全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2016, 52 (5): 693–702　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2016.0026 693
收稿 2016-01-27　　修定 2016-04-22
资助 国家自然科学基金青年科学基金项目(31401875)。
* 通讯作者(E-mail: ylzhu@njau.edu.cn)。
利用全基因组关联分析获得白菜A01染色体定位的霜霉病抗病位点和相
关分子标记开发
只升华1,2, 苏同兵2, 于拴仓2, 张凤兰2, 余阳俊2, 张德双2, 赵岫云2, 汪维红2, 卢桂香2, 朱月林1,*
1南京农业大学园艺学院, 南京210095; 2北京市农林科学院蔬菜研究中心, 北京100097
摘要: 本研究对202份大白菜自然群体材料进行简化基因组测序(Specific Locus Amplified Fragment Sequencing, SLAF), 并
通过测序深度、SLAF标签的多态性与参考基因组的相似程度等指标的筛选, 获得了全基因组均匀分布的960个SLAF分子
标记。结合相应材料的霜霉病病情调查结果, 利用所述960个SLAF标记进行全基因组关联分析。结果显示: (1)在A01染色
体上检测到1个新的与抗霜霉病关联的SLAF标记, 即SLAFMarkerA0124655323; (2)根据SLAFMarkerA0124655323左右两
翼最近标记之间的距离确定此热点区间为A01染色体24573724~24755150的物理范围; (3)利用该区间内的一个SNP开发出
适用于KASP分型技术的SNP分子标记, 在各亚群选择准确率均在80%以上; (4)在此区间找到抗病相关基因13个。本研究
获得的新的抗病位点和开发的SNP分子标记, 将有助于大白菜抗霜霉病分子育种。
关键词: 大白菜; 霜霉病; 全基因组关联分析; 简化基因组测序; 竞争性等位基因特异性PCR
大白菜(Brassica rapa ssp. pekinensis)最早起
源于中国, 是我国最主要的栽培蔬菜之一, 每年播
种面积和产量占蔬菜作物的15%以上。现已广泛
耕种于日本、韩国等亚洲地区, 其在蔬菜作物中
所占比例逐年上升。而由专一性寄生菌引起的霜
霉病是影响大白菜产量和品质的病害之一, 其发
病范围极其广泛, 在冷凉潮湿的气候条件下, 在大
白菜的苗期和成株期均可发病。生产中很难对霜
霉病进行防治, 目前使用的杀菌剂防治方法存在
成本高、易造成环境污染以及引起霜霉菌生理小
种的变异等问题。因此, 培育抗病品种成为解决
大白菜感霜霉病的根本途径, 加快抗病资源的筛
选迫在眉睫。
目前关于霜霉病抗性及其相关分子标记研究
已有大量报道。Giovannelli等(2002)研究得到与花
椰菜霜霉病抗性基因紧密连锁的2个SCAR标记
UBC359620和OPM16750, 分别距离抗性基因6.7
cM和3.3 cM; Farinhó等(2004, 2007)鉴定出了与青
花菜抗霜霉病基因Pp523紧密连锁的分子标记
OPK17-980和AT.CTA-133/134, 进而将其转化为稳
定的SCAR和CAPS标记, 分别距离抗性基因3.1 cM
与3.6 cM; 而对大白菜对霜霉病抗性的研究比较
少。通过对不同来源的大白菜进行霜霉病抗性鉴
定研究(Silue等1996), 发现大白菜对霜霉病的抗性
属显性遗传(钮心恪1984)。冷月强等(2007)研究获
得了与不结球白菜霜霉病抗性基因紧密连锁的
RAPD标记AY121238, 与抗性基因的遗传距离为
6.7 cM; 虞慧芳等(2010)发展了一个与大白菜霜霉
病抗性基因紧密连锁的分子标记RPP13MK, 距离
抗性基因遗传距离为5.6 cM。也有研究发现大白
菜苗期霜霉病抗性具有数量性状的遗传特征, 存
在一对显性主效基因, 并在一张高密度遗传图谱上
定位了一个控制霜霉病苗期抗性的主效QTL——
BraDM, 并将其定位于A8染色体上, 并在BraDM区
域开发了S C A R标记S C K 1 4 - 8 2 5与S S R标记
kbrb058m10-1和kbrb006c05-2 (Yu等2009, 2011)。
与Yu等(2009)研究结果不同, 有人利用成株期大白
菜在A1染色体上定位了一个的BrRHP1区域(Kim
等2011)。Zhang等(2012)研究发现植物在生长发育
的不同阶段, 对霜霉病表现出的抗性不同。
SLAF-Seq (Specific Length Amplified Frag-
ments Sequencing)是一种简化基因组测序技术, 在
高通量测序技术的基础上, 根据基因组的GC含
量、重复序列情况和基因组特点等信息, 设计标
记开发方案。一方面, 它能获得高密度且均匀分
布于全基因组的序列标签, 使其测序结果能用于
后续的研究工作, 如分子标记辅助选择、构建高
密度遗传图谱、目的性状的QTL精细定位以及候
选基因克隆等; 另一方面, 相对于传统的分子标记
开发策略, SLAF-Seq技术能一次性获得大量不同
植物生理学报694
样品间的序列变化差异, 结合全基因组关联分析
(Genome Wide Association Studies), 可快速鉴定某
一群体内性状与遗传标记或候选基因间的关系。
目前高通量测序结合全基因组关联分析已经成功
应用于玉米(Tian等2011)、水稻(Zhao等2011)、拟
南芥(Atwell等2010)、油菜(Harper等2012; Cock-
rom等2010)、大麦(Li等2014)等重要作物, 大大缩
短了研究周期。
SNP分子标记是检测种质资源遗传多样性和
进行背景选择的有效工具, 与其他类型分子标记
相比, 其具有数量多、全基因组覆盖、可实现高
通量检测和操作周期短等显著优势。研究表明,
SNP标记已经大规模应用于种质资源遗传多样性
的评价及分类、种质筛选、品种认证和分子育种
等多个领域。基于竞争性等位基因特异性PCR (com-
petitive allele specific PCR, KASP)的SNPline基因
分型检测是英国LGC (Laboratory of the Govern-
ment Chemist)有限公司开发的高通量SNP分型技
术, 其具有准确、灵活、低成本、高通量的特点,
目前已经成为国际上SNP分析的主流方法之一。
研究显示有关大白菜抗霜霉病的全基因组关
联分析及相关候选基因发掘的研究暂无报道。本
文对202份大白菜品系组成的关联作图群体进行
SLAF测序, 结合霜霉病表型性状进行GWAS分析,
在白菜A01染色体检测与抗霜霉病性状相关的新
的QTL位点, 并获得了目标区段内抗病相关的候选
基因, 这为克隆抗霜霉病相关基因奠定了基础。
材料与方法
1 实验材料及表型鉴定
选取不同来源的202份大白菜(Brassica rapa
ssp. pekinensis)种质材料组成一个具有广泛代表性
的自然群体(表1)。此自然群体将作为本实验进行
抗霜霉病关联分析研究的材料群体。
每个材料挑选子粒饱满、大小均一的种子 10
粒, 种植于5×10的育苗盘中, 每盘播种5个株系, 每
个株系播种10株。待植株长到两叶一心期进行霜
霉病苗期接种鉴定。抗病鉴定及病害分级标准参
照程永安和柯桂兰(1995)的方法。所用霜霉病病
菌来源参见文献(Yu等2011)。表型鉴定实验分别
于2013年8月、2014年8月及10月进行, 重复3次。
调查的分级标准如下:
0级: 无侵染症状;
1级: 接种叶上有稀疏的褐色斑点, 不扩展;
3级: 叶片有较多的病斑, 多数凹陷, 叶背无霉层;
5级: 叶片病斑向四处扩展, 叶背生少量的霉层;
7级: 病斑扩展面积达叶片的1/2以上2/3以下,
有较多的霉层;
9级: 病斑扩展面积达叶片的2/3以上, 有大量
的霉层。
2 DNA提取及SLAF测序鉴定
每份基因型材料在生长期间混合采集新鲜嫩
叶, 采用改良的CTAB法提取叶片总DNA, 用分光
光度计检测DNA的浓度及纯度, 用0.8%琼脂糖凝
胶电泳检测其质量, 之后将合格的DNA原液调整
到工作液浓度100 ng·μL-1。
SLAF测序: 利用限制性内切酶RsaI对基因
组DNA进行酶切, 从中筛选出300~500 bp长度的
片段构建测序文库 , 采用第二代测序技术对得
到的片段进行高通量测序, 获得大量SLAF标签
序列。
3 数据分析
3.1 SLAF测序结果分析统计
SLAF测序结果显示202个材料总的测序数据
量230 M, 标签长度为80 bp, Q30比例达到86.45%,
平均GC含量为38.72%, 共获得25 811个多态性
SLAF标签(未发表数据)。
3.2 表型数据分析
用Excel表将202份大白菜的发病级别进行初
步统计, 之后按如下公式计算202份大白菜的病情
指数。病情指数(%)=(病情级数×各级株数)/9 (病
情最高级数)×调查总株数×100%
3.3 群体结构分析
应用Structure 2.2软件对202份大白菜进行基
于数学模型的类群划分, 将群体中各材料划分至
对应的亚群。首先设定亚群数K值范围为1~8, 运
用软件对每个K值进行3次模拟运算, 将每次运行
的模拟参数迭代和蒙特卡罗迭代分别设置为10 000
和100 000次循环, 在混合(Q+K)模型下进行运算。
然后依据似然值最大的原则选取一个合适的K值
(Harper等2012)。利用同样的方法, 对各类群的群
体结构进行分析。
只升华等: 利用全基因组关联分析获得白菜A01染色体定位的霜霉病抗病位点和相关分子标记开发 695
表1 自然群体各品系详细信息
Table 1 The details information of nature population
自然群体编号 品系名称 来源地 类型 自然群体编号 品系名称 来源地 类型
1 X1-- 华南 夏 51 X51-DB-PT 广东 夏
2 X2-- 华南 夏 52 Q52-SX-ZT – 秋
3 X3-- 泰国 夏 53 Q53-SX-ZT 北京 秋
4 X4-DB-PT 山东 夏 54 Q54-SX-ZT 北京 秋
5 C5-HB-LY 韩国 春 55 Q55-HB-LY 山东 秋
6 Q6-NB-ZT 天津 秋 56 Q56-HB-LY – 秋
7 Q7-DB-ZT 北京 秋 57 Q57-HB-LY – 秋
8 Q8-HB-LY 山东 秋 58 C58-HB-LY 日本 春
9 Q9-SX-ZT 辽宁 秋 59 C59-HB-LY 日本 春
10 Q10-SX-ZT 山西 秋 60 Q60-DB-ZT 山东 秋
11 Q11-HB-LY 黑龙江 秋 61 Q61-DB-ZT 北京 秋
12 Q12-HB-LY 山东 秋 62 Q62-NB-ZT 河北 秋
13 Q13-NB-ZT 天津 秋 63 X63-DB-PT 东南亚 夏
14 Q14-NB-ZT 天津 秋 64 C64-HB-LY 韩国 春
15 C15-HB-LY 韩国 春 65 C65-HB-LY 韩国 春
16 Q16-HB-LY 山东 秋 66 Q66-SX-ZT 山西 秋
17 X17-DB-PT 日本 夏 67 C67-HB-LY 日本 春
18 Q18-HB-LY 山东 秋 68 C68-HB-LY 日本 春
19 X19-DB-PT 山东 夏 69 Q69-HB-LY 辽宁 秋
20 Q20-SX-ZT 河北 秋 70 X70-DB-PT 日本 夏
21 21NN 河北 秋 71 Q71-HB-LY 北京 秋
22 Q22-DB-PT 广东 秋 72 X72-DB-PT – 夏
23 23-- – 春 73 Q73-DB-PT 山东 秋
24 X24-DB-PT 云南 夏 74 Q74-DB-PT 山东 秋
25 X25-SX-ZT 泰国 夏 75 Q75-SX-ZT 河北 秋
26 X26-SX-ZT 泰国 夏 76 Q76-DB-ZT 北京 秋
27 X27-DB-PT – 夏 77 C77-HB-LY 日本 春
28 X28-DB-PT 湖南 夏 78 Q78-DB-PT – 秋
29 X29-DB-PT 日本 夏 79 Q79-DB-PT – 秋
30 X30-DB-PT 山东 夏 80 Q80-DB-PT 北京 秋
31 X31-SX-ZT 山东 夏 81 C81-HB-LY 日本 春
32 Q32-HB-LY 山东 秋 82 Q82-SX-ZT – 秋
33 Q33-DB-ZT 北京 秋 83 X83-DB-PT 东南亚 夏
34 Q34-DB-ZT – 秋 84 Q84-HB-LY 辽宁 秋
35 Q35-HB-LY 黑龙江 秋 85 Q85-DB-PT 浙江 秋
36 Q36-SX-ZT 北京 秋 86 X86-DB-PT 华南 夏
37 Q37-DB-ZT 北京 秋 87 Q87-DB-PT 河南 秋
38 C38-HB-LY 韩国 春 88 X88-DB-PT 浙江 夏
39 Q39-DB-ZT – 秋 89 C89-HB-LY 韩国 春
40 X40-DB-PT 日本 夏 90 Q90-NB-ZT 天津 秋
41 Q41-DB-ZT 北京 秋 91 Q91-NB-ZT 天津 秋
42 Q42-DB-PT 陕西 秋 92 Q92-NB-ZT 天津 秋
43 Q43-DB-PT 陕西 秋 93 Q93-NB-ZT 天津 秋
44 Q44-HB-LY 黑龙江 秋 134 Q134-HB-LY 山东 秋
45 Q45-DB-PT – 秋 135 Q135-HB-LY 河北 秋
46 Q46-DB-ZT 北京 秋 136 Q136-HB-LY 山东 秋
47 Q47-DB-ZT 北京 秋 137 Q137-HB-LY 山东 秋
48 X48-DB-PT – 夏 138 Q138-HB-LY 山东 秋
49 X49-DB-PT 中国台湾 夏 139 Q139-HB-LY 山东 秋
50 Q50-DB-ZT 北京 秋 140 Q140-HB-LY 山东 秋
植物生理学报696
自然群体编号 品系名称 来源地 类型 自然群体编号 品系名称 来源地 类型
141 Q141-HB-LY 山东 秋 192 Q192-NB-ZT 辽宁 秋
142 Q142-DB-PT 山东 秋 193 Q193-NB-ZT 日本 秋
143 Q143-HB-LY 山东 秋 194 Q194-NB-ZT 日本 秋
144 Q144-HB-LY 山东 秋 195 Q195-NB-ZT 天津 秋
145 Q145-HB-LY 山东 秋 196 Q196-NB-ZT 天津 秋
146 Q146-HB-LY 山东 秋 197 Q197-NB-ZT 天津 秋
147 Q147-HB-LY 山东 秋 198 Q198-NB-ZT 陕西 秋
148 Q148-HB-LY 山东 秋 199 199NN 江苏 秋
149 Q149-HB-LY 山东 秋 200 Q200-NB-ZT 山西 秋
150 Q150-HB-LY 山东 秋 201 Q201-NB-ZT 山西 秋
151 Q151-DB-PT 山东 秋 202 Q202-SX-ZT 吉林 秋
152 Q152-HB-LY 韩国 秋 203 Q203-SX-ZT 吉林 秋
153 Q153-HB-LY 韩国 秋 204 C204-HB-LY 韩国 春
154 Q154-HB-LY 山东 秋 205 C205-HB-LY 韩国 春
155 Q155-DB-PT 山东 秋 206 C206-HB-LY 韩国 春
156 Q156-DB-PT 山东 秋 207 C207-HB-LY 韩国 春
157 Q157-HB-LY 山东 秋 208 C208-HB-LY 韩国 春
158 Q158-NB-ZT 内蒙 秋 209 C209-HB-LY 韩国 春
159 Q159-DB-PT – 秋 210 C210-HB-LY 韩国 春
160 Q160-HB-LY 韩国 秋 211 C211-HB-LY 韩国 春
161 Q161-HB-LY 韩国 秋 212 C212-HB-LY 韩国 春
162 Q162-HB-LY 山东 秋 213 C213-HB-LY 韩国 春
163 Q163-HB-LY 山东 秋 214 C214-HB-LY 韩国 春
164 Q164-HB-LY 山东 秋 215 C215-HB-LY 俄罗斯 春
165 Q165-DB-PT 山东 秋 216 C216-HB-LY 韩国 春
166 Q166-HB-LY 山东 秋 217 C217-HB-LY 韩国 春
167 Q167-HB-LY 山东 秋 218 C218-HB-LY 韩国 春
168 Q168-HB-LY 山东 秋 219 C219-HB-LY 韩国 春
169 Q169-HB-LY 山东 秋 220 C220-HB-LY 韩国 春
170 Q170-NB-4 云南 秋 221 C221-NB-ZT 天津 春
171 Q171-HB-LY 山东 秋 222 X222-DB-PT 华南 夏
172 Q172-DB-PT 河南 秋 223 X223-DB-PT 华南 夏
173 Q173-DB-PT 山西 秋 224 X224-DB-PT 山东 夏
174 Q174-DB-PT 新疆 秋 225 X225-DB-PT – 夏
175 Q175-DB-PT 山东 秋 226 X226-DB-PT 山东 夏
176 Q176-DB-PT 山东 秋 227 X227-DB-PT 四川 夏
177 Q177-DB-PT 福建 秋 228 X228-SX-ZT 台湾 夏
178 Q178-DB-PT 福建 秋 229 X229-DB-PT 华南 夏
179 Q179-DB-PT 山西 秋 230 X230-DB-PT 泰国 夏
180 Q180-DB-PT 河南 秋 231 X231-DB-PT 云南 夏
181 Q181-DB-PT 河南 秋 232 X232-DB-PT 云南 夏
182 Q182-DB-ZT 北京 秋 233 X233-DB-PT 华南 夏
183 Q183-DB-ZT 北京 秋 234 X234-DB-PT 华南 夏
184 Q184-DB-ZT 北京 秋 235 X235-DB-PT 华南 夏
185 Q185-DB-ZT 北京 秋 236 X236-- 南方 夏
186 Q186-DB-ZT 北京 秋 237 X237-DB-PT 华南 夏
187 Q187-DB-ZT 北京 秋 238 X238-DB-PT 华南 夏
188 Q188-DB-ZT 北京 秋 298 298-DB-PT 山东 夏
189 Q189-DB-ZT 北京 秋 299 299-HB-LY 韩国 春
190 Q190-DB-PT 山东 秋 300 300-HB-LY 韩国 春
191 Q191-NB-ZT 辽宁 秋 301 301-HB-LY 韩国 春
　　C: 春; Q: 秋; X: 夏; DB: 叠抱; HB: 合抱; NB: 拧抱; SX: 舒心; PT: 平头; LY: 卵圆; ZT: 直筒; NN: 不确定。
表1 (续)
只升华等: 利用全基因组关联分析获得白菜A01染色体定位的霜霉病抗病位点和相关分子标记开发 697
3.4 连锁不平衡的衰减
釆用TASSEL 2.1软件估算群体内连锁不平衡
(LD)在大白菜A基因组中的衰减。研究时按照标
记在染色体上的物理距离, 将标记划分到不同的
区间, 通过r2来估计两两标记间的LD水平。本研
究的区间设计为0~10 kb、10~20 kb、20~30 kb、
30~40 kb、40~50 kb、50~60 kb, 以此类推到
590~600 kb, >600 kb, 计算每个区间内所有值的平
均值, 将平均值作为此区间的LD值。这样的处理
大大降低了因单个特殊的r2值对整个LD产生的影
响。根据前人的研究, 在分析大白菜连锁不平衡
时, r2的阈值一般选择0.2。
3.5 关联分析
应用TASSEL 2.1软件的MLM程序, 以各Q+K
值作为协变量进行群体矫正, 进行SLAF标记与抗
霜霉病性状的关联分析。通过置换分析运算1 000
次来确定SLAF标记与抗霜霉病性状关联是否显著
的阈值。
3.6 KASP分析
利用A01: 24605323~24705323区间内的一个
SNP位点(A01_24655270)开发出适用于KASP基因
分型技术的SNP分子标记, 利用该标记对202个材
料进行该位点的基因分型, 并与霜霉病表型数据
进行关联分析。KASP的具体操作方法参见文献
Rachit等(2014)。引物委托英国政府化学家实验室
LGC (Laboratory of the Government Chemist)有限
公司合成, 序列如下:
A01_24655270FF: 5′-GAAGGTGACCAAG-
TTCATGCTTGGAATAAAATTTCACCAAGAT-
CAGGTAAT-3′; A01_24655270FV: 5′-GAAGGTC-
GGAGTCAACGGATTTGGAATAAAATTTCAC-
CAAGATCAGGTAAA-3′ ; A01_24655270R:
5′-GTTGGCTCAAATATGTGGACTTAACGTT-3′。
实验结果
1 用于全基因组关联分析的SLAF标签的获得
对测序获得的序列信息进行严格的筛选, 获得高
质量测序数据。利用BLAT (–tileSize=10, –stepSize=
5)工具进行SLAF标签筛选: (1)每个SLAF标签与参
考基因组相似程度在95%以上, (2) SLAF标签在亲本
间至少含有6个多态性SNP分子标记, (3)测序深度
10×以上, (4)染色体均匀分布。最终获得可用于全
基因组关联分析的960个SLAF标签。
2 大白菜对霜霉病抗性的表型统计分析
对由202份材料构成的关联群体的病情指数
分析表明, 该群体对霜霉病的抗性表现出广泛的
表型变异, 高抗(0~11.11)的有7株, 抗病(11.12~
33.33)的有14株, 耐病(33.34~55.55)的有55株, 感病
(55.56~77.77)的有90株, 高感(77.78~100)的为30株,
其中有6株病情指数未确定。通过数据分析, 发现
该关联群体的病情指数基本符合正态分布(图1)。
3 大白菜群体结构分析
利用Structure 2.2软件对大白菜群体结构进行
分析, 根据软件的输出结果, 结合分析后验概率
LnP (D)值的方差以及变化速率, 发现当K为2时,
模型中显示∆K有最大变化(图2), 因此将202份大白
菜材料分为2个大类群, 其中152份大白菜品系归
属于第一大类, 50份大白菜品系归属于第二大类。
如图3所示, 共将202份大白菜分为3个小亚群: 亚
群1主要由秋季大白菜组成; 亚群2主要由春季大
白菜为主; 亚群3主要由夏季大白菜为主。
4 连锁不平衡在A基因组中的衰减分析
利用覆盖全基因组的960个SLAF标记 , 在
TASSEL2.1软件下计算两标记间的r2值来估算连
锁不平衡在该自然群体中大白菜A基因组中的衰
减情况。从图4中可以看出, 该群体A基因组的LD
(r2值)随着遗传距离的增加而下降。当r2的阈值定
在0.2时, 该群体A基因组的衰减距离约为50 kb。
图1 202份大白菜关联群体的霜霉病病情指数频次分布
Fig.1 Distribution of downy mildew disease index (DI)
among 202 Chinese cabbage accessions
植物生理学报698
5 SLAF标记与大白菜抗霜霉病性状的关联分析
采用 TASSEL 2.1 软件的MLM程序, 对202份
大白菜品系进行960个SLAF标记与抗霜霉病性状
的全基因组关联分析。置换分析得到值为5.53×
10-4, 所以本文以P≤5.53×10-4作为判定标记与霜霉
病性状之间是否显著相关的标准。如图5所示, 在
A01染色体上检测到一个与霜霉病抗性显著相关
的SLAF位点: SLAFMarkerA0124655323。
6 利用KASP技术验证202份材料的基因型和抗感
病之间的关系
为了进一步验证检测到的关联位点SLAF-
MarkerA0124655323的准确性, 我们将SLAFMar-
kerA0124655323中的SNP位点(A0124655323)发展
成KASP分子标记, 并在202份材料中进行验证, 为
图2 202份大白菜总群体的∆K值
Fig.2 Estimation of ∆K value in 202 Chinese cabbage
natural population
图3 202份大白菜品系系统发育树
Fig.3 Phylogenetic tree of 202 Chinese cabbage natural population
只升华等: 利用全基因组关联分析获得白菜A01染色体定位的霜霉病抗病位点和相关分子标记开发 699
图5 霜霉病的GWAS分析
Fig.5 GWAS of downy mildew resistance in Chinese cabbage
population
A和B分别为Q+K模型下的Manhattan图和分位数图。
表2 SNP标记在202份材料中的验证结果
Table 2 The assay results of SNP marker from 202 Chinese cabbage
亚群名称 基因型AA数 基因型AG数 表型为感病的材料数 感病材料中基因型为AA/AG数 材料总数 准确率/%
1 107 1 80 69 123 86.3
2 44 0 21 21 45 100.0
3 22 1 19 16 28 84.2
图6 利用KASP分型技术对A0124655323位点进行基因分型
Fig.6 SNP assay of A0124655323 using the KASP
genotyping system
该图由SNP分型软件分析导出, 每一点分别代表自然群体中
的一个个体。
保证结果的准确性, 在计算结果时, 我们将中间表
型的耐病材料删除, 将表型为高感和感病的材料
定义为感病, 结果如表2所示。
7 候选基因分析
本试验所用关联群体平均LD衰减距离为50
kb, 取显著关联的SLAFMarkerA0124655323标记左
右两翼最近的标记之间的距离, 即A01: 24573724~
24755150区域在http://brassicadb.org/brad/index.
php上进行基因扫描。该区域所包含的可能与抗
病相关的基因如表3所示。其中Bra034161、Bra-
034163、Bra034164是蛋白激酶受体类, Bra034158、
Bra034159、Bra034165、Bra034173是转录因子
类, Bra034152为锌指蛋白, 这三类都是已经报道过
的与胁迫相关的基因。因此猜测, 这些基因与大
白菜抗霜霉病相关。
图4 连锁不平衡在202份大白菜自交系组成的自然群体中
的衰减情况
Fig.4 Genome-wide linkage disequilibrium decay estimated
from 202 Chinese cabbage accessions
植物生理学报700
讨　　论
目前, GWAS已应用于水稻(Huang等2010)、
玉米(Wilson等2004)等农作物及模式植物拟南芥
(Bakker等2006)主要性状位点的鉴定与挖掘。而
大白菜全基因组关联分析方面的研究主要集中在
抽薹开花时间方面, 如高颖等(2012)利用大白菜自
然群体和SSR、InDel标记对抽薹开花时间进行了
全基因组关联分析, 有13个标记的17个等位基因
位点与抽薹时间和开花时间2个性状在P<0.01水平
显著相关 , 分别位于A01、A02、A03、A06、
A07、A08和A10连锁群上。而在对大白菜抗霜霉
病全基因组关联分析方面的报道较少, 本研究利
用SLAF标记与自然群体构建的关联图谱, 分子标
记密度较高, 自然群体遗传背景差异较大, 提高了
关联结果的精度。
Yu等(2009, 2011)研究发现大白菜苗期霜霉病
抗性具有数量性状的遗传特征, 存在一对显性主
效基因, 并在一张高密度遗传图谱上定位了一个
控制霜霉病苗期抗性的主效QTL——BraDM, 并
将其定位于A8染色体上, 并在BraDM区间开发了
SCAR标记SCK14-825与SSR标记kbrb058m10-1和
kbrb-006c05-2。与上述研究结果不同, Kim等(2011)
利用成株期大白菜将控制霜霉病抗性的位点
BrRHP1定位在A1染色体上InDel标记KBrB089-
M05和KBrB078A03之间, 将2个标记的序列在
http://brassicadb.org/brad/blastPage.php上比对发现,
BrRHP1位于A01染色体22909654~26019056区间
表3 目标区域候选基因
Table 3 Candidate genes in A01: 24573724–24755150
大白菜基因 对应拟南芥同源基因 功能分类 物理位置
Bra034152 AT3G10910 锌指蛋白 A01: 24734421~24734972
Bra034157 AT3G10985 SAG类基因 A01: 24702424~24702738
Bra034158 AT3G11000 转录因子类 A01: 24692877~24694555
Bra034159 AT3G11020 转录因子类 A01: 24691112~24691984
Bra034161 AT3G05650 AtRLP32蛋白激酶受体类 A01: 24681535~24684102
Bra034163 AT3G11080 AtRLP35蛋白激酶受体类 A01: 24670759~24672519
Bra034164 AT3G11080 AtRLP35蛋白激酶受体类 A01: 24660591~24668969
Bra034165 AT3G11100 转录因子类 A01: 24657880~24658710
Bra034166 AT3G11130 网络重链蛋白 A01: 24648808~24657031
Bra034169 AT3G11200 参与组蛋白的甲基化 A01: 24631609~24633597
Bra034173 AT3G11280 MYB家族转录因子类 A01: 24615275~24616210
Bra034176 AT3G11400 真核翻译起始因子 A01: 24603257~24603700
Bra034177 AT3G11400 真核翻译起始因子 A01: 24601868~24602404
内。本研究利用960个SLAF标记, 通过抗霜霉病的
病情指数数据与SLAF标记分子数据进行关联分
析 , 在A01染色体上发现了一个关联位点 , 即 :
SLAFMarkerA0124655323。将该关联位点定位到
A01染色体24573724~24755150的区间内。发现本
文所验证的SNP位点和定位的区间均位于Kim等
(2011)定位的区间内, 这增加了本文的结果的可靠
性。结合LD衰减值, 本文将Kim等(2011)定位的区
间进一步缩小, 为精细定位A01染色体上与大白菜
抗霜霉病相关的基因做出了贡献。
本研究在定位的A01染色体上24573724~
24755150的区间内初步筛选得到与抗病相关的基
因13个: 其中Bra034152为锌指蛋白, 锌指蛋白以
Zn2+为核心, 通过与半胱氨酸和组氨酸残基结合组
成可自我折叠并相对独立的“手指”状四面体结
构。该结构使大多数锌指蛋白具有E3连接酶功能,
从而参与一些降解蛋白质的特定泛素化过程(Ma
等2009), 故锌指蛋白通过单泛素化途径和多聚泛
素化途径而广泛参与植物生理生化进程, 如植物
与病原菌互作(Zeng等2006)、植物病害防御(Liu等
2008)等过程。由此猜测Bra034152可能与植物抗
病相关。Bra034161、Bra034163、Bra034164是
蛋白激酶受体类, 它们典型的结构特点是在N末端
富含亮氨酸重复结构, 在信号传到和防御反应等
过程中发挥重要作用。Bra034158、Bra034159、
Bra034165、Bra034173是转录因子类, 其中Bra0-
34158参与植物生长发育的多个阶段, 其在拟南芥
只升华等: 利用全基因组关联分析获得白菜A01染色体定位的霜霉病抗病位点和相关分子标记开发 701
中的同源基因AT3G11000转录过程受植物花器官
同源基因AGAMOUS的调控 , 而有报道称AGA-
MOUS与植物抗性有关; Bra034173是MYB家族转
录因子, 其在调控植物生长发育、响应逆境胁迫
等方面发挥重要作用, 如它可增强植物在盐胁迫
中的抗性(陈娜等2015)。以上两类基因都是已经
报道过的与胁迫相关的基因。Bra034166是网络
重链蛋白, 其在拟南芥中的同源基因AT3G11130的
表达受水杨酸诱导, 水杨酸是植物体内普遍存在
的一种小分子酚类物质, 作为一种内源信号分子,
具有多种生理调节作用, 如改变膜通透性, 影响离
子吸收, 增强植物抗病性, 诱导气孔关闭等(徐萍等
2014)。Bra034157在拟南芥中的同源基因AT3G-
10985的表达受真菌的诱导。Bra034169参与组蛋
白的甲基化, 其在拟南芥中的同源基因AT3G11200
的表达与病毒胁迫响应因子有关。这些信息可为
抗霜霉病基因的克隆奠定一定的基础。但这13个
基因是否确实是抗霜霉病相关基因, 还需要精细
定位、基因克隆等更进一步的遗传分析实验。
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植物生理学报702
Genetic characteristics of A01-located resistant loci to downy mildew in Chinese
cabbage by genome-wide association studies
ZHI Sheng-Hua1,2, SU Tong-Bing2, YU Shuan-Cang2, ZHANG Feng-Lan2, YU Yang-Jun2, ZHANG De-Shuang2, ZHAO Xiu-Yun2,
WANG Wei-Hong2, LU Gui-Xiang2, ZHU Yue-Lin1,*
1College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2Beijing Vegetable Research Center, Beijing
Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing 100097, China
Abstract: A total of 202 Chinese cabbage (Brassica rapa ssp. pekinensis) inbred lines were used for downy
mildew (DM) resistance analysis. Lines were genotyped by Specific Locus Amplified Fragment Sequencing
(SLAF) markers detected by the SLAF-Seq approach, and finally 960 markers were identified and selected for
Genome Wide Association Studies (GWAS). Our major results were as follows: (1) A single SLAF locus,
SLAFMarkerA0124655323, on chromosome A01 were significantly associated with downy mildew resistance;
(2) Based on the two nearest SLAF markers that flanking both sides of SLAFMarkerA0124655323, the candi-
date physical interval was limited to A01: 24573724~24755150; (3) A single nucleotide polymorphism (SNP)
was converted into KASP system applicable marker, and the accuracy of selection in the each subgroup of nat-
ural population was above 80%; (4) A total of 13 genes was annotated as candidate disease-related genes. The
newfound disease resistance loci and SNP marker will be useful in Chinese cabbage (B. rapa) breeding for im-
proving resistance to downy mildew (DM).
Key words: Chinese cabbage; downy mildew; Genome-Wide Association Studies; Specific Locus Amplified
Fragment Sequencing; competitive allele specific PCR
Received 2016-01-27 Accepted 2016-04-22
This work was supported by the National Natural Science Foundation for Distinguished Young Scholars of China (Grant No. 31401875).
*Corresponding author (E-mail: ylzhu@njau.edu.cn).
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