全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (12): 1809~1815　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0165 1809
收稿 2014-11-27
致谢 感谢中国农业科学院北京畜牧兽医研究所杨青川研究员
惠赠紫花苜蓿‘中苜3号’种子。
资助 国家自然科学基金(31101755)和中国农业科学院科技创新
工程(ASTIP-IAS10)。
* 通讯作者(E-mail: wangxuemin@caas.cn; Tel: 010-62816008)。
紫花苜蓿18S rRNA基因的克隆及内参基因表达稳定性评价
付媛媛1,2, 穆春生1, 高洪文2, 李俊2, 王学敏2,*
1东北师范大学草地科学研究所, 植被生态科学教育部重点实验室, 长春130024; 2中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北
京100193
摘要: 本文克隆紫花苜蓿常用内参基因18S rRNA, 并筛选出稳定的内参基因, 以确保紫花苜蓿基因表达分析结果的精确性
和可靠性。从紫花苜蓿中克隆常用内参基因18S rRNA的cDNA全长, 在此基础上结合β-actin、EF-1α、UBC2、TUB 4个常
用的内参基因, 应用实时定量PCR技术对5个候选内参基因在紫花苜蓿不同组织的表达情况进行分析。经BestKeeper和
geNorm软件综合分析, 5个候选基因在紫花苜蓿不同组织中的表达稳定性不同, 其中18S rRNA和EF-1α最稳定。
关键词: 18S rRNA; 内参基因; 实时荧光定量PCR; 紫花苜蓿
Cloning of 18S rRNA Gene and Stability Evaluation of Reference Genes in
Medicago sativa
FU Yuan-Yuan1,2, MU Chun-Sheng1, GAO Hong-Wen2, LI Jun2, WANG Xue-Min2,*
1Key Laboratory of Vegetation Ecology of Ministry of Education, Institute of Grassland Science, Northeast Normal University,
Changchun 130024, China; 2Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agriculture Sciences, Beijing 100193, China
Abstract: The objective of this research was to clone reference gene of 18S rRNA from Medicago sativa, and
select stable reference genes to ensure the reliability and accuracy of gene expression. The full length cDNA
sequence of 18S rRNA which was frequently used as reference gene was obtained from M. sativa. Furthermore,
we analyzed the stability of five candidate reference genes (18S rRNA, β-actin, EF-1α, UBC2, TUB) in different
tissues by using the real-time quantitative PCR. The expression stabilities were assessed using two statistical
algorithms BestKeeper and geNorm, respectively. The analysis results showed that the expression stability of
five candidate genes varied in different tissues of M. sativa were different, and 18S rRNA and EF-1α were the
most stably expressed genes.
Key words: 18S rRNA; reference genes; real-time fluorescence quantitative PCR; Medicago sativa
研究报告 Original Papers
实时荧光定量PCR (real-time fluorescence
quantitative PCR, qRT-PCR)与传统PCR相比具有技
术重复性好、灵敏度高、特异性强和高通量等特
点, 已经成为植物分子生物学研究中进行基因表
达和转录分析最常用的技术手段之一(Gachon等
2004; Heid等1996; Udvardi等2008)。为了消除不
同样品在RNA产量、质量以及转录效率上可能存
在的误差, 在分析基因表达过程中, 常采用内参基
因进行数据校正和均一化, 确保获得真实可靠的
试验数据(Noland等2006; Vandesomple等2002)。在
植物qRT-PCR研究中, 传统持家基因通常作为内参
基因, 主要包括参与生物体基本生化代谢过程的
甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(glyceraldehyde-3-phos-
phate dehydrogenase, GAPDH)、转录延伸因子基
因(transcription elongation factors, EF-1α)、多聚
泛素酶基因(ubiquitin, UBQ)、18S核糖体RNA (18S
ribosomal RNA, 18S rRNA)及构成细胞骨架维持生
命活动主要组成部分的肌动蛋白基因(β-actin)、α
微管和β微管蛋白基因(α-tubulin, TUA和β-tubulin,
TUB)等(Jain等2006; Reid等2006; Wan等2010)。在
理想情况下, 所选择的内参基因应该在不同的发
育阶段和组织器官, 在各种状态下保持一致, 不受
试验参数影响(Yeap等2014)。但近年来大量的研
究结果表明, 理想化的内参基因是不存在的, 任何
植物生理学报1810
一种持家基因在不同环境、物种、组织来源以及
不同试验条件下, 基因表达都会发生变化, 不存在
通用性(Bustin 2002; Gutierrez等2008; Huggett等
2005)。在qRT-PCR中, 选择不恰当的持家基因作
为内参基因可能使数据出现重大偏差和错误, 导
致数据不准确甚至出现相反或错误结果(Dheda等
2005)。因此, 针对特定试验条件和样品选择合适
的内参基因对靶基因进行标准化, 是获得准确结
果的重要前提。
紫花苜蓿属于豆科苜蓿属多年生牧草, 素有
“牧草之王”的美称, 具有营养价值高、适口性好、
适应性强等特点。紫花苜蓿在我国已有两千多年
的栽培历史, 全国各地都有种植, 主要分布在西北
和华北地区(韩明鹏等2010)。紫花苜蓿在发展畜
牧业生产、建植人工草地方面有着显著的经济效
益和社会效益(韩德梁和王彦荣2005), 又由于具有
发达的根系和生物固氮的特性, 能够很好的改良
土壤和保持水土, 能够提高土壤养分, 防止土壤盐
碱化和荒漠化, 对建设和保护当地生态环境具有重
要意义(包爱科等2007)。随着生物科学的迅速发
展, 分子生物学和基因组学在紫花苜蓿中的研究应
用也日益增多, 基因表达分析已经广泛应用于紫花
苜蓿基因调控网络的研究中。在此过程中需要有
较高稳定性和重复性的内参基因做参照。因此, 为
了进行基因表达的高效分析, 在紫花苜蓿中发掘具
有较高的稳定性和重复性的内参基因, 对于提高基
因表达研究的准确性和可靠性极为重要。
为此, 本研究克隆了紫花苜蓿的核糖体18S
rRNA基因, 分析其序列结构, 同时结合肌动蛋白
(β-actin)、延伸因子(EF-1α)、泛素连接酶(ubiquitin-
conjugating enzyme 2, UBC2)及β微管蛋白(β-tubulin,
TUB) 4个常用的内参基因, 利用实时定量PCR技
术, 筛选在紫花苜蓿不同组织器官稳定表达的内
参基因, 以期为紫花苜蓿内参基因的选择提供参
考依据。
材料与方法
1 植物材料
紫花苜蓿(Medicago sativa L.) ‘中苜3号’种子
由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所牧草资源
实验室提供。将紫花苜蓿‘中苜3号’种子用氯气灭
菌24 h后, 播种于铺有滤纸的培养皿上, 置于光照
培养箱中培养至种子发芽, 待种子长出2片子叶后,
移到1/2MS营养液中, 在温室中继续养30 d。2012
年10月在中国农业科学院(万庄)国际农业高新技
术产业园采集紫花苜蓿的根、茎、叶和花。
2 实验方法
2.1 RNA提取和cDNA合成
根据Trizol法提取紫花苜蓿的幼苗和采集的
根、茎、叶和花不同组织总RNA。每份样品取5
μg RNA, 按照cDNA Synthesis Kit (Thermo, USA)
说明书反转录合成cDNA第一链。每份样品稀释
20倍, 分别用于18S rRNA基因克隆和定量分析。
2.2 18S rRNA基因克隆及序列分析
根据GenBank上已经登录的近缘植物蒺藜苜
蓿(Medicago truncatula) 的18S rRNA基因(登录号
AF093506.1), 利用18S rRNA基因结构特点和其进
化上的保守性, 用Primer 5.0软件设计正向引物P1
(5′ TACCTGGTTGATCCTGCCAGTAGTC 3′)和反
向引物P2 (5′ CAATGATCCTTCCGCAGGTTCAC
3′)。以紫花苜蓿的幼苗cDNA为模版, PCR扩增程
序如下: 94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性30 s, 55 ℃退
火30 s, 72 ℃延伸110 s, 共30个循环; 72 ℃终延伸
10 min。所得目的条带经切胶回收纯化, 连接到日
本TAKARA公司的pMD®18-T载体上, 转化大肠杆
菌DH5α感受态细胞, 挑取阳性克隆送上海立菲生
物技术有限公司测序。在NCBI网站上BLAST进
行18S rRNA序列比较; 从GenBank中下载其他物种
18S rRNA序列, 通过MEGA 5.05软件Neighbor join-
ing (NJ)算法构建系统发育树。
2.3 内参基因PCR引物设计和检测
参照qRT-PCR引物的一般设计原则 , 利用
Primer Premier 5.0软件, 根据在紫花苜蓿幼苗中克
隆的18S rRNA和GenBank上的EF-1α (登录号
XM003618727)、β-actin (登录号EU664318)、UBC2
(登录号L06967.1)和TUB (登录号XM003630465)基
因序列分别设计5个内参基因的定量PCR引物(表
1)。对以上5个基因序列进行PCR扩增, PCR反应
条件为: 94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性30 s, 60 ℃退
火30 s, 72 ℃延伸30 S, 35个循环; 最后72 ℃下延伸
10 min。所得目的条带经切胶回收纯化后, 连接到
pMD18-T载体上, 转化大肠杆菌DH5α感受态细
胞, 进行PCR检测, 阳性克隆送上海立菲生物技术
有限公司测序。
付媛媛等: 紫花苜蓿18S rRNA基因的克隆及内参基因表达稳定性评价 1811
表1 用于 qRT-PCR检测的内参基因引物
Table 1 Primers of reference genes for qRT-PCR
内参基因 正向引物序列(5’→3’) 反向引物序列(5’→3’) 扩增片段/bp
18S rRNA GAGAAACGGCTACCACATCCA CCCAACCCAAGGTCCAACTAC 252
EF-1α GCACGCTCTTCTTGCATTTACT GGGCTTGTCTGTGGGTCTCTT 295
β-actin GTTCCTATCTATGAAGGATATGCCC GTCTCTCACGATTTCGCGCT 147
TUB AACCTCATCCCTTTCCCACG CTTGCATCCCACATTTGCTG 125
UBC2 TGATCCCAACCCAAATTCTCC GCACTCTACGATTGTACTCACGCT 83

2.4 内参基因的荧光定量PCR
按照Takara SYBR Premix Ex TaqTM II (Per-
fect Real Time)试剂盒说明, 使用ABI PRISM 7500
(ABI, USA)进行real-time PCR, 每个反应3个重
复。反应体系总体积为20 μL, 其中SYBR premix
EX Taq II (2×) 10 μL、上下游引物(10 μmol·L-1)各
0.8 μL、ROX Reference Dye II (50×) 0.4 μL、
cDNA 2.0 μL, 灭菌蒸馏水补足体积。反应程序为:
95 ℃预变性30 s; 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 34 s, 40个循环。
反应结束后, 确认qRT-PCR的溶解曲线鉴定产物的
特异性。
2.5 数据分析
采用软件BestKeeper (http://www.gene-quanti-
fication.de/bestkeeper.html)和geNorm (http://med-
gen.ugnt.be/~jvdesomp/genorm/)对各个内参基因的
表达稳定性进行数据分析, 从而选出最优的内参
基因。
实验结果
1 RNA样品质量检测
提取的紫花苜蓿总RNA用1.0%的琼脂糖凝胶
电泳鉴定。结果表明, 28S rRNA和18S rRNA条带
清晰, 提取的RNA完整性较好(图1)。RNA的A260/
A280介于1.90~2.1之间, A260/A230介于2.0~2.2之间, 说
明RNA的纯度比较高, 能够满足后续的分子生物
学试验要求。
2 18S rRNA基因克隆及序列分析
紫花苜蓿18S rRNA扩增产物经凝胶电泳电泳
检测发现, 接近2 000 bp有一条亮带(图2)。经测序,
该序列长度为1 808 bp, 命名为Ms18S rRNA, 已在
GenBank上注册, 登录号为KJ507198。在NCBI上
进行BLAST同源性比对, 紫花苜蓿18S rRNA序列
与大豆、竹节参、刺毛黧豆等植物相似性为99%,
图1 紫花苜蓿不同组织总RNA提取的琼脂糖凝胶电泳检测
Fig.1 Agarose gel electrophoresis analysis of total RNA ex-
tracted from different tissues of M. sativa
图2 18S rRNA基因PCR产物
Fig.2 PCR product of 18S rRNA gene
M: DL2000 DNA marker; 1: PCR产物。
与金银忍冬、北美假大麻等植物18S rRNA相似性
为98%。系统发育树分析(图3)表明, 紫花苜蓿18S
rRNA基因与白车轴草、鹰嘴豆等双子叶豆科植
物的亲缘关系最近, 与十字花科植物亲缘关系次
之, 与普通小麦、海葵和王棕等单子叶植物关系
较远。
3 内参基因目的片段片段克隆
以紫花苜蓿叶总cDNA为模板, 经琼脂糖凝胶
电泳检测, 5个内参基因均能扩增出特异性条带(图
4)。经测序验证, 5个内参基因大小与预期片段大
小一致。内参基因目的片段序列均与其他物种同
源基因序列有较高相似性, 其中克隆内参基因片
段EF-1α和TUB与蒺藜苜蓿的相似性为97%, 而内
参基因β-actin和UBC2基因片段序列与蒺藜苜蓿的
相似性高达99%。
植物生理学报1812
图3 紫花苜蓿18S rRNA与其他物种18S rRNA的系统进化树分析
Fig.3 Phylogenetic tree analysis of 18S rRNA in M. sativa and other species
Tr18S rRNA: 白车轴草(Trifolium repens) AF071069.1; Ca18S rRNA: 鹰嘴豆(Cicer arietinum) J011011.4; At18S rRNA: 拟南芥(Arabidopsis
thaliana) X16077.1; Dg18S rRNA: 北美假大麻(Datisca glomerata) U42426.1; Ml18S rRNA: 壳菜果(Mytilaria laosensis) AF274598.1; Pa18S
rRNA: 银白杨(Populus alba) DQ371807.1; Hb18S rRNA: 橡胶树(Hevea brasiliensis) AB268099.1; Gf18S rRNA: 小盘木(Galearia filiformis)
AB233598.1; Rg18S rRNA: 地黄(Rehmannia glutinosa) DQ469606.1; Cs18S rRNA: 野茶树(Camellia sinensis) AB120309.1; Iw18S rRNA:
非洲凤仙花(Impatiens walleriana) L49285.1; Ca18S rRNA: 青葙(Celosia argentea) AF206883.1; Rk18S rRNA: 疏枝大黄(Rheum kialense)
AB115757.1; Ch18S rRNA: 大三叶升麻(Cimicifuga heracleifolia) AB029376.1; Fi18S rRNA: 须叶藤(Flagellaria indica) AF206913.1; Zm18S
rRNA: 玉米(Zea mays) U42796.1; Ta18S rRNA: 普通小麦(Triticum aestivum) AJ272181.1; Lc18S rRNA: 蒲葵(Livistona chinensis) AY952394.1;
Rr18S rRNA: 王棕(Roystonea regia) AY012374.1。
图4 紫花苜蓿内参基因RT-PCR产物的
琼脂糖凝胶电泳检测
Fig.4 Agarose electrophoresis analysis of the RT-PCR
products of reference genes in M. sativa
M: DL2000 DNA marker; 1: 18S rRNA; 2: UBC2; 3: EF-1α; 4:
TUB; 5: β-actin。
4 内参基因的荧光定量PCR分析
以紫花苜蓿不同组织来源的cDNA为模版, 进
行实时荧光定量PCR分析, 各引物溶解曲线都只有
明显的单一峰(图5), 说明引物能够特异性地扩增
相应的内参基因产物, 不存在引物二聚体; 而且每
个待测样品的PCR扩增曲线重复性也非常好, 说明
实时荧光定量PCR的结果准确可信。
5个内参基因在不同组织中的Ct值均有一定的
变化, 变化趋势也各有所不同, 其中以18S rRNA的Ct值
最低, 说明其表达丰度最高; β-actin的Ct值最高, 表达
水平最低; EF-1α、TUB和UBC2表达水平居中(图6)。
5 内参基因稳定性分析
5.1 BestKeeper软件分析
在BestKeeper程序中输入Ct值, 自动对内参基
因和目标基因进行单独分析。BestKeeper程序主
要通过比较Ct值的标准偏差(SD)和变异系数(CV)
来判断各基因的稳定性, SD值和CV值越小, 稳定
性越好; 反之稳定性越差。EF-1α基因的标准变异
系数和变异相关系数最小, 其次18S rRNA基因的
也比较小; β-actin和TUB基因标准偏差和变异系数
最大, 稳定性最差, 说明最稳定的内参基因是EF-
1α, 其次是18S rRNA (表2)。
付媛媛等: 紫花苜蓿18S rRNA基因的克隆及内参基因表达稳定性评价 1813
图5 紫花苜蓿不同组织中5个内参基因的real-time PCR溶解曲线
Fig.5 Real-time PCR melting curves of five reference genes in different tissues of M. sativa
A: 18S rRNA; B: UBC2; C: EF-1α; D: TUB; E: β-actin。
5.2 geNorm软件分析
geNorm程序是专门用于分析内参基因稳定性
的程序(Vandesomple等2002)。根据公式Q=E(minCt–
sampleCt) (扩增效率E默认为2; minCt为所有样品中的
最低的Ct值, sampleCt为每个样品的Ct值), 通过计
算内参基因表达稳定性的M值进而分析内参基因
在不同样品中的表达稳定性。M值越小, 稳定性越
好; 反之, 稳定性越差。当以紫花苜蓿不同组织为
材料时, 候选内参基因的表达稳定性从高到低依
次为EF-1α/18S rRNA>UBC2>TUB>β-actin (图7)。
由此可知18S rRNA和EF-1α表达稳定性最好, 适合
作为进行紫花苜蓿不同组织基因表达分析的内参
基因, 而β-actin相对最不稳定。
讨　　论
在植物的qRT-PCR分析中, 越来越多的研究
者对植物内参基因的稳定性进行评价和鉴定。不
同组织器官和发育时期的短柄草在逆境胁迫(干
旱、盐、冷、热)和激素条件下 , 9个内参基因
图6 不同组织中5个内参基因的Ct值
Fig.6 The Ct values of five reference
genes in difference tissues
植物生理学报1814
(RCA、EF-1α、GAPDH、ACT7、SamDC、TUA6、
Ubi4、UBC18和Ubi10)中, UBC18在所有的样品中
表达最稳定(Hong等2008)。在5种不同的病毒侵染
番茄根和叶条件下, 8个内参基因(ACT、CYP、
EF-1α、GAPDH、TUB、UBI、GAPDH和18S rRNA)
中, UBI和GAPDH在所有样品表达相对稳定(Mascia
等2010)。豌豆在不同组织、胁迫处理(盐、2,4-D)
和基因型条件下, 8个传统内参基因(18S rRNA、
GAPDH、α-tubulin、EF-1α、actin、β-tubulin、
PP2A、helicase)和3个新内参基因(GH720808、
GH720838和GH720848)中, β-tubulin和actin在所有
样品中表达相对稳定(Die等2010)。在不同营养和
生殖组织发育阶段下, 油棕14个内参基因(β-tubulin、
Calmodulin、CCD、Cyp2、Egefa1、Fbox、GAPDH-
3290、Glutaredoxin、GRAS、GvHK1、Kinase、
SLU7、GvHK2和TrioP)中, GRAS和Cyp2在所有组
织中最稳定, 而GARS和SLU7在生殖状态下表达稳
定性最好(Yeap等2013)。 但在苜蓿中该类研究还
未见报道。本研究对5个候选内参基因在紫花苜蓿
不同组织中的表达进行稳定性评价，发现EF-1α和
18S rRNA在组织中表达最稳定, 可以作为苜蓿不
同组织基因表达分析的内参基因。
作为一类编码核糖体核基因的18S rRNA序列
和结构高度保守, 成为最常见一种稳定的分子标
记, 被认为研究物种系统演化最为有效的手段之
一(Winnepenninckx等1996; Weigand等2011)。18S
rRNA和有关蛋白质结合组成细胞核糖体的40S小
亚基, 然后它们通过核孔再转移到细胞质中参与
核糖体循环(王宝庆等2005)。本试验从紫花苜蓿
中成功克隆18S rRNA, 在系统进化树中, 紫花苜蓿
与豆科植物三叶草和鹰嘴豆在同一分支上, 与紫
花苜蓿属于豆科植物相吻合。本研究得到的紫花
苜蓿18S rRNA基因序列与鹰嘴豆、北美假大麻、
竹节参等植物的18S rRNA同源性均在98%以上, 由
此可见高等植物18S rRNA的基因非常保守。18S
rRNA基因序列克隆为研究紫花苜蓿的基因表达提
供了参照序列和参考依据。
选择理想的内参基因对获得准确的基因表达
结果是至关重要的, 选择不适当的内参基因往往
会导致错误结论(Dheda等2005)。在qRT-PCR分析
过程中, 评价作为校准和标准化的内参基因有多
种分析方法, 不同的评估方法对实验结果也有一
定的影响, 需运用多种分析方法综合评估以确保
准确性, 其中用geNorm和BestKeeper统计学的软件
分析方法为研究者经常采用(Hong等2008)。在本
实验中, 我们应用geNorm和BestKeeper两种数据评
估方法进行分析。geNorm程序是根据内参基因表
达水平进行两两比较和对数转换, 获得其平均标
准差, 之后将该平均标准差作为基因表达稳定度
的平均值, 对所有候选内参基因的表达稳定度进
行排序。BestKeeper则根据Ct值通过反复配对相
关分析和归一化分析对内参基因进行稳定性排
序。根据BestKeeper和geNorm软件两种不同计算
表2 BestKeeper分析5个内参基因在紫花苜蓿不同组织中的表达稳定性
Table 2 Expression stability of five reference genes in difference tissues by BestKeeper
内参基因 Ct平均值 Ct最小值 Ct最大值 标准偏差(SD) 变异系数(CV) 绝对调节系数标准差
EF-1α 17.76 17.12 18.04 0.32 1.81 1.25
β-actin 25.03 22.38 26.29 1.35 5.39 2.55
TUB 22.81 21.04 24.83 1.04 4.54 2.05
18S rRNA 15.00 14.32 15.60 0.40 2.69 1.32
UBC2 22.20 21.29 22.93 0.72 3.25 1.65

图7 geNorm软件分析各内参基因的表达稳定性
Fig.7 Expression stability values of reference genes
calculated by geNorm software
付媛媛等: 紫花苜蓿18S rRNA基因的克隆及内参基因表达稳定性评价 1815
算法分析, 均表明18S rRNA和EF-1α在不同器官组
织中表达稳定性最好, 说明仅对紫花苜蓿不同器
官来说, 这两个持家基因做内参基因较为理想, 同
时在一定程度上证明此次紫花苜蓿内参基因筛选
结果的准确和可靠性。
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