羟脯氨酸糖蛋白的脯氨酸羟化作用，它可以促使处
于分裂期的感受态细胞由 G1 期进入 S 期，使不活动
中心细胞数量减少。当拟南芥(Arabidopsis thaliana)
突变体细胞中抗坏血酸含量较低时，蛋白质的脯氨酸
羟化作用会受到抑制，进而使细胞分裂进程受阻[19],
细胞生长受到抑制, 导致嫩枝生长速率降低[22]。在
GLDH 干涉型的烟草(Nicotiana tabacum)中，抗坏血
酸含量降低 24%~27%, 则不利于细胞的分化和生
长[23]。因此，水稻幼苗抗坏血酸的不足，可能影响
其细胞的分裂与伸长，导致其生长与分蘖受到明显
抑制。除本研究报道 GI-2 株系种子发芽率和幼苗生
长状况较差外，Liu 等[24]还报道，与野生型相比，GI-2
株系的开花时间延迟、开花数及结实率明显降低。
综上所述，GLDH 超表达株系 GO-2 在种子萌
发及幼苗生长上都优于野生型株系ZH-11和干涉型
株系 GI-2。内源抗坏血酸的增加有利于水稻的生
长，为提高水稻产量打下了良好基础。在农业生产
278 热带亚热带植物学报 第 24 卷

上，可以选育抗坏血酸含量高的水稻品种，这既可
以提高种子的萌发率，也能使幼苗生长得更好。

致谢 感谢华南农业大学彭新湘教授提供水稻种子。

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