全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 3期, 2010年 3月 217
收稿 2009-11-24 修定 2010-02-24
资助 国家自然科学基金(30 77 1 32 8)和广东省自然科学基金
(7 0 0 6 6 5 9 )。
致谢 本校张桂权先生提供 ‘ 华粳籼 74 ’ 种子。研究得到本校
傅雪琳、李金泉和赵杏娟 3 位先生的指导以及张欢欢
同学和俞淑红先生的协助。
* 与第一作者同等贡献者。
** 通讯作者(E-mail: xdliu@scau.edu.cn, Tel: 020-85285752;
E-mail: ygliu@scau.edu.cn, Tel: 020-85280187)。
药用野生稻TAC克隆转化籼稻的体系初探
汪暖 1, 陈志雄 1,*, 刘蕊 1, 江奕君 3, 潘小芬 2, 刘向东 1,**, 刘耀光 2,**
华南农业大学 1农学院; 2生命科学学院, 广州 510642; 3广东省农业科学院水稻研究所, 广州 510640
提要: 采用已构建的药用野生稻TAC文库, 比较研究4个籼稻品种在不同培养基的诱导率及愈伤组织对潮霉素抗性。通过
2种不同诱导方法产生的愈伤组织, 将携带药用野生稻大片段DNA的TAC克隆转化到籼稻品种中的结果表明, 除了‘粤香
占 ’以外, 其它3个品种在N6诱导培养基中添加微量B5后, 其愈伤诱导率最高。不同品种的潮霉素筛选适合浓度存在差异,
其中 ‘华粳籼74’的适合筛选浓度为50 mg·L-1, ‘粤香占 ’为40 mg·L-1。用预培养5 d的愈伤组织进行遗传转化, 在潮霉素筛
选之前先以头孢拉定抑菌处理的, 容易获得转基因植株。4个品种中以‘粤香占’的抗性愈伤组织筛选率和分化率最高, 分
别为 22.58%和 14.86%。分子检测11株转基因水稻的结果表明, 其中 8株含有抗性标记基因。据此认为, 药用野生稻TAC
文库在水稻创新育种中可能有一定的利用前景。
关键词: 药用野生稻; TAC克隆; 遗传转化
Preliminary Study of Transformation System of indica Rice with TAC Clones
Containing Large Genomic Sequences of Oryza officinalis Wall.
WANG Nuan1, CHEN Zhi-Xiong1,*, LIU Rui1, JIANG Yi-Jun3, PAN Xiao-Fen2, LIU Xiang-Dong1,**, LIU Yao-Guang2,**
1College of Agriculture, 2College of Life Science, South China Agriculture University, Guangzhou 510642, China; 3Rice Research
Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China
Abstract: By using TAC library of Oryza officinalis, induction rates of four indica rice varieties in different
media and resistance to hygromycin of calli were compared. TAC clones with large genomic sequences of
Oryza officinalis were transferred into indica rice varieties by using calli generated by two different induction
methods. The results showed that except ‘Yuexianzhan’, the callus induction rates of three rice varieties were
highest in N6 induction media plus B5. The appropriate concentrations of hygromycin for four indica rice
varieties were detected, 50 mg·L-1 hygromycin was appropriate for ‘Huajinxian 74’ and 40 mg·L-1 for
‘Yuexianzhan’. In the genetic transformation of 5-day precultured calli, it was more easily to get transgenic
plants with anti-bacterium treatment of Cefotaxime before the screening by hygromycin. The transformation
frequency and the regeneration frequency of ‘Yuexiangzhan’ was 22.58% and 14.86% respectively, highest
among four indica rice varieties. Molecular analysis of 11 transgenic plants showed that, 8 plants carried the
transformed selective marker gene. The conclusion suggested that TAC library of Oryza officinalis might have
the prospects of utilization in the innovation of rice breeding.
Key words: Oryza officinalis; TAC clones; genetic transformation
药用野生稻是分布在我国的 3种野生稻之一,
具有许多有利基因: 一是抗生物胁迫的防御基因, 包
括高抗白叶枯病、稻瘟病、病毒病等抗病基因,
抗褐飞虱、白背飞虱、叶蝉、稻纵卷叶螟、稻
瘿蚊和稻蓟马等抗虫基因; 二是抗非生物胁迫的基
因, 包括耐旱、耐瘠、耐盐、耐热和耐冷等基因;
三是其他的有利基因, 如柱头外露和蛋白质高含量
等基因(钟代彬等 1995)。这些基因多数是目前栽
培稻品种中所缺乏的, 尤其是抗性基因。所以, 转
移并利用其抗性基因对于水稻的创新育种具有一定
的意义。
采用药用野生稻有利基因的方法主要有 2种:
一是通过与栽培稻杂交转移其有利基因(钟代彬等
2000)。颜辉煌等(1996)曾利用杂交成功地将高抗
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褐飞虱基因转移到栽培稻中。但是, 杂交转移方法
存在难度大, 一般需要结合 “胚拯救 ”技术, 另外,
由于杂交是整个基因组的转移。所以, 往往也带进
许多不利基因, 影响有利基因的高效转移。二是构
建药用野生稻可转化大片段基因组文库, 通过转基
因技术, 将可能携带有利基因的大片段克隆导入栽
培稻中。由于这种方法可以克服杂交转移的不足,
所以得到人们的高度关注(曹孟良 2005)。He等
(2003)构建了药用野生稻 BIBAC基因文库。TAC
载体[即可转化人工染色体(transformation-compe-
tent artificial chromosome, TAC)]具有 P1复制子和
Ri质粒pRiA4复制子, 能插入大片段的DNA, 并能
在大肠杆菌和农杆菌中穿梭复制, 由其构建的大片
段的DNA克隆具有可直接转化等特点(Liu等1999),
所以是进行药用野生稻有利基因转移十分理想的工
具和材料, 具有广阔的应用前景。
要有效利用药用野生稻TAC文库, 首要的问题
是建立高效的栽培稻转化体系。周玲艳等(2005)
曾建立了粳稻 ‘台中 65’ TAC载体转化粳稻的体
系。但目前有关直接利用TAC克隆转化籼稻的体
系却还未见报道。为此, 本文用已构建的药用野生
稻 TAC基因文库(刘耀光, 未发表资料), 选取随机
克隆进行不同籼稻品种的转化比较试验, 以建立适
合的籼稻转化体系, 为有效利用药用野生稻TAC基
因文库并转移其有利基因建立基础。
材料与方法
用改良的TAC载体pYLTAC37构建了药用野
生稻(Oryza officinalis Wall.)TAC文库, 插入子大小
范围为 30~80 kb (刘耀光, 未发表资料)。转化时
使用基因克隆是从药用野生稻TAC基因文库中随
机提取的, 根据在文库板位置而命名使用的, 农杆
菌(Agrobacterium tumefaciens)为 EHA105菌株。
水稻组织培养选用的培养基参照 H i e i 等
(1994)文中方法, 并稍作修改, 设置 4种基本培养
基: MS大量 +B5微量、N6大量 +B5微量、MS大
量 +MS微量和 N6大量 +N6微量。抗生素头孢拉
定(Cef)浓度为 100 mg·mL-1, 潮霉素(Hgy)浓度为
100 mg·mL-1。
水稻愈伤组织诱导时, 选取籼稻 ‘ 华粳籼
74’、‘ 粤香占 ’、‘ 玉香油占 ’、‘桂农占 ’ 种子,
消毒后接种在诱导培养基上, 每皿 20粒, 5皿为 1
个重复, 每个处理设 3次重复。在 25 ℃黑暗的条
件下诱导愈伤组织, 10 d后统计形成愈伤组织的种
子数(愈伤组织诱导率=愈伤组织块数 /接种种子数×
100%)。10~12 d后转到继代培养基中, 继代 1次
为 10 d, 之后 15 d继代 1次。将继代 2次的愈伤
组织分别转入含有 10、20、30、40、50 mg·L-1
5种浓度Hgy的继代培养基中, 25℃光培养14 d, 每
处理 100块, 调查愈伤组织生长状况, 以确定 4个
品种适合的 Hgy筛选浓度。
愈伤组织转化采用2种方法, 一是选用在25 ℃
黑暗中预培养5 d后的水稻种子愈伤组织进行农杆
菌侵染, 主要参照 Toki等(2006)文中方法, 并略作
修改; 二是选用继代 2次的愈伤组织进行侵染, 参
照Hiei等(1994)文中方法, 稍作修改, 用Hgy筛选,
统计抗性愈伤组织率和绿苗分化率, 比较它们的抗
性筛选率和分化率, 从而筛选出适合转化的品种。
分子检测时, 分单株剪取幼苗少量叶片, 简易
法抽取DNA, 利用 TAC载体携带的Hpt基因进行
PCR检测。PCR反应体积为 20 μL, 其中含引物 4
μmol·L-1、dNTP 400 μmol·L-1、10×Taq DNA聚合
酶缓冲液 2 μL、模板DNA 2 μL、0.2 U Taq DNA
聚合酶、ddH2O补齐至 20 μL。PCR反应参数为:
(1) 95 ℃ 5 min; (2) 95℃ 45 s, 58 ℃ 45 s, 72℃ 45 s,
35个循环; (3) 72 ℃ 10 min。Hpt基因引物Hpt-F
序列为: 5 TCCGGAGCCTCCGCTCGAAGTAG 3;
Hpt-R序列为: 5 CTGAACTCACCGCGAC-
GTCTGTC 3, 扩增产物大小为 750 bp。
实验结果
1 不同培养基对籼稻愈伤组织诱导和继代的影响
为了寻找诱导不同籼稻品种愈伤组织诱导合
适的培养基, 试验设置 4种基本培养基, 对 4个籼
稻品种进行诱导率比较。由表 1可以看出, 不同
品种的愈伤组织诱导率有所差异, 且受不同培养
基的影响, ‘粤香占 ’的愈伤组织诱导率最高, 平
均值为94.33%, ‘华粳籼74’的愈伤组织诱导率最
低, 平均值为 88.68%。‘华粳籼 74’和 ‘桂农占 ’以
N6大量+B5微量基本培养基为最佳, ‘粤香占’以MS
大量 +B5微量培养基为最佳, ‘玉香油占 ’以MS大
量 +MS微量培养基为最佳, 由此可见, 在诱导培养
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基中添加 B5微量有利于促进愈伤组织的产生。
不同品种的愈伤组织的生长特性有较大的差
别, ‘华粳籼 74’诱导形成的愈伤组织圆形致密, 色
泽嫩黄(图 1-a), 耐继代(图 1-b、c); ‘粤香占 ’愈伤
组织圆形致密, 大部分嫩黄, 少数褐化(图1-d), 继代
有少数愈伤组织褐化(图 1-e、f); ‘桂农占 ’和 ‘玉
香油占 ’诱导时愈伤组织大多数致密, 色泽嫩黄(图
1-g、j) , 不耐继代(图 1-h、i、k、l), 随着继代
次数增加, 愈伤组织越来越松散, 出现了褐化(图1)。
2 籼稻抗性愈伤组织的筛选与分化
为了确定不同籼稻品种的最佳Hgy选择浓度,
设置 5个浓度梯度的Hgy分别进行试验。观察水
稻愈伤组织生长状态和统计褐化频率的结果(表2)表
明, ‘华粳籼 74’适合的筛选浓度是 50 mg·L-1, ‘粤
香占 ’适合的筛选浓度是 40 mg·L-1, ‘玉香油占 ’和
‘桂农占 ’的筛选浓度是 10 mg·L-1。在此基础上进
行的籼稻抗性愈伤组织的筛选(表3), 抗性筛选率以
‘粤香占 ’最高(22.58%), ‘桂农占 ’筛选率最低
(15.74%)。抗性愈伤组织的分化率以 ‘粤香占 ’
最高(14.86%), ‘玉香油占 ’的分化率最低(7.41%)。
3 不同受体材料转化比较
水稻成熟胚作为遗传转化受体材料, 经过1~3
次继代培养得到的成熟胚盾片愈伤组织适合作转化
(曹明霞等 2002; 刘元风等 2005), 但周期过长, 因
长时间组织培养而引起体细胞变异的机会增大。
本文除采用继代 2次的愈伤组织作为受体材料之
表 1 不同培养基对籼稻愈伤组织诱导率的影响
Table 1 Effects of different media on the iduction rate of callus from indica rices
愈伤组织诱导率 /%
基本培养基
‘华粳籼 74’ ‘粤香占 ’ ‘玉香油占 ’ ‘桂农占 ’
MS大量 +B5微量 86.90±2.40ab 98.60±0.70a 90.23±2.64a 92.00±0.68b
N6大量 +B5微量 92.40±0.84a 93.13±0.61b 94.33±2.78a 98.20±1.42a
MS大量 +MS微量 84.23±0.99b 93.73±0.27b 94.47±0.87a 93.83±1.82ab
N6大量 + N6微量 91.17±3.12ab 91.87±1.92b 93.43±0.12a 91.73±1.39b
不同字母表示在 0.05水平时差异显著。
表 2 不同浓度的潮霉素对籼稻愈伤组织的影响
Table 2 Effects of different concentrations of hygromycin on callus of indica rices
褐化率 /%
潮霉素浓度 /mg·L-1
‘华粳籼 74’ ‘粤香占 ’ ‘玉香油占 ’ ‘桂农占 ’
10 18.26 30.69 59.13 69.09
20 48.00 46.23 96.97 91.00
30 78.57 92.79 100.00 91.00
40 100.00 100.00 100.00 99.07
50 100.00 100.00 100.00 100.00
表 3 不同籼稻品种的抗性愈伤组织筛选和分化比较
Table 3 Comparison of screening rate and differentiation rate of callus among different indica rice varieties
水稻品种 进入选择的愈伤 抗性愈伤组 抗性筛选 进入分化的愈 分化成苗的愈伤 分化率 /%组织数 /块 织数 /块 率 /% 伤组织数 /块 组织数 /块
‘华粳籼 74’ 198 4 4 22.22 164 1 5 9.15
‘粤香占 ’ 124 2 8 22.58 7 4 1 1 14.86
‘桂农占 ’ 197 3 1 15.74 2 0 2 10.00
‘玉香油占 ’ 358 5 8 16.20 2 7 2 7.41
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图 2 不同受体材料转化过程
Fig.2 Process of genetic transformation through different infection of callus from different indica rice varieties
a~h: 籼稻 ‘粤香占 ’成熟胚诱导 5 d的愈伤组织的遗传转化过程; a: 诱导 5 d的愈伤组织; b: 培养 3 d; c: 接到只含有 Cef的选择培
养基 7 d; d: 拔芽, 再接到只含 Cef的选择 7 d; e: 在含有适当Hgy浓度的筛选培养基上选择 2次; f: 分化; g: 生根; h: 移栽大田生长情况。
i~p: 籼稻 ‘华粳籼 74’成熟胚 2次继代培养愈伤组织的遗传转化过程, i: 诱导 10 d的愈伤组织; j: 继代 1次的愈伤组织; k: 继代 2次的
愈伤组织; l: 共培 3 d; m: 筛选培养基上选择 2次; n: 分化; o: 生根; p: 移栽大田生长情况。
图 1 不同籼稻品种愈伤组织的比较
Fig.1 Comparison of callus among different indica rice varieties
a、b、c 分别为 ‘ 华粳籼 74 ’ 诱导 1 0 d、继代 1 次、继代 2 次的愈伤组织; d、e、f 分别为 ‘ 粤香占 ’ 诱导 1 0 d、继代 1 次、
继代 2 次的愈伤组织; g、h、i 分别为 ‘ 桂农占 ’ 诱导 1 0 d、继代 1 次、继代 2 次的愈伤组织; j、k、l 分别为 ‘ 玉香油占 ’ 诱导
1 0 d、继代 1 次、继代 2 次的愈伤组织。
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图 3 转化植株 T0 和 T1代的分子检测
Fig.3 Molecular identification of T0 and T1 transgenic plants
a: ‘华粳籼 74’ T0代(3株抗性苗); 对照 1: 质粒DNA (54I12); 对照 2: 非转化 ‘华粳籼 74’。b: ‘粤香占 ’T0代(6株抗性苗); 对照
1: 质粒DNA (55O1); 对照 2: 非转化 ‘粤香占 ’。c: ‘桂农占 ’T0代(1株抗性苗); 对照 1: 质粒DNA (克隆 54A9); 对照 2: 非转化 ‘桂
农占 ’。d: ‘玉香油占 ’T0代(1株抗性苗); 对照 1: 质粒DNA (55C1); 对照 2: 非转化 ‘玉香油占 ’。e: ‘华粳籼 74’ T1代(20株抗性苗);
对照 1: 质粒 DNA (54I12); 对照 2: 非转化 ‘华粳籼 74’。M: 分子标记 DL2000。
外, 还采用预培养5 d的愈伤组织作为受体材料, 希
望显著缩短转基因的周期, 减少体细胞变异机会。
将预培养5 d的种子为受体材料进行转化时间较短
(图2-a~h), 以诱导5 d的种子(图2-a)进行农杆菌侵
染, 共培养 3 d (图 2-b), 清洗, 接到只含 Cef的选择
培养基 7 d (图 2-c), 出芽后, 再接到只含 Cef的选
择 7 d (图 2-d), 接到含Hgy和 Cef的选择培养基
上, 选择 2次, 前后各 14 d (图 2-e), 选择有新生迹
象的黄色愈伤组织, 进入分化, 大约 1个月(图 2-f),
生根(图 2-g), 后移栽(图 2-h)。继代愈伤组织过程
(图 2-i~p)时间较长, 水稻成熟胚诱导 10 d (图 2-i),
得到的愈伤组织第 1次继代 10 d (图 2-j), 第 2次继
代 15 d (图 2-k), 以继代 2次的愈伤组织进行农杆
菌侵染, 共培养 3 d (图 2-l), 清洗, 接到含Hgy和
Cef的选择培养基, 选择 2次, 前后各 14 d (图 2-m),
选择有新生迹象的黄色愈伤组织, 进入分化, 大约
1个月(图 2-n), 生根(图 2-o), 后移栽(图 2-p)。在
Hgy选择阶段前, 以预培养 5 d的种子为受体材料
约 22 d, 而继代 2次的愈伤组织作为受体材料需要
38 d, 嗣后的过程与时间相同。
4 转化苗的分子检测
以成熟胚 2次继代愈伤组织为受体材料进行
转化获得的 T0代 ‘华粳籼 74’ (图 3-a)、‘桂农占 ’
(图 3-b)、‘玉香油占 ’ (图 3-d)的抗性苗经过检测
全都能扩出Hgy的条带, 假阳性率为 0。以预培养
5 d的 ‘粤香占 ’种子为受体材料得到的6株抗性苗
经过检测, 其中有 3株扩增出所需条带 (图 3-c), 假
阳性率为 50%。转基因株表现早熟, 矮化的表型,
而且结实率不高。其中只有 ‘华粳籼 74’的 1株转
化苗植株结实率比较高, 收获 101粒种子, 经过浸
种催芽在田间成功种植了 T1代, T1代 ‘华粳籼 74’
全都能扩出Hgy的条带(图 3-e)。
讨 论
在水稻遗传转化中, 一般采用幼胚和成熟胚来
诱导愈伤组织作为外植体。幼胚的愈伤组织诱导
和分生能力强, 转化效果佳, 但操作复杂, 取材多受
季节和环境影响, 难以满足常年实验的要求; 而成
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熟胚取材方便, 愈伤组织诱导率较好, 备受研究者
关注; 采用继代 2次的愈伤组织作受体材料转化具
有较高的转化频率和较广的品种适用范围的优点,
筛选后愈伤组织生长缓慢, 出现绿苗时间久, 整个
周期长(潘学彪等 1998; 刘巧泉等 1998; 彭凌涛等
2001; 周玲艳等 2005; Lin等 2002)。Toki等(2006)
以粳稻 ‘日本晴 ’成熟胚诱导 1~5 d的愈伤组织进
行农杆菌转化所获得的转化苗, 缩短转化周期。以
籼稻品种成熟胚诱导5 d的愈伤组织的转化研究未
见报道。本文利用籼稻 ‘粤香占 ’成熟胚诱导 5 d
的材料进行农杆菌转化实验, 获得3株经PCR检测
的转化苗, 比继代 2次愈伤组织作受体材料的转化
缩短 16 d, 从而加快试验进程。但试验也存在不
足之处, 如培养5 d的籼稻愈伤组织非常稚嫩, 共培
中常出现很多褐化的愈伤组织。为了解决这一问
题, 建议采用 Cef抑菌过渡, 再而进入Hgy选择, 这
样可获得了转化苗。
本文选用4个广东优质籼稻常规稻品种成熟胚
为材料, 通过对基本培养基的筛选和培养条件的优
化, 我们认为 ‘粤香占 ’和 ‘华粳籼 74’适合于转化
实验, 因为它们的诱导率高, 愈伤组织生理状态良
好, 转化各个阶段愈伤组织褐化少, 分化良好。此
外, 我们对籼稻遗传转化体系进行了探索, 并对分
化出的少量苗进行PCR检测的结果表明, 11株抗性
苗中有 8株扩增出Hpt条带, 说明TAC载体所携带
的基因已整合到籼稻基因组中。我们用与抗逆基
因序列为探针, Southern杂交筛选药用野生稻 TAC
文库, 并采用所建立的遗传转化体系将阳性克隆直
接转化栽培水稻中, 获得一批药用野生稻TAC克隆
的籼稻转化株, 从中初步筛选出具有抗逆特性的变
异株系(未发表资料), 从而为药用野生稻的有用基
因发掘打下了基础。总之, 药用野生稻 TAC文库
在水稻种质创新中具有一定的应用前景。
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