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甘薯质体中的乙酰辅酶A 羧化酶亚基基因accD 的克隆与序列分析



全 文 :植物生理学通讯 第 45卷 第 11期,2009年 11月 1065
收稿 2009-07-31 修定  2009-09-30
资助 陕西省教育厅专项( 0 9 J K 7 7 7 )、国家自然科学基金
(30900914和 30671082)、西北大学西部资源生物与生
物技术重点实验室开放基金。
* 通讯作者(E-mail: wangyh@nwu.edu.cn; Tel: 029-88303484)。
甘薯质体中的乙酰辅酶A羧化酶亚基基因 accD的克隆与序列分析
王玉华 *, 郝建国, 贾敬芬
西北大学生命科学学院, 陕西省生物技术重点实验室, 西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室, 西安 710069
提要: 依据烟草质体全基因组序列设计引物, 以甘薯质体基因组DNA为模板, PCR扩增包含质体 accD基因完整编码区在
内的一段序列(GenBank登录号为GQ395771)。序列分析表明: 该片段全长为2 209 bp, 包括1 548 bp的accD基因编码序列,
推测编码 515个氨基酸的蛋白质, 该蛋白序列具有异质型β-CT中保守的锌指结构和C末端 5个基元。同时绘制了该DNA
片段的限制性酶切图谱。相似性比较显示, 甘薯 accD基因与大豆、马铃薯、拟南芥、人参、莴苣、葡萄、海岛棉、甘蓝、
辣椒、菠菜、番茄和烟草的 accD基因核苷酸相似性为 72%~87%, 氨基酸相似性为 58%~83%。
关键词: 甘薯; 乙酰辅酶A羧化酶(ACCase); accD基因; 克隆
Cloning and Sequence Analyses of Plastid-Encoded Acetyl-CoA Carboxylase
Subunit Gene accD of Sweet Potato [Ipomoea batatas (L.) Lam.]
WANG Yu-Hua*, HAO Jian-Guo, JIA Jing-Fen
College of Life Sciences, Northwest University, Shaanxi Provincial Key Laboratory of Biotechnology, Key Laboratory of Resource
Biology and Biotechnology in Western China, Ministry of Education, Xi’an 710069, China
Abstract: The fragment containing plastid accD gene (GenBank accession number: GQ395771) encoding the
carboxyltransferase β subunit of acetyl-CoA carboxylase (ACCase) was cloned from plastid genome DNA in
sweet potato (Ipomoea batatas). Sequencing analysis indicated that sweet potato accD is 2 209 bp with an 1 548
bp open reading frame (ORF), encoding a 515-amino-acid polypeptide which contained the zinc finger structure
and the C-terminal regions with five motifs. The restriction map of this cloned fragment was also established.
The BLAST results showed that the homologies of this gene with soybean, potato, tobacco, Arabidopsis thaliana,
ginseng, lettuce, grape, sea-island cotton, cabbage, pepper, spinach, tomato and tobacco were from 72% to
87%, and the similarities of the amino acid sequences were from 58% to 83%.
Key words: sweet potato (Ipomoea batatas); acetyl-CoA carboxylase (ACCase); accD gene; cloning
作为脂肪酸生物合成关键酶的乙酰辅酶A羧
化酶(acetyl-CoA carboxylase, ACCase)是碳流进入
脂肪酸合成途径的调控点(Slabas和 Fawcett 1992;
Ramli等 2002; 王伏林等 2006; 崔燕等 2008)。在
植物体内有位于质体的异质型和位于胞质溶胶中的
同质型两种类型的 AC C a s e , 异质型 AC C a s e
(ACCase Ⅱ)因与大肠杆菌ACCase属于同一类型,
也称原核型ACCase。它是一个由 4个亚基组成的
多酶复合体, 其中生物素羧化酶(biotin carboxylase,
BC)亚基、生物素羧基载体蛋白(biotin carboxyl
carrier protein, BCCP)亚基以及羧基转移酶(carboxy
ltransferase, CT)的 α亚基(α-CT)分别由核基因
accC、accB和 accA编码, 而 β-CT亚基由质体基
因组中的accD基因编码(Sasaki等1995; Ke等2000;
Lee等 2004)。3个细胞核编码亚基基因在细胞质
中转录、翻译成大的前体蛋白, 之后转运到质体中
去除导肽, 最后与质体基因编码的 β-CT亚基组装
成ACCase复合体(Reverdatto等1999; Ke等2000)。
有研究表明, 质体基因组编码 β -CT亚基是
ACCase活性发挥的限制因子, 质体accD基因的超
量表达可能会提高ACCase的总体水平(Sasaki和
Nagano 2004)。近年来, 对 β-CT亚基的研究不断
深入, 已从豌豆(Sasaki等 1989)、油菜(Elborough
等 1996)、马铃薯(Lee等 2004)、拟南芥(Ke等
2000)、棉花(张煜星等 2008)、油棕(Nakkaew等
2008)、甘蓝型油菜及其近缘种(王伏林等 2008)等
多种植物中克隆到β-CT亚基的编码基因accD。本
植物生理学通讯 第 45卷 第 11期,2009年 11月1066
文以甘薯为材料, 根据烟草质体全基因组序列设计
引物, 采用 PCR方法克隆了包含质体 accD基因完
整编码区在内的一段甘薯质体DNA片段, 为将来利
用质体转化系统在植物质体内过量表达该基因以提
高油料作物种子含油量研究提供基础材料, 同时也
为在甘薯中开展质体基因工程研究提供质体基因组
序列信息。
材料与方法
材料为甘薯[Ipomoea Batatas (L.) Lam.]‘京 3’
无菌苗, 由北京市农林科学院小麦中心提供。在不
含植物生长调节剂的MS固体培养基中继代培养。
取继代培养30 d左右的叶片用于质体基因组DNA
的提取。
取继代培养 4周左右的组培苗叶片 30 g, 4 ℃
黑暗饥饿过夜, 之后用高盐低pH法(龚晓松和阎隆
飞 1991)提取质体基因组DNA (chloroplast DNA,
cpDNA)。各取 2 μL cpDNA, 分别用BamHI和PstI
消化, 之后进行琼脂糖凝胶电泳检测 cpDNA的质
量。纯化的质体DNA稀释到一定浓度后用于PCR
扩增。
根据烟草质体全基因组全序列资料, 用软件
Oligo 6设计一对引物。上游引物为 accD-U: 5
TTAGTATTAGACGAGATTTTAC 3; 下游引物为
accD-L: 5 GGGAATTAATCAAATTTCGAC 3。引
物委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
取2 μL稀释后的甘薯质体基因组DNA (约50
ng)为模板, 采用 50 μL的反应体系: 10×PCR缓冲
液 5 μL、dNTPs (2.5 mmol·L-1) 4 μL、上下游引
物(10 μmol·L-1)各 2 μL、Tag DNA聚合酶(2 U·L-1)
0.5 μL, 其余用双蒸水补齐。PCR反应在 PTC-100
Peltier基因扩增仪上进行, 反应程序为: 94 ℃起始
变性 5 min; 然后进行 30个循环的扩增反应, 每个
循环包括 94 ℃变性 1 min、56 ℃退火 1 min以及
72 ℃退火 1.5 min; 最后于 72 ℃下延伸 7 min。
PCR产物以琼脂糖凝胶电泳分离, 目的产物用
锋利的刀片割下, 用胶回收试剂盒回收纯化, 之后克
隆进 pGEM-T载体, 转化大肠杆菌DH5α菌株, 选
取阳性克隆提取质粒DNA, 酶切鉴定后送上海生工
生物工程技术服务有限公司测序, 对测序结果用软
件进行序列分析, 绘制限制性酶切图谱, 并与其他近
缘种的核苷酸序列、氨基酸序列进行比较分析。
实验结果
1 accD基因的克隆与序列分析
按材料与方法所示, 提取甘薯cpDNA, 以稀释
后的甘薯 cpDNA作模板, 以 accD-U和 accD-L为
引物, 在TaKaRa的PrimeSTAR HS DNA聚合酶作
用下, PCR扩增获得大小为 2.0 kb左右的片段(图
1), 与预期的目的片段大小一致。将扩增得到的片
段回收纯化后与 pMD18-T载体连接, 得到重组质
粒 pMD18-accD, 经 XbaI和 PstI双酶切验证正确,
之后送上海生工生物工程技术服务有限公司测序,
测序结果已经登录GenBank, 登录号为GQ395771。
序列分析表明, 重组质粒中插入片段全长2 209 bp,
其中包含一个 1 548 bp的 accD基因开放阅读框
(open reading frame, ORF), 推测编码 515个氨基
酸。用DNAMAN软件对克隆到的甘薯 accD基因
片段进行限制性酶切分析, 绘制限制性酶切图谱(图
2), 结果显示, 在筛选的 24个常见的限制性内切酶
中, 有 9个酶切位点位于该片段中。
2 accD基因序列的相似性比较和进化分析
比较甘薯accD基因与其他植物的accD基因相
似性的结果(表 1)显示, 该基因编码区与大豆、马铃
薯、拟南芥、人参、莴苣、葡萄、海岛棉、甘
蓝、辣椒、菠菜、番茄和烟草的 accD 基因核苷
酸相似性为72%~87%, 氨基酸相似性为58%~83%。
无论是核苷酸序列还是氨基酸序列, 都表现为甘薯
与烟草的相似性最高, 而与甘蓝的相似性最低。
以 accD 基因的核苷酸序列为考核指标, 用
图 1 甘薯 accD基因片段的扩增
Fig.1 Amplification of sweet potato accD gene fragment
M: DL2000+DL15000标记; 1: H2O作负对照; 2: 甘薯 accD
g e n e 片段。
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DNASTAR软件分析了甘薯与表1所列物种之间的
亲缘关系, 并建立进化树(图 3)。结果显示: 参与
分析的13个物种在进化树上呈现两大分支, A支包
括除菠菜之外的 12个物种, B支仅含蓼科的菠菜。
表 1 不同物种 accD基因相似性比较
Table 1 Comparison of nucleotide and amino acid sequences of accD gene of I. batatas with other plants
种名 accD基因核苷酸序列相似性 /% accD基因氨基酸序列相似性 /%
甘薯(Ipomoea batatas) 100 100
马铃薯(Solanum tuberosum) 8 0 8 2
番茄(Solanum lycopersicum) 7 9 8 2
辣椒(Capsicum annuum) 8 0 7 4
烟草(Nicotiana tabacum) 8 7 8 3
人参(Panax ginseng) 8 3 7 7
海岛棉(Gossypium barbadense) 7 3 7 1
葡萄(Vitis vinifera) 7 7 6 8
拟南芥(Arabidopsis thaliana) 7 3 6 4
甘蓝(Brassica oleracea) 7 2 5 8
大豆(Glycine max) 7 3 6 4
莴苣(Lactuca sativa) 7 8 7 1
菠菜(Spinacia oleracea) 7 7 7 4
图 2 甘薯 accD基因片段的限制性酶切图谱
Fig.2 The restriction map of sweet potato gene accD fragment
A支里面又划分成两个子分支C和D, 甘薯和十字
花科的拟南芥、甘蓝, 菊科的莴苣以及豆科的大豆
属于同一个子分支, 该系统进化树显示的分类结果
与植物学分类的结果一致。
图 3 基于 accD基因编码区构建的进化树
Fig.3 The dendrogram of sweet potato based on accD ORF
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3 accD基因编码蛋白质结构分析
有研究表明锌指结构单元CX2CX13-15CX2C在
所有的异质型 β-CT中是保守的(Nakkaew等 2008;
王伏林等 2008)。在甘薯 accD基因编码的蛋白质
中, 保守的锌指结构单元序列为CEKCYGLNYKK-
表 2 accD基因编码产物C末端 5个高度保守的氨基酸序列基元
Table 2 Five highly conserved amino acid sequence motifs on C-terminal region of protein encoded by accD genes
种名 I II III IV V
甘薯 GSMGSVVG PLIIVCASGGARMQE QMAKISSAL PTTGGVTASFGMLGDIIIVEP FAGKRVIEQTL
马铃薯 GSMGSVVG PLIIVCASGGARMQE QMAKISSAL PTTGGVTASFGMLGDIIIAEP FAGKRVIEQTL
番茄 GSMGSVVG PLMIVCASGGARMQE QMAKISSAL PTTGGVTASFGMLGDIIIAEP FAGKRVIEQTL
辣椒 GSMGSVVG PLIIVCASGGARMQE QMAKISSAL PTTGGVTASFGMLGDIIIAEP FAGKRVIEQTL
烟草 GSMGSVVG PLIIVCASGGARMQE QMAKISSAL PTTGGVTASFGMLGDIIIAEP FAGKRVIEQTL
人参 GSMGSVVG PLIIVCASGGARMQE QMAKISSAL PTTGGVTASFGMLGDIIIAEP FAGKRVIEQTL
海岛棉 GSMRSVVG PLILVCASGGARMQE QMAKISSAL PTTGGVTASFGMLGDIIIAEP FAGKRVIEQTL
葡萄 GSMGSVVG PLILVCSSGGARMQE QMAKISSAL PTTGGVTASFGMLGDIIIAEP FAGKRVIEQTL
拟南芥 GSMGSVVG PLILVCSSGGARMQE QMAKISSVL PTTGGVTASFGMLGDIIIAEP FAGKRVIEQTL
甘蓝 GSMGSVVG PLILVCSSGGARMQE QMAKISSVL PTTGGVTASFGMLGDIIIAEP FAGKRVIEQTL
大豆 GSMGSAVG PLILVCASGGARMQE QMAKISSAL PTTGGVTASFGMLGDIIIAEP FAGKRVIEQTL
莴苣 GSMGSVVG PLIIVCASGGARMQE QMAKISSAL PTTGGVTASFGMLGDIIIAEP FAGKRVIEQTL
菠菜 GSMGSVVG PLIIVCASGGARMQE QMAKISSVL PTTGGVTASFGMLGDIIIAEP FAGKRVIEQTL
  方框内为不保守的氨基酸。
FLKSKMHICEQC。此外, 表 2显示, 在甘薯和其
他植物的accD基因编码产物中, C末端均有5个高
度保守的基元, 其中基元 I为乙酰辅酶A的催化中
心结合位点, 基元 II为乙酰辅酶A的催化中心位点
(Lee等 2004)。
讨  论
ACCase在生物体内催化乙酰辅酶A羧化形成
丙二酰辅酶A, 为脂肪酸和许多次生代谢产物的合
成提供底物(Konishi等1996), 是脂肪酸生物合成途
径的限速酶, 因常被用作通过基因工程手段提高油
料作物含油量的研究目标而备受关注。但迄今为
止, 这方面的研究进展并不大, 原因是异质型的
ACCase是四亚基复合物, 且4个亚基分别由3个核
基因和 1个质体基因编码, 要使 4个基因同时在质
体中表达并组装成有活性的蛋白难度较大。有研
究认为, 由质体编码的accD基因是该复合酶活性的
限制因子(Sasaki和Nagano 2004), 也就是说, 用在
质体中过量表达异质型ACCase基因accD, 有望实
现脂肪酸合成的数量控制。例如, Madoka等(2002)
研究发现过量表达accD基因的烟草质体ACCase活
性水平大幅提高, 脂肪酸含量也相应增加, 这说明
质体accD基因的过量表达对提高作物的含油量有
作用。ACCase不仅是脂肪酸合成的关键酶和限速
酶, 且对大多数生物来说也是一个必须酶, 例如,
Kode等(2005)用同源重组的方法剔除烟草accD基
因, 发现烟草植株叶片出现白绿色斑点或叶片减少,
该研究证明质体 accD基因对植物叶片生长起作
用。与此相反的是, Madoka等(2002)在烟草质体
中过量表达 accD后, 烟草叶片长度增加。
鉴于质体ACCase的重要性, 迄今已有多个物
种的β-CT亚基基因accD已得到, 而关于甘薯accD
基因的克隆还未见报道。本文从甘薯中克隆到包
含质体 accD基因完整编码区在内的一段 2 209 bp
的质体片段, 编码含515个氨基酸残基的蛋白质, 通
过与烟草、马铃薯等其他植物比较的结果表明, 与
大多数植物中的β-CT亚基一样, 甘薯β-CT亚基在
C端含有 5个高度保守的基元, 这种保守性说明
accD基因在进化过程中有很强的惰性。甘薯accD
基因的克隆为将来采用质体转化系统在植物质体内
过量表达此基因, 提高油料作物种子含油量的研究
积累了基础材料, 同时也为在甘薯中开展质体转化
技术提供了质体基因组序列的信息。
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