全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 6期, 2010年 6月 549
NO参与玉米幼苗对盐胁迫的应答
侯丽霞, 车永梅, 赵方贵, 唐静, 刘新 *
青岛农业大学生命科学学院, 山东青岛 266109
提要: 以玉米幼苗为材料, 研究盐胁迫下其內源NO含量、NR和NOS活性的变化; NOS专一性抑制剂 L-NAME和NR非
专一性抑制剂NaN3对玉米幼苗內源NO含量的影响; 利用激光共聚焦显微技术观测盐胁迫下玉米幼苗根部NO含量的变
化及其分布特点。结果表明, 盐胁迫下玉米幼苗根尖和叶片中NO含量有猝发现象, NOS活性也随之显著提高, NR活性则
显著降低; L-NAME或NaN3均可降低盐胁迫所引起的玉米幼苗NO水平的增加, L-NAME对NO含量的影响比NaN3更显
著。推测, NO参与玉米幼苗对盐胁迫的应答, NOS途径是盐胁迫下玉米幼苗內源NO合成的主要途径。
关键词: 玉米幼苗; 盐胁迫; 一氧化氮; 一氧化氮合酶
NO Involved in the Response of Maize Seedlings to Salt Stress
HOU Li-Xia, CHE Yong-Mei, ZHAO Fang-Gui, TANG Jing, LIU Xin*
School of Life Sciences, Qingdao Agricultural University, Qingdao, Shandong 266109, China
Abstract: The changes of endogenous nitric oxide (NO) content, nitrate reductase (NR) and nitric oxide syn-
thase (NOS) activity, effects of NOS inhibitor Nω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) and NR inhibitor
NaN3 on NO content in maize seedlings under salt stress were studied. The results showed that NO content and
NOS activity in root tip and leaf of maize seedlings increased under salt stress, but NR activity decreased. After
treated with L-NAME and NaCl together, NO content in maize seedlings decreased significantly, yet NO content
decreased a little after treated with NaN3 and NaCl. In order to prove salt stress-induced NO synthesis in root,
the distribution of NO in root of maize seedlings was researched by confocal laser scanning microscope. NO is
mainly distributed in root epidermis and hairs. The content of NO treated with L-NAME decreased more signifi-
cantly than that treated with NaN3. These results suggested that salt stress could promote the synthesis of NO
in maize seedlings by stimulating the NOS pathway, and NO participated in salt signal transduction in maize
seedlings.
Key words: maize seedlings; salt stress; nitric oxide; nitric oxide synthase
收稿 2010-03-25 修定 　2010-04-12
资助 山东省教育厅基金 ( J 0 4 C 1 3 )和国家自然科学基金
(3 0 9 70 2 2 8 )。
* 通讯作者(E-mail: liuxin6080@yahoo.com.cn; Tel: 0532-
8 8 0 3 0 2 2 4 )。
一氧化氮(nitric oxide, NO)是植物体内一种重
要的信号分子, 参与植物对多种生物胁迫与非生物
胁迫的应答过程(李慧等 2009)。许多研究表明, 外
源NO供体硝普钠(sodium nitroprusside, SNP)可以
缓解盐胁迫诱导的大麦叶片离子渗漏和丙二醛的积
累(Li等2008); SNP预处理可以促进盐胁迫下玉米
幼苗生长, 提高植株干重(Zhang等 2006)。但目前
鲜见关于内源NO是否参与植物体对盐胁迫应答的
报道, 盐胁迫下 NO来源也不明确。
植物细胞中NO的合成分为酶途径和非酶途
径, 酶途径主要是依赖于硝酸盐 /亚硝酸盐途径和
依赖于 L-精氨酸的途径。前者的关键酶主要是胞
质的硝酸还原酶(nitrate reductase, NR)及根部特异
性的亚硝酸盐NO还原酶(nitrite NO reductase, Ni-
NOR); 后者相应的关键酶可能包括类一氧化氮合酶
(nitric oxide synthase, NOS), 且在多种植物组织及
细胞器中检测到其活性(Besson-Bard等2008a)。如
线粒体、细胞核和过氧化物酶体中均存在依赖于
L-精氨酸的NOS活性(Corpas等2006), 且动物NOS
的抑制剂 L-NAME同样可抑制植物中NO的产生
(Yan等 2007)。基于此已有研究表明在植物生长
发育(Corpas等 2006)、对生物胁迫的病原激发子
的响应(Besson-Bard等2008b)和非生物胁迫过程中
均存在依赖于精氨酸的NO合成途径。有研究表
明, NOS途径产生的NO参与了镉离子诱导的拟南
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芥悬浮细胞的程序性细胞凋亡(De等 2009)。而且,
NOS途径产生的 NO 参与拟南芥的盐适应过程
(Zhao等 2007)。水分胁迫可导致玉米叶肉细胞中
NO积累, NOS和NR抑制剂均可逆转NO含量的升
高, 推测水分胁迫下玉米中NO来源于NOS途径和
NR途径(Sang等2008); Liu等(2006)研究表明, 在茉
莉酸(jasmonic acid, JA)诱导蚕豆气孔关闭的过程
中有NO参与, 并且NO的产生主要依赖于NR途
径。本文研究了盐胁迫下玉米幼苗体内 N O 含
量、NR和NOS的活性变化及NOS专一性抑制剂
Nω-硝基-L-精氨酸-甲酯(Nω-nitro-L-arginine methyl
ester, L-NAME)和NR非专一性抑制剂NaN3对玉米
幼苗內源NO含量的影响, 探究盐胁迫下玉米幼苗
体内NO的来源, 为探明盐胁迫下NO信号转导机
制提供理论依据。
材料与方法
1 实验材料和处理
供试玉米(Zea mays L.)品种为 ‘鲁单 50’。玉
米种子经 0.1% HgCl2消毒 10 min, 反复漂洗, 25 ℃
浸种, 催芽。挑选露白整齐的种子用 1/4 Hoagland
营养液水培, 昼 /夜温度 27 ℃/18 ℃, 光 /暗周期 12
h/12 h, 光照强度 400 μmol·m-2·s-1, 处理期间每天更
换营养液, 待玉米幼苗长至三叶一心期, 取长势一
致的玉米幼苗为实验材料。进行以下处理:
(1)用1/4 Hoagland溶液(对照)和含150 mmol·L-1
NaCl的1/4 Hoagland溶液处理玉米幼苗, 每隔12 h
取样一次, 分别测定各样品中 NO含量、NOS和
NR活性, 每个处理重复 3次。
(2)分别用 1/4 Hoagland溶液(对照)、含 150
mmol·L-1 NaCl的 1/4 Hoagland溶液、含 0.025
mmol·L-1 L-NAME (或 0.1 mmol·L-1 NaN3)的 1/4
Hoagland溶液、含 0.025 mmol·L-1 L-NAME (或 0.1
mmol·L-1 NaN3)加150 mmol·L-1 NaCl的1/4 Hoagland
溶液处理玉米幼苗, 24 h取样, 研究各处理对玉米
幼苗NO含量及根中NO分布的影响, 每个处理重
复 3 次。
2 实验方法
2.1 NO含量测定 试剂盒法测定NO含量, 试剂盒
购自南京建成生物工程研究所。考马斯亮兰法测
定蛋白质含量, 计算每克蛋白含NO的量。
2.2 NOS活性测定 试剂盒法测定NOS活性, 试剂
盒购自南京建成生物工程研究所, 酶活性用U·mg-1
(蛋白)表示。
2.3 NR活性测定 参照郝再彬等(2002)方法。
2.4 玉米根部NO分布测定 用激光共聚焦显微技
术测定NO的分布。取处理 24 h的根进行徒手切
片, 将切片转入 pH为 7.5的HEPES-NaOH缓冲液
(含 20 mmol·L-1 HEPES、NO特异性荧光探针 10
μmol·L-1 DAF-2DA及其他处理液), 在室温(25 ℃)
黑暗条件下孵育 1 h以上。孵育结束后用HEPES-
NaOH缓冲液冲洗3次, 清洗干净后制片。于激光共
聚焦扫描显微镜(Confocal Laser Scanning Microscopy,
CLSM) (Ziess-LSM 510 META)下观察, 扫描, 拍照
(激发光波长 488 nm, 发射波长 515~560 nm)。应
用 Confocal assistant system和 Photoshop 7.0软件
进行分析。每个处理至少重复 5次, 选取其中一张
照片进行分析。
3 数据统计分析方法
测定结果用DPS数据处理系统进行方差分析。
结果与讨论
1 盐胁迫下玉米幼苗体内NO的含量变化
图 1表明, 在一定时间范围内, 对照组玉米幼
苗根尖和叶片中NO含量均无显著变化(P>0.05),
150 mmol·L-1 NaCl处理的玉米幼苗根尖和叶片中
NO含量均呈先增加后减少的趋势, 具有NO的猝
发。根尖中NO的猝发时间早于叶片, 且含量也高
于叶片, 推测这可能由于根尖是盐胁迫诱导NO合
成的原初部位。
业已证明, 植物体可通过酶促反应或非酶促反
应产生NO, NOS和NR是植物体内调节NO合成
的关键酶(Qiao和 Fan 2008)。有报道, 番茄斑点
病菌(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, Xcv)
可诱导水稻细胞NOS活性及NO合成相关基因(nos
和 nr)的表达, 促进NO的迸发(孟威等 2007); 低温
促进大豆NOS活性的提高及NO的积累(Corpas等
2008)。NR和NOS是否参与盐胁迫下玉米幼苗体
内NO的猝发？本文进一步研究了盐胁迫下玉米幼
苗体内NR和NOS活性变化及NR非专一性抑制剂
NaN3和NOS专一性抑制剂L-NAME对NO含量的
影响。
2 NaCl处理对玉米幼苗NR活性的影响
图 2显示, 150 mmol·L-1 NaCl处理玉米幼苗,
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其根尖和叶片中 NR的活性均逐渐降低。在处理
36 h时, 根尖中NR活性降至最低, 叶片中NR活性
在处理 48 h时已降至较低水平(P<0.05)。推测, 在
玉米应答盐胁迫中NO的猝发与NR无关。
3 NR抑制剂对盐胁迫下玉米幼苗NO含量的影响
为进一步探明是否有来源于NR途径的NO参
与玉米幼苗应答盐胁迫过程, 检测了 NR抑制剂
NaN3对盐胁迫下玉米幼苗根尖和叶片NO含量的
影响。实验结果表明, 0.1 mmol·L-1 NR的非专一
性抑制剂NaN3处理玉米幼苗 24 h后, 根尖和叶片
中NO的含量与对照相比有所降低, 但变化不显著
(P>0.05) (图 3)。综合图 1~3的实验结果, NR途
径不是盐胁迫诱导 NO释放的主要途径。
4 NaCl处理对玉米幼苗NOS活性的影响
图 4表明, 150 mmol·L-1 NaCl处理的玉米幼
苗, 根尖和叶片中NOS的活性均迅速升高(P < 0.05),
且根尖中NOS活性变化快于叶片, 这可能与根尖中
NOS较早感受到盐胁迫有关。
5 NOS抑制剂对盐胁迫下玉米幼苗NO含量的影响
L-NAME是NOS的专一性抑制剂。图5显示,
0.025 mmol·L-1的 L-NAME处理玉米幼苗 24 h, 其
根尖和叶片中NO含量均显著低于对照, 表明NOS
是玉米幼苗体内NO合成的一条重要途径。0.025
mmol·L-1 L-NAME与 150 mmol·L-1 NaCl共处理玉
米幼苗 24 h, 其叶片和根尖NO含量显著低于 150
图 1 NaCl处理对玉米幼苗根尖(A)和叶片(B)NO含量的影响
Fig.1 Effects of NaCl on NO contents in root tip (A) and leaf (B) of maize seedlings
图 2 NaCl对玉米幼苗根尖(A)和叶片(B)中NR活性的影响
Fig.2 Effects of NaCl on NR activity in root tip (A) and leaf (B) of maize seedlings
图 3 NaN3对盐胁迫下玉米幼苗根尖和叶片NO含量的影响
Fig.3 Effects of NaN3 on NO contents in root tip and leaf of
maize seedlings
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mmol·L-1 NaCl处理的(P<0.05), 表明NOS途径是
盐胁迫下玉米幼苗根尖和叶片NO的主要来源。
6 盐胁迫对玉米幼苗根部NO分布的影响
作为植物体内调节NO合成的主要酶, NR主
要存在于胞质中, 后来发现在烟草根质膜上有NR
(PM-NR, PM-bound nitrate reductase)活性(Stöhr等
2001), NOS的分布具有较强的组织特异性(Corpas
等 2004; Flores等 2008)。为进一步证明NO参与
玉米对盐胁迫的应答, 并探明盐胁迫所引起NO猝
发的来源。用NO专一性荧光探针DAF-2DA结合
激光共聚焦显微技术检测盐胁迫下玉米幼苗根部
NO含量的变化。结果表明, 150 mmol·L-1 NaCl处
理玉米幼苗24 h, 其根表皮及根毛中绿色荧光均有
较大幅度增加(P<0.05); 0.025 mmol·L-1 L-NAME或
0.1 mmol·L-1 NaN3与150 mmol·L-1 NaCl共处理24 h
绿色荧光均有下降, 而且L-NAME对荧光的削弱作
用比NaN3显著(P<0.05) (图 6~8)。进一步证实, 盐
胁迫下, 玉米幼苗体内有NO生成, 并且NO主要
通过 NOS途径合成。
综合看来, 盐胁迫下玉米幼苗根尖和叶片中均
有NO猝发, 根尖中NO的猝发早于叶片, 且含量
高于叶片; 内源NO参与植物对盐胁迫应答反应, 根
尖是NO的主要合成部位, NOS途径是NO的主要
来源。
最近, Kolbert等(2010)利用拟南芥及其NR突
变体(nia1, nia2)研究发现渗透胁迫(PEG6000)引起
的根系NO的变化与NR途径有关。NO是否参与
植物对盐胁迫的适应及盐胁迫下植物体内NO的来
源还需利用遗传学和分子生物学手段来进一步论
证。Corpas等(2009)研究发现盐胁迫下NOS途径
参与拟南芥胞质 NO的增加, 并且过氧化物体与
NOS转运相关, 那么玉米等单子叶植物是否也存在
同样的机理？另外, 植物体以多种方式、通过多种
信号分子或信号转导途径抵御各种逆境, 活性氧参
与植物对盐胁迫的应答(Tanou等 2009), 并且, 在
图 4 NaCl对玉米幼苗根尖(A)和叶片(B)中NOS活性的影响
Fig.4 Effects of NaCl on NOS activity in root tip (A) and leaf (B) of maize seedlings
图 6 盐胁迫对玉米幼苗根表皮中NO含量的影响
Fig.6 Effects of NaCl on NO contents in root epidermis and
root hairs of maize seedlings
图 5 L-NAME对盐胁迫下玉米幼苗根尖和叶片中NO含
量的影响
Fig.5 Effects of L-NAME on NO contents of root tip and
leaf of maize seedlings
植物生理学通讯 第 46卷 第 6期, 2010年 6月 553
图 7 盐胁迫对玉米幼苗根表皮NO分布的影响(比例尺 100 μm)
Fig.7 Effects of salt stress on the distribution of NO in root epidermis of maize seedlings (bar 100 μm)
A: 对照; B: NaCl处理; C: NaN3处理; D: L-NAME处理; E: NaCl+NaN3处理; F: NaCl+L-NAME处理。A~F中左边的小图是荧光
图, 右边的小图是透射图。图 8 同。
图 8 盐胁迫对玉米幼苗根毛NO分布的影响(比例尺 100 μm)
Fig.8 Effects of salt stress on the distribution of NO in root hair of maize seedlings (bar 100 μm)
植物生理学通讯 第 46卷 第 6期, 2010年 6月554
许多生理过程中NO与ABA、乙烯、H2O2等信号
分子之间存在相互作用(陈康等2006; Ederli等2006;
Lu等 2009)。那么盐胁迫下, NO与这些信号分子
之间的关系怎样？关于盐胁迫下植物体内NO的来
源, 不同植物体内NO的合成途径是否存在差异？
在植物抵御盐胁迫的信号转导途径中NO的上下游
信号组分有那些？NO如何实现对下游组分的调
控？这些都是值得深入探讨的问题。
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