全 文 ：转录调控是基因表达调控的主要方式之一，在
植物生长发育和逆境胁迫响应过程中具有重要作
用。转录调控主要是通过转录因子与靶基因启动
子中特定的 DNA 序列结合，激活或抑制靶基因的
热带亚热带植物学报　2015， 23(5)： 543 ~ 552
Journal of Tropical and Subtropical Botany
收稿日期： 2014–11–10　　　　接受日期： 2015–01–28
基金项目： 广东省高等学校科技创新重点项目(2012CXZD001)； 国家自然科学基金项目(31172007)； 国家香蕉现代农业产业技术体系项目
(CARS-32-09)资助
作者简介： 徐群刚(1983~ )，男，硕士，研究方向为果蔬贮藏与保鲜。E-mail: 799608017@qq.com
* 通信作者 Corresponding author. E-mail: chenjianye@scau.edu.cn
香蕉果实冷胁迫相关MaWRKY11转录因子的特性、
互作蛋白筛选与鉴定
徐群刚, 邝健飞, 单伟, 陆旺金, 陈建业*
(华南农业大学园艺学院 , 广东省果蔬保鲜重点实验室，广州 510642)
摘要： 为探讨香蕉(Musa acuminata)响应冷胁迫的分子机制，从香蕉果实冷害的数字基因表达谱中筛选并分离了 1 个 WRKY
转录因子，命名为 MaWRKY11。MaWRKY11 具有 2 个 WRKY 保守结构域，属于 I 类 WRKY 成员，定位于细胞核，是核蛋白。
MaWRKY11 具有转录激活活性，且激活区在 N 端。实时荧光定量 PCR 分析表明 MaWRKY11 受冷胁迫诱导，外源茉莉酸甲酯
(MeJA)处理减轻香蕉果实冷害的同时也上调了其表达。另外，酵母双杂交筛选表明，MaWRKY11 可与脱水诱导的早期应答
蛋白 MaERD 相互作用。这些表明 MaWRKY11 可能通过与逆境相关蛋白如 MaERD 互作来响应香蕉果实的冷胁迫。
关键词： 香蕉； 果实； WRKY 转录因子； 冷胁迫； 互作蛋白
doi: 10.11926/j.issn.1005–3395.2015.05.009
Characterization and Interacting-protein Identification of MaWRKY11
Transcription Factor Related to Cold Stress from Banana Fruits
XU Qun-gang, KUANG Jian-fei, SHAN Wei, LU Wang-jin, CHEN Jian-ye*
(Guangdong Key Laboratory for Postharvest Science, College of Horticulture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)
Abstract: In order to understand the molecular mechanism, one WRKY transcription factor, named as MaWRKY11,
was isolated and identified from Digital Gene Expression Data (DGE) of banana (Musa acuminata) fruits. The
results showed that MaWRKY11 contained two WRKY conserved domains, belonging to Group I of WRKY
family, and located in nucleus as a nuclear protein. The MaWRKY11 possessed transcriptional activity in yeast
cells and the transcriptional domain located at its N-terminus. Moreover, real-time quantitative PCR displayed
that MaWRKY11 was induced by cold stress, and chilling injury of banana fruits reduced and the expression of
MaWRKY11 was up-regulated treated by MeJA. In addition, C-terminus of MaWRKY11 was used as a bait to
screen its potential interacting proteins by using yeast two-hybrid system, and it was found that MaWRKY11
could interact with early responsive to dehydration protein, MaERD, which was also induced by cold. So, it was
suggested that MaWRKY11 might respond to chilling stress through interacting with stress-related proteins, such
as MaERD.
Key words: Banana; Fruit; WRKY transcription factor; Chilling stress; Interacting protein
544 第23卷热带亚热带植物学报
转录和表达[1]。转录因子一般具有 DNA 结合域、转
录调控域(包括激活或抑制区)、寡聚化位点和核定
位信号等 4 个功能域[2]，其中 DNA 结合域决定了它
与 DNA 元件结合的特异性，转录调控域则决定了
它对基因表达起激活或抑制作用。根据转录因子的
DNA 结合域的特点，转录因子被分为若干个家族，
如 WRKY、AP2/EREBP、MYB、NAC 和 bZIP 等[3]。
WRKY 是一类植物所特有的转录因子家族，一
般都含有 1 或 2 个 WRKYGQK 序列和 1 个锌指结
构(约 60 个氨基酸)的区域[4]。研究表明，WRKY
转录因子广泛参与植物对生物和非生物逆境的应
答反应、器官发育和衰老等生理活动，尤其在抗病
和抗逆反应中起重要作用[5]。WRKY 转录因子通
过特异结合靶基因(如 NPR1、病程相关蛋白基因
PR 等)启动子区域的特异序列 TGACC(A/T) (W 盒 )
而调节靶基因的表达[6]。目前对 WRKY 转录因子
的研究主要集中在拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟
草(Nicotiana tabacum)、水稻(Oryza sativa)等模式植
物，而有关 WRKY 转录因子在采后果实抗逆反应
中的作用及其机制报道较少。
香蕉(Musa acuminata)是世界主要水果之一，
经济价值很高，也是我国华南地区北运和出口的
主要水果。香蕉在采后贮运过程中容易遭受低温
和病害，从而限制了其贮藏期并导致品质劣变。我
们最近的研究表明，MYC2 和 bHLH 等转录因子
参与茉莉酸甲酯(MeJA)诱导的果实耐冷性[7–8]。但
WRKY 转录因子是否也与 MeJA 诱导的抗冷性有
关，尚不明确。为此，我们利用香蕉冷害数字基因
表达谱，从中筛选获得了 1 个冷胁迫相关的 WRKY
转录因子 MaWRKY11，分析其亚细胞定位、转录激
活特性和基因表达特性，筛选了其互作蛋白，为深
入研究 MaWRKY11 基因的功能奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料和处理
香蕉品种为‘巴西’(Musa acuminate, AAA group
‘Brazil’)，果实于 2013 年 10 月采自广东省番禺香
蕉果园，采收成熟度为七至八成，落梳后立即运回
实验室。每梳香蕉分成单个蕉指后挑选均匀一致
的无病、虫、伤的果实，经 500 mg L–1 施保功处理后
取出晾干。香蕉果实分 2 组处理：第一组果实用蒸
馏水(H2O)处理作为对照，第二组果实用 0.1 mmol L
–1
茉莉酸甲酯(MeJA)处理。处理完后用聚乙烯薄
膜 袋 包 装 并 置 于 7℃ 恒 温 箱(MT-533 incubator，
Sanyo，Japan)中贮藏，分别于贮藏 0、1、3 和 5 d
取样，每次取 10 个香蕉果皮，用液氮速冻，储存
于 –80℃备用。
1.2 RNA提取
总 RNA 的提取参照 Wan 等的热硼酸法[9]进行。
1.3 cDNA克隆和序列分析
利用本课题组获得的冷害数字基因表达谱，筛
选获得了 1 个与冷胁迫相关的 WRKY 转录因子
MaWRKY11。设计引物(表 1)进行全长扩增，所用
引物全部由上海生工生物工程公司合成。经 PCR
扩增、连接、转化大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α
后，将鉴定为阳性的克隆送广州英潍捷基生物技术
有限公司测序。
利 用 ExPASy 在 线 分 析 工 具 pI/Mw (http://
www.expasy.ch/tools/pi_tool.html)对 MaWRKY11 基
因编码的蛋白质进行氨基酸基本特性分析。利用
Clustal X1.83 和 Genedoc 软件进行不同物种间同
源基因编码的氨基酸序列比对，并结合 MEGA5.0
软件构建系统进化树。
1.4 荧光定量PCR法
根 据 MaWRKY11 和 MaERD 测 序 结 果，设 计
荧光引物(表 1)，以 MaACT1 为内参基因[10]。提取
香蕉果皮组织的总 RNA，合成 cDNA 第一链。按
TaKaRa (SYBR Premix ExTaqⅡ)配制 PCR 体系，于
BioRad CFX9600 型荧光定量 PCR 仪进行实时定
量荧光 PCR 检测，反应程序为：94℃预变性 5 min，
然后 94℃变性 30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，
共 40 个循环。测定 Ct 值，根据 F=2–ΔΔCt 计算样品
MaWRKY11 和 MaERD 基因的相对表达量。
1.5 亚细胞定位
载体构建　　 采 用 pUC 骨 架 的 35S 启 动 子
驱动下的 GFP 为载体。根据 MaWRKY11 的 ORF
和 GFP 载体图谱设计亚细胞定位引物(表 1)。获
得正确的阳性克隆后，经 BamH I/Hind III 双酶切，
用 T4 DNA 连接酶连接到 pUC-GFP 载体从而得到
35S-MaWRKY11-GFP 融合表达载体，转入大肠杆
菌 DH5α，经 PCR、酶切筛选阳性克隆，对阳性克隆
第5期 545
进行测序验证。
BY2 原生质体分离及转化　　将 BY2 细胞(东
京大学 Toshio Sano 教授惠赠)从 MS 固体培养基转
接到 MS 液体培养基中，在 120 r min–1 的摇床上于
26℃暗培养，每 4~7 d 继代 1 次。取继代后 4~5 d
的悬浮细胞静置，待分层后去掉上清培养液，转入
过滤除菌的酶解液(2% 纤维素酶 R-10，0.5% 离析
酶 R-10，0.4 mol L–1 甘露醇，20 mmol L–1 KCl，
5 mmol L–1 MES，0.2% BSA，pH 5.7)中，于 26℃
黑暗酶解 4~5 h。酶解结束后，将滤液转移到 50 mL
离心管，以 100×g 离心 2 min，去上清液，用冰冷的
W5 溶液(154 mmol L–1 NaCl，125 mmol L–1 CaCl2，
5 mmol L–1 KCl，2 mmol L–1 MES，pH 5.7)洗涤沉淀。
加入 MMg 溶液(0.4 mol L–1 mannitol，15 mmol L–1
MgCl2，4 mmol L
–1 MES，pH 5.7)稀释原生质体，
使原生质体密度达到 104 mL–1，得到原生质体原
液。 取 质 粒 DNA 10 μg，原 生 质 体 原 液 100 μL，
PEG/Ca2+ 溶 液(40% PEG4000，0.2 mol L–1 甘 露
醇，100 mmol L–1 CaCl2) 110 μL 混 匀，23℃ 静 置
20~30 min，加入 0.44 mL W5 溶液稀释，混匀后以
100×g 离心 1 min，弃上清液，用 1 mL W5 溶液重悬。
26℃避光培养 12~16 h 后用 Zeiss Axioskep 2 Plus
型荧光显微镜观察。
1.6 转录激活分析
载体构建　　以 BamH I 和 Sal I 为酶切位点，
将 MaWRKY11 基因全长或片段从 pMD20-T 载体
转移至 BD 载体 pGBKT7 上，通过测序检测重组质
粒读码正确，所需引物见表 1。
酵母转化及阳性克隆鉴定　　按照试剂盒说明
书(Matchmaker2 Yeast Two-Hybrid System，Clontech)
方法制备酵母的感受态细胞，将 pGBKT7-MaWRKY11
或片段重组质粒加入到 50 µL 酵母 Y2H 菌株的感
受态细胞中，轻轻混匀；再加入 500 µL PEG/LiAc，
轻轻混匀，30℃水浴 30 min 诱导共转化酵母感受态
细胞；再加入 20 µL DMSO，混匀，42℃水浴 15 min；
以 12000×g 短 暂 离 心 15 s 后 去 除 上 清 液，加 入
1 mL YPDA，放于 30℃培养箱中培养 90 min；以
12000×g 短暂离心 15 s 后去除上清液；用 300 µL
0.9% 的 NaCl 重 悬 浮 后 分 别 涂 于 SD/-Trp、SD/-
Trp/-Ade 和 SD/-Trp/-His/-Ade/α-Gal 平板培养基进
行筛选培养，对重组质粒 pGBKT7-MaWRKY11 或
片段的自激活活性进行验证。
1.7 酵母双杂交筛库及互作确认
按 照 试 剂 盒(Matchmaker2 Yeast Two-Hybrid
System，Clontech)方法制备酵母的感受态细胞，
表 1 引物序列
Table 1 Sequence of primers
引物 Primer 序列 Sequence (5′~3′) 内切酶 Enzyme
扩增全长
Full length amplification
MaWRKY11 F: ATGGCTAAGACAGATGACAACAACG
R: TTACAGCTGAGGTCCTAGAGGAA
荧光定量
qPCR
MaWRKY11-RT F: CCGAAAGTAGAGCCCAAGGA
R: TGCTTGAAACAACTAAAAGAGAGGC
MaERD-RT F: AAGTCTACGCTGAACCCAAATG
R: GATCAATAGTGTCTGGCAGCAG
MaACT1-RT F: GAGGCACCAGTCCGTAGATAGC
R: CCGCCAGATGAAGGTACAACAT
亚细胞定位
Subcellular localization
MaWRKY11-GFP F: AGGATCCGATGGCTAAGACAGATGACAACAACG BamH I
R: TAAGCTTCAGCTGAGGTCCTAGAGGAAG Hind III
转录激活
Transactivation
MaWRKY11-BDF F: AGAATTCATGGCTAAGACAGATGACAACAACG BamH I
R: TGTCGACGCAGCTGAGGTCCTAGAGGAAG Sal I
MaWRKY11-BDN F: AGAATTCATGGCTAAGACAGATGACAACAACG BamH I
R: TGTCGACGCAGAAGGCCATTATGTTGTGGAG Sal I
MaWRKY11-BDC F: AGAATTCCAAAGGCCTGAGCCAACCCAA BamH I
R: TGTCGACGCAGCTGAGGTCCTAGAGGAAG Sal I
徐群刚等：香蕉果实冷胁迫相关MaWRKY11转录因子的特性、互作蛋白筛选与鉴定
546 第23卷热带亚热带植物学报
利用酵母双杂交系统将不具有自激活的诱饵载体
pGBKT7-MaWRKY11-C 质粒的 Y2H 酵母制备酵
母感受态细胞，并加入 10 μg 香蕉 cDNA 文库，轻
轻混匀；再加入 2.5 mL PEG/LiAc，轻轻混匀，30℃
水浴 30 min 诱导共转化酵母感受态细胞。将共
转化后的酵母感受态细胞涂布于营养缺陷型 SD/-
Trp/-Leu 固体平板培养基中，在 30℃培养箱中培
养 4 d 左右，挑取直径大的酵母阳性单克隆涂布于
SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/α-Gal 显蓝板上培养，筛选
蓝色阳性单克隆。挑选阳性克隆进行 PCR 鉴定、
测序，并对测序结果进行比对分析，初步获得候选
的互作蛋白。
按相同的方法制备酵母的感受态细胞。将
pGBKT7-MaWRKY11-C 和带有可能互作基因的
pGADT7 质粒共转化酵母感受态细胞中。将转化
后的酵母感受态细胞涂于 SD/-Trp/-Leu 平板上。
若酵母细胞能在 SD/-Trp/-Leu 平板上生长，则说
明 2 个互作的质粒已转入酵母感受态细胞中。挑取
在 SD/-Trp/-Leu 平板上生长的酵母单克隆于 1 mL
YPDA 液体培养基中 30℃振荡培养 2 d，将振荡
培养后的酵母菌液吸取 1 μL 点到带有 X-α-gal 的
SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade 营养缺陷型平板上，继续在
30℃培养箱中培养 3 d 左右，长出蓝色的酵母单克
隆菌落即为阳性的互作结果。
2 结果和分析
2.1 MaWRKY11的克隆和序列分析
从本课题组获得的冷害数字基因表达谱中
筛 选 获 得 了 1 个 冷 胁 迫 相 关 的 WRKY 转 录 因
子，命 名 为 MaWRKY11。 经 冷 害 处 理 的 香 蕉 果
实 RNA 中通过 RT-PCR 扩增，获得与预期片段长
度 2001 bp 一致的目的条带，经测序获得其全长
序 列。MaWRKY11 的 最 大 ORF 长 度 为 1998 bp，
编码 729 个氨基酸，编码的多肽蛋白链分子量为
79.21 kDa、等电点为 5.42。氨基酸序列比对表明，
MaWRKY11 含有 2 个 WRKY 保守结构域(图 1)。
在 GenBank 数 据 库 进 行 BLAST 同 源 性 分 析，结
果 表 明：MaWRKY11 蛋 白 与 苹 果(Malus pumila)
MaWRKY7 (ADL36865.1)、 陆 地 棉(Gossypium
hirsutum) GhWRKY62 (AGV75959.1)、西洋参(Panax
quinquefolius) PqWRKY7 (AEQ29020.1)和 毛 果 杨
(Populus trichocarpa) PtWRKY34 (XP_006370796.1)
的同源性分别为 55%、53%、51% 和 50%。
根据香蕉 MaWRKY11 基因编码的氨基酸序
列和其他物种 WRKY 类蛋白的氨基酸序列构建
系统进化树。结果表明(图 2)，MaWRKY11 与拟
南 芥 的 AtWRKY20 聚 在 一 起，他 们 和 拟 南 芥 的
AtWRKY44 和 AtWRKY10 组成 1 个亚群，该亚群
的蛋白均含有 2 个 WRKY 保守结构域，同属于第
1 类。
2.2 MaWRKY11的亚细胞分析
利 用 BamH I 和 EcoR I 对 pMD-MaWRKY11
载体和亚细胞定位载体 pBI221 进行双酶切，经纯
化、连接，在 35S 启动子驱动下构建与 GFP 共融合
的重组载体 35S:MaWRKY11-GFP。采用 PEG 侵
染烟草 BY2 悬浮细胞系细胞原生质体的方法进行
35S:MaWRKY11-GFP 亚细胞定位分析。从图 3 可
见，与整个细胞都发光的阳性对照 35S:GFP 相比，
35S:MaWRKY11-GFP 融合蛋白只在细胞核中有绿
色荧光，并与带有核定位信号的 mCherry 红色荧光
相重合，表明 MaWRKY11 定位于细胞核，是核蛋
白。
2.3 MaWRKY11的转录激活分析
采 用 GAL4 系 统，在 Y2H Gold 酵 母 中 对
MaWRKY11 的转录激活活性进行分析。首先将
MaWRKY11 的 ORF 连 接 到 GAL4 系 统 的 DNA
结合域，构建 DBD-MaWRKY11-F 重组载体质粒，
将重组载体质粒转入 Y2H Gold 酵母菌株，确认在
SD/Trp– 培养基上生长，说明外源质粒顺利转入酵
母。将转入外源质粒的酵母菌株接种在含有金担
子素 A (AbA)的营养缺陷型培养基 SD/Trp–Ade–His–
AbA+ 上进行筛选，结果转入 DBD-MaWRKY11-F
和转入阳性对照 DBD-p53+T-antigen 的酵母菌株
一样都可以正常生长，且经 x-α-Gal 活性检测均变
蓝(图 4)，表明 MaWRKY11 在酵母内都具有转录激
活活性，且 MaWRKY11 的转录激活区域位于 N 端
(图 4)。
2.4 MaWRKY11香蕉冷害过程中的表达分析
香蕉果实对低温敏感，在低于 11℃的环境中贮
藏即会产生冷害。我们前期的试验表明，香蕉果实
在 7℃贮藏 3 d 时冷害症状开始出现，且随着贮藏
时间的延长，冷害症状逐渐加剧，外施 0.1 mmol L–1
第5期 547
图 1 香蕉 MaWRKY11 与其他植物 WRKY 蛋白的氨基酸序列比对。MaWRKY11：香蕉；FvWRKY2：野草莓；JcWRKY11：麻风树；NtWRKY4：
烟草；PqWRKY7：西洋参；PtWRKY34：毛果杨；VvWRKY2：葡萄。
Fig. 1 Alignment of sequences of MaWRKY11 and WRKY in other species. MaWRKY11: Musa acuminata; FvWRKY2: Fragaria vesca; JcWRKY11:
Jatropha curcas; NtWRKY4: Nicotiana tabacum; PqWRKY7: Panax quinquefolius; PtWRKY34: Populus trichocarpa; VvWRKY2: Vitis vinifera.
徐群刚等：香蕉果实冷胁迫相关MaWRKY11转录因子的特性、互作蛋白筛选与鉴定
548 第23卷热带亚热带植物学报
图 2 香蕉 MaWRKY11 与 WRKY 蛋白家族的系统进化树
Fig. 2 Phylogenetic tree of WRKY proteins in banana and other plants
图 3 MaWRKY11 在烟草 BY2 原生质体的亚细胞定位
Fig. 3 Subcellular localization of MaWRKY11 in tobacco BY2 protoplasts
第5期 549
MeJA 可显著减轻香蕉果实冷害症状的发生[7]。利
用实时荧光定量 PCR 技术分析 MaWRKY11 在香
蕉冷害及 MeJA 减轻冷害过程中的表达特征，结果
表明，MaWRKY11 基因随着果实冷害进程而表达
增强，表达峰值出现在第 3 天(此时香蕉果实开始
出现冷害症状)，为对照(0 d)的 2.77 倍，随后表达略
微减弱；外施 MeJA 在减轻香蕉冷害的同时明显上
调了 MaWRKY11 的表达，并且表达最高值也是出
现在第 3 天，为对照(0 d)的 2.81 倍(图 5)。
2.5 MaWRKY11互作蛋白的筛选、鉴定
由于 MaWRKY11 本身具有转录自激活活性
(图 4)，因此我们选择没有自激活的 MaWRKY11
的 C 端序列作为诱饵蛋白进行文库筛选。将诱饵
载体转入酵母菌株 Y2H Gold 中，挑选转化子制备
酵母感受态细胞，再将 10 μg 香蕉 cDNA 文库质粒
转入到该感受态细胞，涂板于营养缺陷型 SD/-Trp/-
Leu 培养基上，在 30℃培养箱中培养 4 d 左右(图
6: A)。挑取候选克隆于 1 mL YPDA 液体培养基中
培养，吸取各候选克隆约 1 μL 菌液点在 SD/-Trp/-
His/-Ade/-Leu/α-Gal 平板上，于 30℃酵母培养箱中
培养 2 d，统计显蓝克隆，挑选显蓝克隆进行测序分
析。结果表明，有一个互作蛋白为脱水诱导早期应
答蛋白(Early responsive to dehydration protein，简称
ERD)，初步命名为 MaERD。
为了确认 MaWRKY11 与筛选出来的互作蛋
白 MaERD 的相互作用，将 MaERD 的质粒回转到
含诱饵的酵母中进行回转互作验证。图 7 表明，
MaERD 在 SD-Trp-Leu-His-Ade 筛选培养基上能够
生长，同时能够检测到 β-半乳糖苷酶活性(显示为
蓝色)，说明 MaERD 跟 MaWRKY11 在酵母中存在
相互作用。
采用实时荧光定量 PCR 研究 MaERD 基因在
香蕉果实冷胁迫过程的表达。结果表明(图 8)，与
MaWRKY11 类似，MaERD 基因也是受冷诱导上调，
并且在冷害 1 d 时出现表达最高值，约为对照(0 d)
图 5 MaWRKY11 在冷胁迫及 MeJA 处理的香蕉果实中的表达
Fig. 5 Expression of MaWRKY11 in banana fruits under chilling stress
and MeJA treatment
图 4 MaWRKY11 在酵母体内的转录活性分析
Fig. 4 Transcriptional activity of MaWRKY11 in yeast cells
徐群刚等：香蕉果实冷胁迫相关MaWRKY11转录因子的特性、互作蛋白筛选与鉴定
550 第23卷热带亚热带植物学报
的 2.20 倍，并随后出现缓慢下降的表达趋势，表明
MaERD 也参与了香蕉果实冷害胁迫过程。
图 6 MaWRKY11 互作蛋白的筛选。A：筛库的互作蛋白；B：在 SD/-Trp/-His/-Ade/-Leu/α-Gal 上显色的阳性克隆。
Fig. 6 Screen of interacting proteins with MaWRKY11. A: Clones identified by screening cDNA library; B: The positive clones were tested on SD/-
Trp/-His/-Ade/-Leu/α-Gal plates.
图 7 MaWRKY11 与候选蛋白 MaERD 在酵母细胞中的互作鉴定
Fig. 7 Interaction identification of MaWRKY11 with candidate protein MaERD in yeast cells
图 8 MaERD 在冷胁迫香蕉果实中的表达
Fig. 8 Expression of MaERD in banana fruit under cold stress
3 讨论
香蕉是我国华南地区北运和出口的主要水果，
具有很高的经济价值。然而，香蕉是典型的热带水
果，对低温敏感，低于 11℃时即会产生冷害，严重
影响了香蕉果实的贮藏、运输及销售等。香蕉冷害
症状主要表现为果实不能正常成熟，果皮出现褐
斑、凹陷等，果肉催熟后不能变软等症状[11]。目前，
可通过采用植物生长调节剂，如脱落酸(ABA)和
腐胺[12]、丙烯(乙烯类似物)[13]、过氧化氢(H2O2)
[14]、
水杨酸(SA)[14]、茉莉酸甲酯(MeJA)[7]、硝普钠(SNP,
NO 供体)[15]、γ-氨基丁酸(GABA)[16]等处理香蕉果
实来延缓其冷害症状的发生。近年来，对果实冷害
的研究逐渐从调控措施转到分子机理的研究上，尤
其是转录因子介导的转录调控机理。MYC2 是一
第5期 551
类 bHLH 型的转录因子，也是茉莉酸信号转导途径
中的转录因子，其中香蕉 MaMYC2a 和 MaMYC2b
均 能 与 冷 信 号 途 径 中 的 重 要 元 件 MaICE1 和
MaCBF1 互作，共同参与 MeJA 诱导的香蕉果实
耐冷进程[7]。有趣的是，香蕉其它 bHLH 转录因子
MabHLH1/2/4 也可与 MaICE1 相互作用，形成一个
大的蛋白复合体共同调控果实冷害[8]。最新研究还
表明，冷胁迫转录因子 MaNAC1 为 MaICE1 的直
接靶基因，并且 MaICE1 对 MaNAC1 的转录调控
依赖于 MaICE1 的磷酸化修饰，同时 MaNAC1 与
MaCBF1 存在相互作用，揭示了植物 ICE-CBF 抗
冷途径是一个复杂的调控网络[17]。而迄今为止，香
蕉果实中鲜有关于 WRKY 转录因子调控果实耐冷
性的研究报道。
WRKY 蛋 白 是 植 物 特 有 的 转 录 因 子，最 早
是 从 甘 薯(Ipomoea batatas)中 分 离 出 来[18]，通 常
含 有 1~2 个 WRKY 保 守 结 构 域，其 核 心 序 列 为
WRKYGQK，能特异结合 TGACC(A/T)(W 盒)元件[6]。
目前已从多种植物中鉴定出 WRKY 转录因子，
如番茄(Lycopersicum esculentum)[19]、苹果[20]、葡萄
(Vitis vinifera)[21]、香蕉[22]、番木瓜(Carica papaya)[23]
等。根据保守结构域特征，植物 WRKY 家族可分
为 3 类：第 1 类成员(GroupⅠ)蛋白序列含有 2 个
典型的 WRKY 结构域和 C2H2 锌指型结构；第 2 类
成员(GroupⅡ)只有 1 个典型的 WRKY 结构域和
C2H2 锌指型结构，并可进一步分为 5 个亚类(a~e)；
第 3 类成员(Group Ⅲ)含有 1 个典型的 WRKY 结
构域和 C2-H/C 锌指型结构[4]。此外，功能相似的
基因和 / 或蛋白通常会聚合在一起，如第Ⅰ类和第
Ⅲ类 WRKY 均参与表皮发育与衰老、植物非生物
胁迫等活动，而第Ⅱ类 WRKY 则参与低磷胁迫、抗
病反应、次生根形成和非生物胁迫等活动[24]。本研
究从香蕉冷害数字表达谱中挑选了 1 个冷害上调
的 WRKY 转录因子，命名为 MaWRKY11，编码的
氨基酸序列含有 2 个 WRKY 保守结构域(图 1)，属
于Ⅰ类 WRKY 家族(图 2)。与其他 WRKY 相似[25]，
MaWRKY11 也是定位在细胞核，并且全序列和 N
端具有转录激活活性(图 4，5)。WRKY 转录因子可
受多种植物生长调节剂调控，包括水杨酸(SA)、茉
莉酸(JA)、脱落酸(ABA)和乙烯等[26]。本研究结果
表明，MaWRKY11 受低温诱导上调表达，而茉莉酸
甲酯(MeJA)在减轻果实冷害的同时也上调其表达
(图 6)，推测 MaWRKY11 在香蕉果实冷害过程具有
重要作用。对葡萄的研究也有类似的结果，59 个
VvWRKYs 中，15 个受冷诱导并呈现差异表达特
征[21]。另外，筛选和鉴定 WRKY 的互作蛋白对于
揭示 WRKY 转录因子在植物信号转导中的作用具
有重要意义[27]。本研究以 MaWRKY11-C 为诱饵进
行香蕉果实冷害相关酵母双杂 cDNA 文库的筛选，
经酵母回转验证证实 MaWRKY11 与 MaERD 存
在相互作用(图 7)。ERD 为一类亲水性蛋白，最早
在脱水诱导 1 h 的拟南芥中获得[28]，ERD 基因除
受干旱胁迫诱导外，还受高盐、低温、伤害、ABA、
水杨酸、病原菌等多种生物胁迫和非生物胁迫诱
导[29]。我们的研究也表明，MaERD 受低温胁迫诱
导，并且在冷害 1 d 时表达最高(图 8)。尽管已证实
拟南芥和小麦(Triticum aestivum)的 WRKY 可以结
合 RD29A、RD29B 和 DREB2A 的启动子[24,30]，但
目前还没有 WRKY 转录因子与 ERD 相互作用的
报道。因此，MaWERKY11 与 MaERD 互作形成
蛋白复合体参与香蕉果实冷胁迫响应的机理还有
待进一步研究。
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