全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 5期，2009年 5月 509
收稿 2009-02-04 修定 　2009-03-05
资助 国家 “863”计划(2006AA10Z110)和国家自然科学基金
(3 0 7 71 2 3 7 )。
* 通讯作者(E-mail: chaiyourong1@163.com; Tel: 023-
6 8 2 5 0 7 4 4 )。
原花青素的生物合成途径、功能基因和代谢工程
赵文军, 张迪, 马丽娟, 柴友荣 *
西南大学农学与生物科技学院, 重庆 400716
Biosynthetic Pathway, Functional Genes and Metabolic Engineering of
Proanthocyanidins
ZHAO Wen-Jun, ZHANG Di, MA Li-Juan, CHAI You-Rong*
College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400716, China
提要: 原花青素(PA)广泛分布于高等植物中, 与农作物的多种品质性状密切相关。虽长期受到关注, 但其生物合成途径和
主要功能基因的解析则是近年来随着拟南芥等植物突变体研究的深入才取得突破的。PA经公共苯丙烷-核心类黄酮-原花
青素复合途径而合成, 先后涉及 12个关键酶(PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、F3’H、DFR、LDOX/ANS、LAR、ANR、
LAC)的催化反应和 3种转运蛋白(GST、MATE、ATPase)的胞内转运, 并有 6种转录因子(WIP-ZF、MYB、bHLH、WD40、
WRKY、MADS)参与调控 PA的合成与积累。这些基因在拷贝数、表达特征、蛋白亚细胞定位、蛋白互作、突变体表型
等方面具有显著特点。PA的代谢工程在牧草品质改良、农产品脱涩、油菜黄籽材料创新、葡萄和葡萄酒品质改良、茶多
酚分子育种、作物抗病虫性提高、新型作物拓展等方向具有重要的应用前景, 目前仅在少数方向有所启动, 更待广泛关注
和深入研究。
关键词: 生物合成途径; 功能基因; 代谢工程; 原花青素
原花青素(proanthocyanidin, PA)又叫缩合单宁
(condensed tannin, CT), 是高等植物特有并广泛存
在的聚多酚类化合物, 以 PA单体、寡聚物或多聚
物的形式存在。PA对于植物具有抗紫外线、抗
病、抗虫、清除自由基、调节种子休眠和萌发
等生理功能, 并影响作物的适口性、可消化性、
保健价值等品质性状。PA提取物具有多方面的医
疗价值, 可用于抗衰老、防治心血管疾病、防治
肿瘤等(Dixon等 2005)。近年来, 随着对拟南芥等
植物一系列种皮色泽突变体的分子研究的深入, PA
的生物合成途径、主要功能基因、分子调控机理
等已基本阐明, 为通过代谢工程进行 PA相关性状
的植物改良奠定了基础(Xie和Dixon 2005; Lepiniec
等 2006)。
1 植物原花青素的生物合成途径
如图 1所示, PA的生物合成是由公共苯丙烷
途径、核心类黄酮 -花青素途径、PA特异途径这
3个连续的代谢途径构成的一个复合途径完成的。
1.1 公共苯丙烷途径 公共苯丙烷途径是指从苯丙
氨酸到对羟基肉桂酸(香豆酸)的合成途径, 共有3个
酶。苯丙氨酸解氨酶(PAL)脱去苯丙氨酸的氨基,
使其转化为反式肉桂酸。肉桂酸 -4-羟化酶(C4H)
催化反式肉桂酸4位上的羟基化, 使其转化为反式-
4-香豆酸。4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)催化香豆
酸与辅酶A的酯化结合, 使香豆酸得以活化, 可用
于类黄酮、木质素等下游分支途径进一步合成各
种次生物质(Chapple等 1994)。
1.2 核心类黄酮 -花青素途径 类黄酮是高等植物
中普遍存在的次生代谢物质, 拟南芥中主要为花青
素、黄酮醇和 PA这三大类, 营养器官中积累花青
素和黄酮醇, 种胚中积累黄酮醇, 种皮中积累 PA
(Chapple等 1994)。作为苯丙烷途径的一个重要分
支途径, 植物类黄酮途径又包含黄酮醇、花青素
苷、PA、异黄酮、橙酮、鞣红等多个重要的分
支途径。自查尔酮直到花青素的步骤是花青素苷
分支途径和PA分支途径都必须经过的公共途径, 本
文称为核心类黄酮 -花青素途径。作为所有类黄
酮合成的起始步骤, 查尔酮合酶(CHS)将1分子香豆
酰辅酶A与3分子丙二酰辅酶A合成为1分子四羟
基查尔酮, 再由查尔酮异构酶(CHI)将其转变为柚皮
素, 随后由黄烷酮3-羟化酶(F3H)和类黄酮3’-羟化
酶(F3’H)分别在 3和 3’位进行羟化并生成黄烷酮
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图 1 花青素苷、黄酮醇和原花青素等类黄酮物质的生物合成途径[根据 Sharma和Dixon (2005)翻译和补充而成]
aha10: P-type H+-ATPase, P类型 H+-ATPase; ANR: anthocyanidin reductase, 花青素还原酶; ban: banyuls; C4H: cinnamate 4-
hydroxylase, 肉桂酸 -4-羟化酶; CHI: chalcone isomerase, 查尔酮异构酶; CHS: chalcone synthase, 查尔酮合酶; 4CL: 4-coumarate:CoA
ligase, 4-羟基肉桂酰辅酶 A连接酶; DFR: dihydroflavonol reductase, 二氢黄酮醇 -4-还原酶; F3H: flavanone 3-hydroxylase, 黄烷酮
3-羟化酶; F3H: flavonoid 3-hydroxylase, 类黄酮 3-羟化酶; FLS: flavonol synthase, 黄酮醇合酶; GST: glutathione S-transferase, 谷
胱甘肽 S-转移酶; LAR: leucoanthocyanidin reductase, 无色花青素还原酶; LDOX: leucoanthocyanidin dioxygenase, 无色花青素双加
氧酶; OMT: O-methyltransferase, O-甲基转移酶; PAL: phenylalanine ammonia-lyase, 苯丙氨酸解氨酶; pap1: production of antho-
cyanin pigment, 产花青素苷色素突变体; RT: rhamnosyl transferase, 鼠李糖基转移酶; UFGT: uridine diphosphate glucose-flavonoid
glucosyltransferase, 尿苷二磷酸葡萄糖 -类黄酮葡萄糖基转移酶; tt: transparent testa, 透明种皮突变体; ttg: transparent testa glabrous,
透明种皮无毛突变体。
醇, 它在二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)的作用下生成
无色花青素, 再在无色花青素双加氧酶 /花青素合
成酶(LDOX/ANS)的催化下形成花青素(Lepiniec等
2006)。在花、叶、茎表等组织中, 以花青素为
底物可进入花青素苷特异途径, 先后经过一系列的
糖基化等修饰及向液泡的转运, 最终成为显红、紫
等多种色调的花青素苷(Holton和 Cornish 1995)。
在种皮等组织中, 以花青素为底物, 进入PA特异途
径(图 1 )。
1.3 原花青素特异途径 花青素还原酶(ANR)将花
青素转化成表儿茶素(2,3-顺式黄烷-3-醇), 它是一
类 P A 单体。在葡萄、茶叶、苜蓿、红豆草等
植物中, 无色花青素还原酶(LAR)可以直接将无色
花青素转化成儿茶酚(2,3-反式黄烷-3-醇), 但拟南
芥缺乏该酶(Dixon等 2005)。随后是转运和聚合,
虽然具体机制尚欠明了, 但综合近年来的研究进展
(Pourcel等 2005; Sharma和Dixon 2005), 我们推测
PA单体可能先与谷胱甘肽 -S-转移酶(拟南芥中为
AtGST26/AtGSTF12)结合并运向液泡膜, 再由位于
液泡膜上的 M A T E 家族蛋白 ( 拟南芥中为
AtDTX41)和H+-ATPase (拟南芥中为AHA10) (二
者可能联合？)将其跨膜转运到液泡中, 最后由漆酶
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(拟南芥中为AtLAC15)等氧化酶类将其缩合成不同
聚合度的 PA 聚合物。
2 植物原花青素生物合成的功能基因
2.1 公共苯丙烷途径的结构基因
2.1.1 PAL 我们对NCBI GenBank检索和同源比对
该基因后发现(后面的基因同此法), 很多种植物的
PA L 基因已克隆, 如拟南芥、欧芹、番茄、烟
草、菜豆、豌豆、大豆、苜蓿、马铃薯、甘
蓝型油菜等。多数植物中的 PAL由一个小基因家
族编码, 如拟南芥中有 4个成员, 甘蓝型油菜约有
2~5个基因与拟南芥每个成员对应(Ni等 2008)。
PAL一般都有1个位置保守但长度变化较大的内含
子, 唯独拟南芥的 AtPAL3有 2个内含子。PAL蛋
白一般为 700个左右氨基酸, 组成同源四聚体, 是
苯丙烷途径的第一个关键酶。我们搜索
SwissModel Repository后发现(后面的基因同此法),
酵母、欧芹等 PAL以及动物的HAL (组氨酸解氨
酶)的晶体结构已经解析, 也有人提出了反应中心和
一些活性氨基酸位点。
2.1.2 C4H 已有拟南芥、玉米、烟草、高粱、
矮牵牛、金鱼草、菊花、甘蓝型油菜等 50 种以
上植物的C4H基因被克隆, 拟南芥和豌豆只有1个,
苜蓿有 2个, 亚洲棉有 2个以上, 绿豆、长春花等
有多个(方从兵等 2005)。C4H一般有 2个内含子,
位置较保守。C4H构成细胞色素P450氧化酶超家
族的 CYP73家族, 催化反应依赖于NADPH和O2,
蛋白一般为 500个左右氨基酸, 一般认为它具有 1
个 N-端膜锚, 具有血红素结合域、氧结合位点、
ERR三联体等, 有多个底物识别位点(SRS), 蛋白为
球状体, 拟南芥等植物的 C4H晶体结构已经解析
(Chen等 2007)。
2.1.3 4CL 在大多数维管植物中 4CL以基因家族
的形式出现, 不同的同工酶功能各异, 拟南芥有 4
个 4CL基因和 11个 4CL-like基因。拟南芥、烟
草、杨树等植物 4CL的研究较为深入, 红树莓、
芸香、黄芩、白桦、葡萄、辣椒、丹参、欧
芹、大豆等众多植物的 4CL也被克隆。4CL一般
有3~6个内含子, 水平同源基因间内含子的个数和
位置存在差异。4CL蛋白中存在 2个保守基序, 基
序 I为SSGTTGLPKGV, 基序 II为GEICIRG (Kajita
等 1997)。目前尚无 4CL蛋白晶体结构解析的报
道。
2.2 核心类黄酮 -花青素途径的结构基因
2.2.1 CHS/TT4 已在拟南芥、玉米、矮牵牛、
苜蓿、欧芹、金鱼草、蝴蝶兰、大豆等多种植
物中被克隆, 许多植物存在一个 CHS基因家族, 但
不同物种 CHS的拷贝数差异较大, 拟南芥只有 1
个。CHS的编码区约 1.2 kb, 科间同源性达 60%
以上。除金鱼草 CHS含有 2个内含子外, 其余植
物的CHS都只有1个内含子, 内含子位置保守但长
度变异大, 外显子 2比外显子 1保守; CHS是类黄
酮途径的第一个关键酶(Sommer和 Saedler 1986;
Wang等 2000)。苜蓿等植物的CHS蛋白晶体结构
已经解析, 蛋白的保守域和活性氨基酸位点研究较
为深入。
2.2.2 CHI/TT5 已在很多植物中被克隆, 如拟南
芥、烟草、矮牵牛、苜蓿、洋葱、葡萄、草
莓等。植物有 2类CHI基因, I型为所有植物共同,
导向核心类黄酮合成, II型为豆科植物特有并导向
异黄酮合成, 两类间差异较大, 类型内部差异较小
(Springob等 2003)。CHI一般有 2~3个内含子, 编
码蛋白有 200~250个氨基酸。CHI蛋白结构研究
也较为深入, 已有苜蓿、大豆等多种植物的CHI晶
体结构得到解析。
2.2.3 F3H/TT6 自 1991年从金鱼草克隆以来, 已
从大麦、苹果、矮牵牛、紫花苜蓿、玉米、拟
南芥、甘蓝型油菜、紫苏、银杏等多种植物中
克隆。GenBank中, 多数植物中克隆得到 1~2条
F3H基因, 拟南芥只有 1条, 均具有 2个内含子, 多
数植物的 F3H蛋白为 350~380个氨基酸。F3H属
于非血红素铁类型的氧化酶超家族, 催化反应需要
分子O2、Fe2+、2-酮戊二酸和抗坏血酸盐作为辅
因子(Pelletier和 Shirley 1996)。矮牵牛等植物的
F3H蛋白已完成晶体解析, 三维结构呈果冻型, 反
应中心位于裂口中, 结合 Fe2+、2-酮戊二酸等的活
性氨基酸位点已得到确认。F3H与同属于该超家
族的 FNSI (黄酮合酶 I)、FLS (黄酮醇合酶)、F6H
(类黄酮 6-羟化酶)有一定的同源性。
2.2.4 F3’H/TT7 在拟南芥、矮牵牛、紫苏、
甘蓝型油菜和多种植物中已被克隆, 多数植物中被
克隆到 1~2条, 但葡萄中克隆到 4条, 拟南芥中只
有 1条。F3’H一般有 1~3个内含子, 个数和位置
欠保守。同 C4H、F3’5’H (类黄酮 3’,5’-羟化酶)
一样, F3’H也属于细胞色素 P450超家族, 构成
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CYP75B亚家族, 并且在基因尤其是蛋白序列上与
F3’5’H有较高的同源性, 在蛋白的一些保守基序上
与C4H有一定的同源性。目前尚无F3’H蛋白晶体
结构解析的报道, 但其富脯氨酸膜锚、氧结合位
点、血红素结合位点、ERR三联体等 P450保守
性基序较为明确, 并且含有VDVKG、VVVAAS保
守基序和 F3’H特异性的GGEK基序(Xu等 2007)。
2.2.5 DFR/TT3 已在拟南芥、非洲菊、玫瑰、
康乃馨、百合、葡萄、大麦等多种植物中被克
隆, 多数植物中克隆了 1~3条, 拟南芥只有 1条, 但
百脉根有 5条; 多数具 5个内含子, 内含子数量和
位置保守。DFR属于DFR超家族的脱氢酶, 一般
有337~446个氨基酸, 不同物种间DFR与NADP结
合位点“VTGAAGFIGSWLIMRLLERGY”是高度保
守的(Johnson等 1999)。DFR中存在一个决定底
物特异性的26个氨基酸的区域, 并已揭示了几个对
酶活性非常重要的保守性残基。葡萄等植物的
DFR蛋白晶体结构已得到解析。
2.2.6 LDOX/ANS/TT18 已从拟南芥、桃、蝶
豆、洋桔梗、紫苏、葡萄、马铃薯、胡萝卜、
菊科植物、圆叶牵牛、银杏、烟草、大豆等众
多植物中克隆, 多数植物为 1~4条, 但小麦有 6条。
该基因在多数植物中含有 1个内含子, 但裸子植物
银杏中有 2个内含子, 而在单子叶植物普通小麦中
没有内含子。拟南芥中该基因编码 356个氨基酸
的蛋白(Abrahams等 2003)。同 F3H、FLS、ACC
氧化酶等一样, LDOX也属于非血红素铁类型的氧
化酶超家族, 在部分核苷酸序列尤其是蛋白一些保
守性基序上与它们有一定的同源性。拟南芥等植
物的 LDOX蛋白晶体结构已经解析, 大体形状与
F3H 相似。
2.3 原花青素特异途径的结构基因
2.3.1 LAR 该基因最早在银叶山蚂蝗中基于蛋白
纯化后克隆得到, 编码 382个氨基酸, 与异黄酮还
原酶具有同源性, 直接还原无色花青素而形成 2,3-
反式黄烷 -3-醇(儿茶酚) (Abrahams等 2003)。葡
萄、西洋梨、草莓、茶叶、百脉根、苜蓿、
苹果、棉花、菜豆、火炬松、大麦等植物中也
克隆了该基因, 多数为 1~2条, 但百脉根中存在 2
个亚家族各 2条, LAR一般具 4个内含子。LAR广
泛分布于高等植物, 是儿茶素类 PA特异途径的第
一个关键酶, 但奇怪的是拟南芥没有LAR。LAR蛋
白尚没有晶体解析的报道, 数据库中拟南芥LAR的
三维结构实为 BAN的。
2.3.2 ANR/BAN 已从拟南芥、西洋梨、草莓、
亚洲棉、柿、葡萄、百脉根、香蕉、菜豆、
苹果、银杏、茶叶、苜蓿等多种植物中克隆, 多
数为 1~2条, 拟南芥只有 1条, 百脉根中较多; 多数
具 5个内含子, 内含子数量和位置较保守, 但草莓
中只有 4个内含子。拟南芥 ANR基因编码 342个
氨基酸, 与DFR有较高的相似性, 还与 CAD (肉桂
醇脱氢酶)具有低的同源性, 属于DFR超家族的脱
氢酶类, 是表儿茶素类 PA特异途径的第一个关键
酶, 将花青素还原为2,3-顺式黄烷-3-醇(表儿茶酚)
(Devic等 1999; Lepiniec等 2006)。多数植物同时
具有LAR和ANR, 能同时合成儿茶素和表儿茶素,
拟南芥由于缺乏LAR而只能合成表儿茶素。ANR
蛋白尚没有晶体解析的报道, 但基于葡萄DFR的三
维结构, 建立了拟南芥ANR的三维模型。
2.3.3 GST家族成员TT19/AN9/Bz2 GST在每种植
物中均以基因超家族的形式出现, 如拟南芥中有47
个成员, 水平同源基因间在多数区段上保守, 但功
能各异, 主要表现在底物特异性和转运靶向(液泡、
胞外等)不同(W agne r 等 20 02 )。拟南芥 T T1 9
(AtGSTF12)和 AtGSTF11、大豆GST22、柑桔GST
(DQ207360.1)、矮牵牛 AN9 (Y07721)、宽叶菜豆
GST (AY099257)、水稻GST (NM_193840)、玉
米Bz2等基因组成一个同源群, 但它们的功能却较
难根据同源性来确定。TT19、AN9与 Bz2间虽然
同源性并不高, 但据报道它们均转运花青素等类黄
酮物质并定向液泡。TT19还转运 PA (Kitamura等
2004), 介于它们中间的AtGSTF11则被推断有可能
转运硫代葡萄糖苷(Hirai等 2005)。AN9转化 tt19
突变体后恢复了花青素的积累, 但种皮中没有褐色
色素的积累(Kitamura等 2004), 表明垂直同源基因
间的功能并不完全对应。尚没完成 TT19、AN9
和Bz2等蛋白的晶体解析, 但基于GST大家族的高
度保守性, 可用玉米抗除草剂的GSTIII等的模型为
模板预测出它们的三维结构。
2.3.4 MATE家族成员 AtDTX41/TT12 拟南芥
MATE (multidrug and toxic compound extrusion)大
家族由 5 6 个成员构成( A t D T X 1 ~ A t D T X 5 6 ) ,
AtDTX41/TT12与其他AtDTX基因的距离较远(Li等
2002)。TT12有 7个内含子, 外显子编码 507个氨
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基酸, 蛋白有 12个跨膜域用于与液泡膜结合, 在
ATP存在时该蛋白使液泡膜两侧产生质子梯度, 将
糖基化的黄烷 -3-醇向液泡内转运, 同时将质子泵
出液泡外(Debeaujon等 2001; Marinova等 2007)。
其他植物中尚没有TT12垂直同源基因的公开报道,
不过, 葡萄中一个推定MATE蛋白(CAO069963)和
水稻基因组注解的OsTT12 (ABA99853)与TT12具
有垂直同源性, 尤其是在跨膜域和一些跨膜域间的
间隔区很保守。TT12尚没有解析三维结构, 基于
其他MATE模板也预测不出。
2.3.5 ATPase家族成员 AHA10 拟南芥质膜H+-
ATPase基因家族有 11个成员, 相互间有较高的同
源性。AHA10 (autoinhibited H+-ATPase isoform
10)基因有 20个内含子, 外显子编码 947个氨基酸,
其功能既是种皮中PA聚合又是早期种皮细胞中液
泡发育所必须的(Baxter等 2005)。在GenBank登
录的矮牵牛的 PH5应当是 AHA10的垂直同源基
因。AHA10尚未建立晶体结构, 但可基于AHA2预
测其三维结构。
2.3.6 LAC家族成员 LAC15/TT10 拟南芥漆酶大
家族有17个成员(LAC1~LAC17), 相互间有显著的
同源性。LAC15/TT10基因有 5个内含子, 外显子
编码 565个氨基酸, 蛋白结合Cu2+, 具双重功能, 氧
化种皮中的 PA单体和木质素单体形成聚合物, 据
称也参与根系伸长; TT10与水稻OsLAC1、漆树
RvLAC2、欧亚槭ApLAC1、亚洲棉GaLAC1等具
有较高的同源性, 后三者也参与多酚代谢, 分别氧
化漆酚、木质素单体、芥子酸而形成漆、木质
素聚合物、单内酯型二聚物(Pourcel等2005; Liang
等 2006)。TT10及类似蛋白尚未建立晶体结构, 但
可基于其他二酚氧化酶模板预测其基本三维结构。
2.4 植物原花青素积累的调控基因
2.4.1 WIP-ZF亚家族成员TT1 属于拟南芥锌指蛋
白超家族的WIP亚家族高度同源的 6个成员之一,
有 1个内含子, 外显子编码 303个氨基酸, 调控内
种皮细胞发育和分化, 靶基因和调控机制不明, 可
能调控 BAN 基因等(Sa gass er 等 200 2)。大豆
GmWIP1、水稻WIP1等与拟南芥WIP亚家族具
有较高的同源性, 但尚不清楚具体功能。WIP亚
家族缺乏三维结构解析, 目前的软件也预测不出。
2.4.2 R2R3-MYB家族成员 AtMYB123/TT2 属于
拟南芥 R2R3-MYB超家族 133个成员中的 1个, 有
2个内含子, 外显子编码 258个氨基酸, 蛋白N端
具有 R2R3-MYB DNA结合域, 特异在发育种子的
内种皮中调控结构基因 D FR、L D O X、A N R、
TT12等的表达(Nesi等 2001)。所有生物的 R2R3-
MYB蛋白在MYB域极其保守, 但在C-端域又极不
保守。TT2等MYB因子需要通过MYB域中的特
定基序与 bHLH蛋白如TT8互作, 并需要WD40蛋
白 TTG1的参与, 才能充分发挥转录调控作用。同
为十字花科的甘蓝型油菜中有3个TT2的垂直同源
基因(BnTT2-1~BnTT2-3) (Wei等 2007)。与 TT2相
似, 葡萄中VvMYBPA1基因在果实成熟时特异调控
PA的合成, VvMYB5B基因促进发育果实中花青素
和 PA的合成(Bogs等 2007; Deluc等 2008)。TT2
及类似蛋白缺乏晶体解析, 但几乎所有的 R2R3-
MYB蛋白均可预测出R2R3-MYB域的基本三维结
构。
2.4.3 bHLH家族成员TT8 属于拟南芥bHLH (MYC)
超家族 161个成员中的 1个, 有 6个内含子, 外显
子编码518个氨基酸, 蛋白C端有一个由51个氨基
酸构成的 bHLH DNA结合域。在TTG1的参与下,
它既可与MYB因子TT2结合, 调控种皮色素合成,
也可与MYB因子PAP1结合, 调控多种器官中花青
素苷的合成, 靶基因为DFR和BAN, TT8还可调控
自身的表达(Nesi等 2000; Baudry等 2004, 2006)。
TT8及类似蛋白缺乏晶体解析, 目前的软件也预测
不出。
2.4.4 WD40家族成员 TTG1 是拟南芥WD-repeat
(WDR)超家族237个潜在成员中的1个(van Nocker
和 Ludwig 2003), 在 3’非翻译区有 1个内含子, 外
显子编码 341个氨基酸, 含有 4个WD40重复。
TTG1调控多个发育和生化途径, 包括根毛、茎叶
表皮毛的形成, 植株花青素苷、种皮粘液、种皮
色素的合成与积累, 并且是通过与1个MYB蛋白和
1~2个 bHLH蛋白形成复合物来完成的, 因此 TT2
和 TT8的靶基因都是 TTG1的靶基因, TTG1还调
控另一个调控因子 TTG2的表达, 但 TTG1对于靶
DNA序列的特异识别似乎不是必要的(Walker等
1999; Baudry等 2004; Dixon等 2005)。虽然WD40
蛋白表现出了跨越生物界的高度保守性, 但 TTG1
及类似蛋白缺乏晶体解析, 目前的软件也预测不出
三维结构。
2.4.5 WRKY家族成员WRKY44/TTG2 是拟南芥
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WRKY超家族75个成员中的1个, 有4个内含子, 外
显子编码 429个氨基酸, 有 2个WRKY保守域, 是
WRKY家族已知调控形态建成的唯一成员。TTG2
调控 PA的合成, 靶基因尚不确定, 可能有 ANR; 它
还调控表皮毛分化和种皮粘液合成, 在调控根表无
毛细胞的发育时可能与其他基因存在冗余, 但是独
立于 TTG1和GL2 (Johnson等 2002)。虽然已有拟
南芥其他WRKY成员的蛋白三维模型, 但无法预测
出 TTG2的基本三维结构。
2.4.6 MADS家族成员 TT16 是拟南芥MADS box
超家族B-sister分支的一个成员, 有 6个内含子, 外
显子编码 2 5 2 个氨基酸, 含 A R AB I D O P S I S
BSISTER (ABS) MADS结构域, 调控珠被细胞形状
的发育, 但与胚珠的功能无关, 还调控内种皮中PA
的合成与积累, 靶基因不清楚, 初步确定有 ANR
(Nesi等 2002; Dixon等 2005)。TT16缺乏晶体解
析, 目前的软件也预测不出三维结构。
2.4.7 花青素苷途径的类似调控蛋白 目前已从玉
米、矮牵牛、金鱼草、葡萄、非洲菊、拟南
芥、苹果、紫苏等多种物种中克隆了将代谢途径
引向花青素苷积累的一些调控因子。WDR因子有
矮牵牛的 PhAN11、苹果的MdTTG1、玉米的
PAC1、紫苏的 PfWD、圆叶牵牛的 InWDR1等;
R2R3-MYB因子有拟南芥的 PAP1/AtMYB75、
PAP2/AtMYB90、AtMYB113、AtMYB114, 玉米的
C1, 矮牵牛的AN2, 紫苏的MYB-P1; bHLH因子有
拟南芥的GL3和 EGL3, 玉米的 R/B家族如 Lc, 矮
牵牛的AN1和JAF13, 紫苏的MYC-F3G1和MYC-
RP等; 它们调控由 CHS至 LDOX以及花青素苷特
异途径的一些结构基因的表达, 使细胞中积累花青
素苷(Yamazaki等 2003; Dixon等 2005; Grotewold
2006; Gonzalez等 2008)。
3 植物原花青素合成功能基因的重要共性特征
3.1 基因家族和单基因 基因组水平和基因水平的
加倍及随后的歧化是植物分子进化的重要方向, 许
多植物的苯丙烷复合途径中的多数位点是由2个或
更多的基因家族成员所编码的, 家族成员间在总体
结构和功能上相似, 但往往在转录表达的组织特异
性、诱导表达特性、蛋白活性水平、蛋白底物 /
顺式元件的偏好性上存在差异。但模式植物拟南
芥是小基因组高等植物, 其 PA途径中单基因位点
相对较多。拟南芥中公共苯丙烷途径的 3个酶有
2个是由基因家族编码的, PAL由 4个成员编码,
C4H为单基因编码, 4CL由 4个成员编码, 但还存
在 11个不具有 4CL底物特性的 4CL-like蛋白。拟
南芥类黄酮 -PA 途径中, 所有结构蛋白(CH S、
CHI、F3H、F3’H、DFR、LDOX、ANR、TT19、
TT12、AHA10、TT10)及调控蛋白 TT1、TT2、
TT8、TT16、TTG1、TTG2均由单基因编码(Nesi
等 2001)。但是, 象甘蓝型油菜这样的多倍体物种,
很难有单基因位点。本课题组近几年的系统研究
结果表明, 甘蓝型油菜中最少有 2个、最多有 12
个以上的垂直同源基因与拟南芥苯丙烷 -类黄酮 -
原花青素途径的单个基因相对应(Chen等2007; Wei
等 2007; Xu等 2007; Ni等 2008)。
3.2 表达特性 植物界中, PAL、C4H、4CL等公
共苯丙烷途径的基因具有类似组成型表达的特征,
组织特异性不强, 因为它们涉及多种组织中近似组
成型的木质素的合成与积累, 但仍以木质素、类黄
酮等物质密集合成的组织中表达较丰。类黄酮途
径的基因表达具有组织特异性和发育阶段性。植
物的花、衰老叶片、花青素苷着色的茎叶表皮中
类黄酮 -花青素苷途径的基因大量表达, 其他组织
中表达低。开花授精后, 内种皮中苯丙烷 -类黄酮-
花青素 -原花青素复合途径的基因表达强烈, 合成
PA, 并随着种皮的发育而转运到其他种皮细胞层中
积累并聚合, 而使种皮显黑褐色(野生型拟南芥为深
褐色种皮)。PA合成的全套基因在植物的非种皮
组织如柿子果肉、栎树种子胚、茶等植物的叶中
也表达, 合成并积累聚合度较低或呈单体状的PA。
需要指出的是, 拟南芥 PA特异途径的一些基因如
ANR、TT12、AHA10、TT10、TT1、TT2、TT16
等主要在内珠被 /内种皮中表达。此外, 已有研究
一致表明, 苯丙烷 -类黄酮途径的众多结构基因和
调控基因均具有诱导表达特性, 最典型的是受紫外
线诱导而启动 /上调表达, 还可以受病原菌侵染、
动物取食、干旱、温度胁迫、盐害等多种生物 /
非生物性逆境胁迫诱导而上调表达(Sha rma 和
Dixon 2005; Lepiniec等 2006)。
3.3 亚细胞定位和蛋白复合物 植物细胞蛋白纯
化、表达蛋白亚细胞定位、蛋白互作研究、生
物信息学预测等表明, 苯丙烷 -类黄酮 -原花青素
途径起催化反应的众多关键酶(从 PAL直至ANR)
是定位于细胞浆中的, 并且相互之间以一种酶复合
植物生理学通讯 第 45卷 第 5期，2009年 5月 515
物的形式存在, 其中 P450蛋白 C4H、F3’H等的跨
膜域与膜系统(微粒体膜、内质网膜、质膜？)结
合而形成复合物的膜锚, 蛋白的其余部位和其他蛋
白位于胞浆中(Hrazdina和Wagner 1985; Xu等
2007)。通过酶复合物的形成, 一是加速了代谢途
径的物质流和连续催化反应的效率, 二是可能将家
族蛋白中的特定成员分工后定向了特定的代谢途
径, 进行专一化的进化。但是, 这方面还只是停留
在现象观察和假说阶段, 详细机制有待阐明。花青
素 /原花青素转运蛋白中, 预测 TT19和其他GST
一样定位于胞浆, 通过结合到靶分子而进行转运;
TT12和AHA10定位于液泡膜, 通过产生跨膜质子
梯度而将靶分子运到液泡, 但是它们是否与其他蛋
白形成复合转运体尚缺乏明确报道。苯丙烷 -类
黄酮 - 原花青素途径的主要调控蛋白如 T T 1、
TT2、TT8、TT16、TTG2 等均定位于细胞核,
符合转录因子的特征, 虽然TTG1缺乏核定位信号,
但据认为它在胞质中以与其他转录因子形成复合物
的形式而被运向细胞核中。而且, 多种调控蛋白往
往是以一个复合物的形式与靶基因启动子的顺式元
件相作用的, 最著名的为WD40-MYB-bHLH模型,
WD40起支架和平台作用, 促进MYB与bHLH间的
分子作用以及其他蛋白互作。拟南芥中, 这种复合
物在 PA途径中为 TTG1-TT2-TT8, 在花青素苷途
径中为 TTG1-PAP-TT8, 在种皮粘液合成、表皮
毛发育、根毛发育中则由其他MYB和bHLH因子
来取代(Lepiniec等 2006; Gonzalez等 2008)。
3.4 突变体表型 从酶催反应链和物质流的角度, 目
前所描绘的苯丙烷 -类黄酮 -原花青素代谢途径类
似于一条水渠, 其上串联性地设立了十几个闸口(图
1), 每个酶相当于一个闸口, 任意一个闸口的关闭即
任意一个酶的去功能化均可导致整个代谢途径的阻
塞, PA积累受阻。对于由基因家族编码同一或相
似功能的蛋白而言, 基因成员间具有冗余性, 单基
因突变的表型效应有限。而对于单基因位点, 突变
可能带来显著的表型变化。基因突变的遗传和表
型效应依具体位点而异, 不同植物间由于基因冗余
性不同而存在差异。由于植物公共苯丙烷途径一
般具有基因家族冗余性, 所以尚未见PAL、C4H和
4CL单基因突变引起巨大表型变化的报道。奇怪
的是, 虽然拟南芥只有 1个 C4H基因, 但 c4h突变
体基本能正常生长发育, 而且能正常积累种皮色素,
这说明要么拟南芥中存在另外一种酶可部分代替
C4H的活性, 要么存在C4H的低效性绕过途径, 这
是苯丙烷途径中值得深入研究的重要现象。类黄
酮途径的基因变异容易引起种皮、花、茎叶表面
等器官着色方式的改变, 拟南芥、玉米、矮牵
牛、金鱼草等植物中的研究较系统。拟南芥中由
于类黄酮-PA途径中的所有位点均是单基因, 所以
这些位点的单基因的功能失活性突变均能产生透明
种皮( t r an sp ar en t te s t a , t t )和透明种皮无毛
(transparent testa glabra, ttg)突变体(Shirley等
1995)。拟南芥核心类黄酮 -花青素途径的关键酶
基因 CHS、CHI、F3H、F3’H、DFR和 LDOX
突变失活后花青素合成之前的步骤受到阻碍, 产生
黄籽、灰黄籽和黄褐籽等, 分别命名为 tt4、tt5、
tt6、tt7、tt3和 tt18/tds4/tt11位点。拟南芥 PA特
异途径中, ANR基因突变使种皮中积累花青素而非
P A , 所以种皮显红色, 又称之为 b a n 突变体;
GSTF12、DTX41、AHA10和 LAC15基因突变后
要么 PA转运受阻, 要么 PA聚合受阻, 产生黄褐籽
或褐化推迟, 分别命名为 tt19/tt14、tt12、aha10
和 tt10突变体。PA途径的调控基因也是一些特定
的结构基因表达所必须的, 拟南芥 PA途径所有已
知 6个调控基因的突变体 t t1、t t2、t t8、t t16、
ttg1和ttg2均使种皮色素积累受阻而表现为黄籽或
黄褐籽, ttg1和 ttg2的表皮毛和根毛发育以及种皮
粘液积累受阻。PA途径的突变体除影响种皮着色
外, 还影响植物其他性状。叶片、未成熟果实、
种子中的涩味物质为 PA及其低聚物, 如果柿树突
变体中 PA途径基因表达受阻, 未成熟柿子中的涩
味物质较少或没有(Lepiniec等 2006)。
4 植物原花青素相关性状代谢工程进展及展望
4.1 牧草品质的改良 PA对动物营养的影响受到关
注。对于单胃动物, 食料中的PA总是有害的(Aerts
等 1999)。对于反刍动物, 高浓度 PA会降低草料
的适口性和营养价值(Mueller-Harvey和McAllan
1992), 但适当浓度的PA与蛋白的结合物可适当抑
制瘤胃中的微生物, 增加过瘤蛋白并使之成为动物
的营养物质(Aerts等 1999)。紫花苜蓿是最主要的
牧草, 虽在种皮中积累PA, 但在叶中不积累PA, 导
致含蛋白质很高的牧草在瘤胃中过快地被微生物所
消化, 产生大量温室气体甲烷, 动物容易得胀气病
而死。牧草中适量的PA可以控制蛋白质的消化进
植物生理学通讯 第 45卷 第 5期，2009年 5月516
程, 增加饲料利用率, 消除动物的胀气病。在不增
加羊自由采食量的前提下, 百脉根中2%~4%的PA
能提高羊毛生长速度 1%、体重 8%、产奶量 21%
和产羔率 15%~30%。将 PA生物合成的功能基因
导入到紫花苜蓿和三叶草等牧草中, 提高PA含量,
是一个不错的技术路线(Dixon等 2005, 2006)。将
玉米 B-Peru和C1基因转入紫花苜蓿后, 叶组织中
有 PA积累(Ray等 2003)。随着对 PA生物合成途
径的深入了解, 今后需要制定更加合理的分子育种
路线, 一方面消除单胃动物饲料中的PA, 另一方面
使反刍动物饲料中维持合理的 PA水平。
4.2 农产品的脱涩 高粱是酿造白酒的上乘原料, 但
高含量的 PA会在发酵中与 α-淀粉酶和蛋白酶结
合, 使酶的相变温和热熔发生变化, 活性降低, 影响
酿造(刘睿等 2006)。柿子是人们钟爱的水果之一,
但柿果中的 PA产生强烈的涩味和收敛作用, 影响
取食口感、消化特性甚至人的胃肠功能, 因此脱涩
是柿子利用的一个重要内容。全甜柿类型(PCNA)
随着果实的成熟而失去涩味, 而完全涩柿类型(PCA)
即使是在果实成熟后仍保留涩味。在果实发育的
早期, 两种类型都带有涩味, PA合成的 9个结构基
因都高水平地表达。后来的果实发育中, PCNA柿
子中PA合成的有关基因停止表达, PA积累突然终
止, 但PCA柿子直到成熟时这9个基因同样高水平
表达, PA继续积累(Ikegami等 2005)。柿子中
ANR、类丝氨酸羧肽酶(SCPL)等基因已经克隆, 未
成熟柿子经乙醇处理不仅能直接使PA变成不可溶
的物质, 还导致 PA合成途径中基因表达水平的下
调(Ikegami等 2007)。以上只是 2个典型例子, 其
实许多农产品都涉及到如何消除食用器官中的涩味
的问题。通过传统手段选育不含或低含 PA的高
粱、柿子并不容易, 因为首先必须创造 PA积累相
关基因突变或表达下调的基因型。随着对PA生物
合成途径的深入解析, 完全可以采用代谢工程手段,
对PA途径的结构基因和调控基因进行多价沉默, 抑
制 PA积累, 创造转基因无涩味农产品。
4.3 油菜黄籽性状的分子育种 与黑籽油菜相比, 黄
籽油菜的种皮薄, 含油量高, 油质清澈透明, 饼粕蛋
白质含量高, 纤维素和多酚含量低, 饲料利用价值
高, 因此国内外都把黄籽作为油菜育种的一个重要
目标。种皮栅状细胞层中的色素主要为 PA聚合
物, 黄籽是因为种皮色素减少、种皮透明而观察到
种胚的颜色(Tang等 1997)。天然的甘蓝型油菜中
缺少黄籽基因型, 现有的甘蓝型油菜黄籽类型主要
通过种间远缘杂交而产生, 育种周期长, 且黄籽表
现型不稳定, 易随环境而变异, 选育效率低(刘后利
1992)。运用代谢工程的方法, 抑制与PA积累相关
基因的表达, 是创造油菜稳定黄籽性状的一个重要
策略。比如, 拟南芥 TT2、PAP等转录因子的基
因工程操作成功地通过调节BAN等基因的表达而
达到了修饰 PA积累效果(Sharma和Dixon 2005)。
近5年来, 本课题组对甘蓝型油菜及其亲本物种甘
蓝和白菜型中苯丙烷 -类黄酮 -原花青素途径的主
要结构基因家族和调控基因家族进行了系统的克
隆, 主要基因均获得了全长cDNA和对应的基因组
序列, 通过芸薹属内种间以及芸薹属与拟南芥属间
功能比较基因组学的研究, 揭示了诸多物种进化、
基因进化、表达调控的规律, 对甘蓝型油菜黑籽优
良品种中多个功能位点进行反义沉默后, 获得了一
批种皮色素变浅的转基因株系。
4.4 葡萄和葡萄酒的品质改良 葡萄籽和葡萄皮中
含有较多的PA, 葡萄和葡萄酒中的PA对健康有积
极作用, 如抗氧化、清除自由基、保护心血管、
抗肿瘤、抗突变、抗炎等, 也是影响葡萄酒风味
和品质的重要成分(赵艳和吴坤 2006)。针对鲜食
和不同的酿造目的, 葡萄中的总酚、PA和花青素
苷需要合理的含量, 过高和过低均不好, 而现有资
源间的差异较大(李记明和贺普超2000), 因此葡萄
品质改良中涉及 PA等类黄酮物质的优化。此外,
葡萄籽是人工提取用于医疗和保健业的PA的最重
要原料, 如何在保证葡萄和葡萄酒品质的前提下, 使
葡萄籽的PA含量尽可能高(如高PA种仁), 值得探
索。已从葡萄中克隆了 LAR和 ANR, 现在葡萄 PA
合成的许多基因都已克隆, 运用代谢工程调控葡萄
籽和葡萄皮中 P A 的水平已成为可能( B o g s 等
2005)。
4.5 茶多酚的分子育种 茶多酚是茶叶的重要品质
性状, 具有多种保健和医疗作用, 高含量是茶叶品
质改良所追求的目标。茶多酚是PA的单体及聚合
体形式, 茶多酚改良的本质是调控总 PA含量、不
同类型 PA间的比例和 PA聚合度。茶叶 PA途径
的多数基因已经克隆, 有关分子机制将会逐渐明晰,
PA途径的代谢工程将用于茶多酚优化和茶叶品质
改良, 或创造用于茶多酚提取的专用品种(Dixon等
植物生理学通讯 第 45卷 第 5期，2009年 5月 517
2005; Xie和Dixon 2005)。
4.6 作物抗病虫性的提高 单宁作为蛋白变性剂、
金属和有机分子络合剂、拒食剂, 是植物长期进化
而来的一种重要的抗病虫机制(李雪莹等 2005)。
野生植物的抗病虫性普遍强于栽培品种, 高含单宁
是其中一个重要原因。栽培品种在长期的人工品
质选择中逐渐失去或大大降低了单宁含量, 但往往
非食用器官随着食用器官一道发生了 PA的下降。
随着植物 PA代谢途径的深度解析, 可以采用组织
特异或诱导表达启动子, 使作物的非食用器官中大
量积累PA, 提高抗病虫性, 而食用器官中仍然保持
低或无 P A。
4.7 新型作物的拓展 自然界蕴藏有丰富的野果、
野种等, 但许多由于含有毒素或抗营养成份而无法
作为食物资源。单宁在维管植物中含量仅次于纤
维素、半纤维素和木质素, 是一种主要的抗营养
剂, 是许多植物资源利用的限制因素(朱南山等
2006)。例如, 橡籽仁的可利用营养价值接近或略
低于玉米, 略优于稻谷, 是可利用的野生资源, 但含
有较高的单宁和氢氰酸(何瑞国等2000), 如果通过
转基因降低橡籽中单宁和产氢氰酸物质, 可作为新
型饲料。
单宁其实很通俗, 与农业生产、人体营养和
医疗健康息息相关, 但许多人对原花青素的概念相
对陌生。从前对单宁的化学结构、抗营养性、与
作物性状和人体健康的关系、去除方式等进行了
广泛研究, 但从分子机理的角度系统解析单宁 /PA
的生物合成途径, 则是近些年来随着拟南芥突变体
研究的深入才成熟起来的。正因为如此, 才使我们
对单宁这个旧话题有了全新的理论认识, 尤其是PA
途径一系列功能基因的克隆, 使我们能够从代谢途
径分子调控的角度, 为今后作物品质、抗性等性状
的改良来设计 PA的代谢工程。
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