全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 1期，2010年 1月 1
巴西橡胶树的脂酰辅酶 A 还原酶 cDNA 克隆及其序列分析
罗明武 1, 邓柳红 2,*
1海南大学材料与化工学院, 海口 570228; 2中国热带农业科学院热带生物技术研究所, 海口 571101
提要: 从巴西橡胶树差减cDNA文库中筛选到一个与脂酰辅酶A还原酶同源性较高的基因片段, 根据该基因片段序列信息,
设计特异引物, 采用 RACE进行差异片段的 5和 3端的扩增, 获得长度为 1 365 bp的 cDNA 克隆 R28 (GenBank登陆号:
AY461413)。序列分析表明, 该基因包含 1 149 bp的开放阅读框, 5-UTR为 96 bp, 3-UTR为 128 bp, 编码 382个氨基酸, 推测
其蛋白质的分子量为43.5 kDa, 等电点为8.97, 有一个跨膜螺旋区(187至215位氨基酸)和1个由17个氨基酸组成的信号肽(1
至17 位氨基酸)。R28含有脂酰辅酶A还原酶的保守区(NADP结合蛋白保守区), 推测该基因是一个脂酰辅酶A还原酶基因。
关键词: 巴西橡胶树; 胶乳; 酰基辅酶A还原酶
Cloning and Sequence Analysis of Acyl-CoA Reductase cDNA from Hevea
brasiliensis Muell. Arg.
LUO Ming-Wu1, DENG Liu-Hong2,*
1College of Materials and Chemical Engineering, Hainan University, Haikou 570228, China; 2Institute of Tropical Bioscience and
Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101, China
Abstract: A cDNA clone related to lipid transportation and metabolism was isolated by screening subtracted
latex cDNA library. According to its sequences information, a novel full-length cDNA termed R28 (GenBank
number: AY461413) was obtained by using rapid amplification of cDNA ends (RACE). R28 was 1 365 bp long
containing a 1 149-bp ORF, flanked by a 96-bp 5-UTR and a 128-bp 3-UTR. It encoded 382 amino acids with
a theoretical molecular weight of 43.5 kDa and an isoelectric point of 8.97. Hydropathy and transmembrane
motif analysis of deduced amino acid sequences indicated that R28 possessed a transmembrane spanning do-
main (185−215 aa), and contained a cleaved signal peptide (1−17 aa). The result of the conserved domains
analysis indicated that R28 not only has a highly conserved region of acyl-CoA reductase, but also contains a
male sterility protein C-terminal region. Multialignment revealed that R28 is the most closely related to the jojoba
acyl CoA reductase.
Key words: Hevea brasiliensis; latex; acyl-CoA reductase
收稿 2009-08-31 修定 　2009-12-09
资助 中国热带农业科学院科技基金和华南热带农业大学科技
基 金 。
* 通讯作者(E-mail: dengliuhong168@163.com; Tel: 0898-
6 6 8 9 2 9 4 6 )。
巴西橡胶树因产胶量高, 胶质好而成为天然橡
胶最主要的商业来源。巴西橡胶树胶乳的干物质
主要是橡胶烃, 从乙酰辅酶A到橡胶烃的生物合成
过程需要 3种组分: 乙酰辅酶A、NADPH还原剂
和ATP (何康和黄宗道 1987)。脂酰辅酶A还原酶
(fatty acyl-coenzyme A reductase, FAR)可以催化
NADP+生成NADPH还原剂。植物中已发现的脂
酰辅酶A还原酶均具有相同的NADP结合蛋白保守
区, 其中希蒙得木(Simmondsia chinensis)脂酰辅酶
A还原酶定位在内质网中, 与特定的脂酰CoA-脂肪
醇酰基转移酶共同作用, 合成发育种子中的蜡质前
体(Metz等2000); 白杨(Populus trichocarpa)酰基辅
酶A还原酶与控制细胞壁-酰基的结合有关(Tuskan
等 2006); 拟南芥(Arabidopsis thaliana)的雄性不育
相关蛋白(male sterility 2-like protein, ms2)可能是脂
酰辅酶A还原酶, 在花粉壁物质形成中起作用(Aarts
等 1997)。
迄今, 脂酰辅酶A还原酶基因在橡胶树中还没
有报道。本文从巴西橡胶树胶乳特异表达差减
cDNA 文库中筛选到一个与脂酰辅酶A还原酶有较
高同源性的 cDNA片段, 并通过 cDNA末端快速扩
增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)获
得一个包含完整ORF的cDNA, 该基因的克隆将有
研究报告 Original Papers
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助于了解橡胶烃生物合成的主要组分——NADPH
还原剂的来源途径, 进而更深入了解橡胶烃的生物
合成过程。
材料与方法
试验材料为生长 10年的巴西橡胶树(Hevea
brasiliensis Muell. Arg.)优良品系 ‘热研 73397’, 于
2007年8月从中国热带农业科学院试验场采集, 割
胶后流出的胶乳直接滴入液氮中保存, 叶片采集后
立即放入液氮中保存备用。
胶乳总RNA提取参照Kush等(1990)文中的方
法。叶片中总RNA提取采用CTAB法和异硫氰酸
胍法结合进行。获得的 R N A 产物进行吸光值
A230、A260和 A280的测定, 判断其纯度和浓度; 并进
行 2%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测 RNA的完整
性。纯度及完整性好的胶乳及叶片总RNA即用于
差减 cDNA文库构建及RT-PCR模板, 其余样品加
入 3倍体积的无水乙醇于 −70 ℃下保存。
采用RACE克隆巴西橡胶树胶乳中脂酰辅酶
A还原酶 cDNA, 从抑制消减杂交获得的橡胶树
差减cDNA文库中分离到一个与脂酰辅酶A还原酶
高度同源的基因片段 R28, 根据该基因片段序列
信息, 设计 5和 3端特异引物 5-RACE-GSP (5
TGGCATTCACCACCATGTCACCT 3)和3-RACE-
GSP (5 CCTACCATGCTCAATTGCGTCTCCA
3) , 进行 5和 3 cDNA末端的快速扩增, 方法按
Clontech公司的SMARTTM RACE cDNA Amplifica-
tion Kit 说明书进行。PCR条件为: 94 ℃ 5 s, 65 ℃
10 s, 72 ℃ 3 min, 共 35个循环; 72 ℃延伸 10 min。
采用上海华舜生物工程公司的小量胶回收试剂盒进
行目的片段回收, 与 pMD18-T克隆载体连接后转
化大肠杆菌(Escherichia coli) XL1-Blue受体菌, 经
酶切鉴定后送去上海生物工程有限公司测序。将
通过测序获得的5-RACE序列和3-RACE序列去掉
插入位点两侧的载体序列后, 进行组装拼接, 得到
拼接好的全长的 cDNA序列。
cDNA序列及其编码氨基酸分析, 用NCBI的
Blast、ORF finder和 BankIt服务器进行核酸和蛋
白质序列比较、阅读框架确定及序列在线提交。
蛋白质疏水 /亲水性、分子量及等电点预测等基本
性质分析在公用数据库Workbench上进行。前导
肽、功能位点分析和序列同源比较及进化关系分
析分别采用 SignalP、Motif Scan和 Clustal W程序
进行。
结果与讨论
1 橡胶树叶片和胶乳总RNA的提取
取5 μg橡胶树叶片和胶乳总RNA样品进行凝
胶电泳, 28S rRNA、18S rRNA等分带明显清晰,
且 28S rRNA的量是18S rRNA的2倍, 紫外分光光
度计检测RNA的A260/A280比值介于1.8~2.0之间, 表
明总RNA中 2种RNA的完整性和纯度好, 适合用
于差减 cDNA文库构建及 RT-PCR模板。
2 巴西橡胶树的脂酰辅酶 A 还原酶 cDNA 克隆及
其序列同源比较
通过 5-和 3-RACE和RT-PCR获得的 cDNA
长度 1 365 bp, 命名为 R28。该序列中最大的 1个
阅读框(ORF)长度为 1 149 bp, 编码 382个氨基酸
残基。该 cDNA的起始密码子ATG的 −3位和 +4
位核苷酸均为嘌呤, 符合Kozak规律; 在其阅读框
终止密码子TAA下游同一读框内含有多个终止密
码子, 这些都符合有效翻译的基因的全长cDNA的
特征(张庆华等 2000)。因此断定克隆到的 R28包
含一个完整的阅读框, 其5-UTR有96个核苷酸, 3-
UTR有 128个核苷酸。该 cDNA序列在GenBank
的登录号为AY461413。
根据该基因编码的氨基酸序列进行蛋白质基
本性质推测分析认为, 该蛋白质的理论分子量为
43.5 kDa, 等电点为 8.97。该基因编码的蛋白质
有疏水性区域, 有 1个推测的跨膜螺旋区(187至
215位氨基酸) (图 1)。蛋白质氨基酸序列信号肽分
析结果表明, 该 cDNA编码的蛋白可能包含有 1个
图 1 R28 cDNA编码的蛋白质疏水性分析
Fig.1 Hydropathy profiles of the deduced protein of R28
图上横线表示跨膜结构域。
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由17个氨基酸组成的信号肽(1至17位氨基酸), 在
第17个氨基酸残基到第18个氨基酸残基处有1个
切割位点, 推测 R28是个膜蛋白基因。PROSITE
数据库分析该基因编码的氨基酸序列中包含有5种
类型功能位点: 1个 N-糖基化位点、6个蛋白激酶
C磷酸化位点、7个酪蛋白激酶 II磷酸化位点、1
个酪氨酸激酶磷酸化位点和3个N-十四酰化位点。
R28基因的同源序列比较分析结果(图2)表明,
图 2 R28与不同物种的酰基辅酶A还原酶及拟南芥雄性不育相关蛋白氨基酸序列同源的比较
Fig.2 Multialignment of the deduced amino acid sequences from H. brasiliensis R28 gene with
acyl-CoA reductase from various species and with male sterility 2-like protein
灰色表示一致氨基酸。
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它与脂酰辅酶A还原酶家族的同源性很高, 在进化
上, 它与植物的脂酰辅酶A还原酶亲缘关系较近, 它
与白杨、希蒙得木和小麦的脂酰辅酶A还原酶及
拟南芥雄性不育相关蛋白的同源性分别为 64%、
56%、46%和 57%, 而与细菌类的辅酶A还原酶
亲缘关系最远, 同源性仅 9%。GenBank数据库中
比较R28核苷酸及蛋白质同源性, 在橡胶树中没有
发现与 R28有显著相关的同源序列, 因此, 认为该
基因在在橡胶树中是一个新基因。
功能保守区分析结果表明, R28含有 2个保守
区, 1个是NADP结合蛋白保守区(rossmann-fold
NADP+-binding proteins domain), 1个是C端的雄性
不育相关蛋白保守区, 前者可催化(脂肪醛 +辅酶
A+NADP+=脂乙酰辅酶A+NADPH)反应进行。
据此, 我们推测R28基因是一个脂酰辅酶A还
原酶基因。由于R28基因是从胶乳特异表达cDNA
文库中筛选得到, 在胶乳中特异表达, 我们推断该
基因催化生成的NADPH可能是提供给橡胶烃生物
合成必须的组分之一。
参考文献
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