全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (10): 1735~1742　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0268 1735
收稿 2015-05-19　　修定 2015-09-09
资助 国家自然科学基金(31270651和31200514)和中国热带
农业科学院橡胶研究所基本科研业务费专项(163002 -
2015003)。
* 共同通讯作者(E-mail: zhxia-111@163.com; dragonldj@163.
com; Tel: 0898-23301174)。
巴西橡胶树TIM23-1基因克隆、进化及表达分析
陈江淑1,2, 邓治2, 刘辉2, 范玉龙1, 姜达1, 夏立琼1, 夏志辉1,*, 李德军2,*
1海南大学农学院, 海口570228; 2中国热带农业科学院橡胶研究所, 农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室, 海南
儋州571737
摘要: 本研究采用RACE技术, 从巴西橡胶树中鉴定出一个线粒体内膜转位因子TIM23基因。该基因全长cDNA为898 bp, 最
长开放阅读框567 bp, 预测编码蛋白包含188个氨基酸; 序列比对分析发现, 该基因编码蛋白具有转膜区和PRAT结构域, 与
拟南芥TIM23-1蛋白具有较高的相似性, 将该基因命名为HbTIM23-1。实时定量RT-PCR分析结果表明, HbTIM23-1在巴西
橡胶树胶乳、叶片、树皮、雄花、雌花、花药中均有表达。在橡胶树叶片不同发育时期, HbTIM23-1表达存在变化。与健
康橡胶树相比, 死皮橡胶树胶乳中HbTIM23-1表达量明显下降。研究发现HbTIM23-1表达受干旱和低温处理调控, 表明Hb-
TIM23-1可能在巴西橡胶树干旱和低温胁迫应答及死皮中发挥作用。
关键词: 巴西橡胶树; 线粒体内膜转位因子23; 死皮; 基因克隆; 表达分析
Cloning, Phylogenetic and Expression Analyses of TIM23-1 Gene in Hevea
brasiliensis
CHEN Jiang-Shu1,2, DENG Zhi2, LIU Hui2, FAN Yu-Long1, JIANG Da1, XIA Li-Qiong1, XIA Zhi-Hui1,*, LI De-Jun2,*
1College of Agriculture, Hainan University, Haikou 570228, China; 2Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber
Tree, Ministry of Agriculture, Rubber Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Danzhou, Hainan
571737, China
Abstract: In this study, a full-length cDNA sequence of TIM23 gene was cloned from Hevea brasiliensis with
the rapid-amplification of cDNA ends (RACE) method, and the gene was named as HbTIM23-1. The full length
cDNA of HbTIM23-1 is 898 bp in size with a 567 bp open reading frame, encoding a deduced polypeptide of
188 amino acids. The deduced HbTIM23-1 contains a predicted transmembrane region and preprotein and ami-
no acid transporter (PRAT) domain and indicates high identity to AtTIM23-1 protein. Real-time RT-PCR anal-
yses indicated that HbTIM23-1 was expressed in latex, barks, leaves, barks, male flowers, female flowers and
anthers. With the development of leaves, the HbTIM23-1 expression showed a significant change. Compared
with healthy rubber tree, HbTIM23-1 was down-regulated in tapping panel dryness (TPD) rubber tree latex. The
expression of HbTIM23-1 was regulated by drought and low temperature treatments, suggesting that Hb-
TIM23-1 might play important roles in drought and low temperature responses as well as TPD in H. brasiliensis.
Key words: Hevea brasiliensis; TIM23; tapping panel dryness; gene cloning; expression analysis
线粒体在细胞的生命活动中发挥着重要作用,
它不仅是细胞内氧化磷酸化和三磷酸腺苷(ATP)合
成的主要场所, 为细胞活动提供能量, 还参与细胞
代谢的调节、细胞周期的调控、细胞发育、抗病
毒和细胞凋亡等重要的生命活动(Schatz 2007)。
线粒体中含有约1 000种蛋白质, 但其蛋白合成能
力有限, 约有99%的蛋白由细胞核DNA编码, 这些
蛋白质在细胞质核糖体上合成, 再运到线粒体的
内膜、外膜、基质或膜间隙中(Bauer等2000; Pfan-
ner和Geissler 2001)。该生物学过程由众多分子机
器组成的线粒体蛋白质转运系统参与并完成。
近年来的研究表明, 在线粒体外膜和内膜上
均存在着一系列与蛋白质运转有关的膜蛋白质复
合体, 这些复合体通常被称为转位因子(transloca-
tor, 或translocase)。这些转位因子主要包括: 线粒
体外膜上的TOM (translocases of outer mitochondri-
al membrane)复合体和SAM (sorting and assembly
machinery)复合体及内膜上的TIM23 (translocases
植物生理学报1736
of inner mitochondrial membrane)复合体和TIM22
复合体(Pfanner等2004)。在细胞质中, 由核DNA合
成的线粒体蛋白质由线粒体膜上的转位因子介导,
并通过它们形成的膜孔进入线粒体。
TIM23复合物是线粒体内膜主要的转运与装
配复合物。在行使功能的过程中, TIM23复合物可
以游离态和与PAM复合物的结合态(TIM23-PAM
复合物)两种形式存在, 上述两种不同状态代表其
参与前体蛋白的不同转运途径(Popov-Celeketi等
2008; Mokranjac和Neupert 2010)。TIM23复合物主
要由TIM23、TIM50、TIM17和TIM21四个亚基组
成, 与其他3个亚基相比, TIM21是TIM复合物行使
功能非必需的。TIM23形成TIM23复合物的跨膜
通道, 其N末端为暴露在膜间隙的一段亲水结构
域, 在特定条件下可与外膜相互作用, 并对TIM23
的二聚化和底物结合起重要作用 (Trusco t t等
2001)。虽然TIM17和TIM23同源, 但TIM17的N末
端只有一段很短的片段暴露在膜间隙中, TIM23和
TIM17组成TIM23复合物整合跨膜中心, 该跨膜中
心在TIM23复合物孔道开放中发挥着重要作用
(Meier等2005)。TIM50可通过其N末端跨膜片段
锚定于内膜上, 在膜间隙侧含有一个较大的结构
域。当前体蛋白出现在膜间隙侧后, 前体蛋白便
同该结构域结合并被转移至TIM23复合物的跨膜
通道中(Mokranjac等2003, 2009)。当前体蛋白穿过
TIM23复合物的跨膜通道后, 由运输驱动蛋白PAM
复合物负责完成其向基质转运的过程。此时, 与
PAM复合物结合的TIM23复合物组分中不存在
TIM21 (Popov-Celeketi等2008)。
在酵母中 , 遗传学的方法被用于分析两个
TIM复合物的特性(Rehling等2001)。最先被鉴定
的TIM17:23复合物负责切开目标氨基酸延伸蛋白
的输入, TIM22负责将线粒体的代谢物运输蛋白,
如ADP/ATP和磷酸的转运蛋白插入内膜(Rehling
等2001)。被线粒体目标信号激活后, TIM23和
TIM22复合物在内膜形成电压敏感通道(Truscott等
2001; Kovermann等2002)。TIM17、TIM23和
TIM22都包含4个跨膜区及C和N端, 对人TIM17:23
复合物结构和遗传特性研究结果表明该转位因子
在真核生物中高度保守(Rassow等1999)。多种生
物中的TIM22和与之相关的小TIM蛋白(TIM8、
9、10和13)序列也高度保守(Bauer等1999)。
对植物蛋白输入过程的研究已有十年之久,
但对各种输入成分作用及鉴定的研究进展仅处于
初级阶段。番茄TIM9和TIM10是载体蛋白进入内
膜所必须的(Lister等2002)。拟南芥有17个基因编
码前蛋白和氨基酸转运体(PRAT)蛋白(Rassow等
1999), 其中10个蛋白定位于线粒体, 6个定位于质
体 , 1个蛋白属线粒体和质体双定位(Murcha等
2007)。定位于线粒体的蛋白进化分析显示编码
TIM17、TIM23和TIM22未知功能蛋白个数分别
为3、3和2 (Murcha等2003)。拟南芥的3个TIM23
基因有2个位于第1染色体 , 即AtTIM23-1和At-
TIM23-2, 另一个位于第3染色体, AtTIM23-3, 3个预
测蛋白的相似性为35% (Murcha等2003)。与酵母
TIM23相比, 3个拟南芥TIM23都缺少前34个氨基
酸; 3个拟南芥TIM23的基因均有表达, 且在不同组
织和发育时期存在差异。互补实验表明: 当前蛋
白和转运子结构域存在时, 拟南芥TIM23基因可互
补酵母TIM23基因删除突变体。拟南芥TIM17和
TIM23输入实验显示两者都包含与线粒体内膜结
合的内部信号(Murcha等2003)。拟南芥NADH脱
氢酶B 1 4 . 7和T I M 2 3 - 2参与呼吸复合体 I和
TIM17:23, NADH脱氢酶B14.7缺失表型致死, 而
AtTIM23-2表现为非致死。过表达AtTIM23-2植株
呈现严重延迟生长, 显示AtTIM23-2多少与呼吸复
合体负相关(Wang等2012)。
天然橡胶同钢铁、石油和煤炭并称为四大工
业原料, 是关系国计民生的基础产业和重要战略
物资。世界上有2 000多种产胶植物, 巴西橡胶树
(简称橡胶树)具有产胶量高、品质好、经济寿命
长、采胶方便和生产成本低等优点, 成为唯一一
种人工栽培的重要产胶植物, 由其生产的天然橡
胶占世界天然橡胶总产量的90%以上。我国属非
传统植胶区, 橡胶树生长周期内经常遭受低温、
台风、季节性干旱等逆境条件, 使橡胶树胶乳产
量和生长受到影响。除上述逆境外, 死皮也是我
国天然橡胶生产的主要限制性因子, 致使胶乳产
量下降。为了探讨TIM23基因在巴西橡胶树低
温、干旱和死皮中的作用, 我们利用cDNA末端快
速扩增(rapid-amplification of cDNA ends, RACE)技
术, 从橡胶树中鉴定到一个HbTIM23-1基因, 并分
陈江淑等: 巴西橡胶树TIM23-1基因克隆、进化及表达分析 1737
析该基因在不同组织、叶片不同发育时期、死皮
和健康橡胶树胶乳、干旱和低温处理条件下的表
达模式及TIM23-1进化关系, 以期为进一步揭示
HbTIM23-1在橡胶树中功能奠定基础。
材料与方法
1 植物材料与不同处理
橡胶树(Hevea brasiliensis Muell. Arg.)品系热
研7-33-97由中国热带农业科学院橡胶研究所自主
培育, 于1990年定植于中国热带农业科学院试验
场五队, 采用S/2 d/4 (1/2螺旋割线, 每4 d割一刀)加
1.5%乙烯利刺激割制采集胶乳。不同组织、叶片
不同发育时期及健康和死皮橡胶树胶乳均取自该
材料, 选用割面2 cm至1/4割线长度不排胶的橡胶
树为死皮树材料。
克隆载体pMD18-T、DNase I、PyrobestTM
DNA聚合酶、qPCR试剂、DNA Markers购自大连
宝生物公司, 2×Taq PCR Master Mix聚合酶购自
北京天根公司, RevertAidTM First Strand cDNA
Synthesis Kit购自Fermentas公司, SMARTTM RACE
cDNA Amplification Kit 购自Clontech公司。Esche-
richia coli DH5α为本课题组保存, 引物合成和测序
均委托上海生工生物工程技术服务有限公司完
成。
干旱和低温处理选用橡胶树品系热研7-33-97
组培苗, 将组培苗根部培养基洗净放入清水中, 在
湿度80%, 温度30 ℃ , 12 h光照(光照强度480
µmol·m-2·s-1), 12 h黑暗培养3 d后进行低温(8 ℃)处
理, 具体参照安泽伟等(2010)方法进行; 干旱处理
参照Zhang等(2012)方法进行, 采用16%的PEG8000
模拟干旱条件, 以不作任何处理的组培苗为对照,
分别采集处理后0、3、24和48 h叶片。
2 总RNA提取及cDNA第一链合成
参照Tang等(2007)和Kiefer等(2000)的方法提
取橡胶树树皮、胶乳、叶片、花等组织总RNA,
利用DNase I (大连宝生物公司)去除RNA中残留的
少量DNA后, 对总RNA进行定量和电泳检测。样
品cDNA第一链合成按照RevertAidTM First Strand
cDNA Synthesis Kit (Fermentas)说明书提供的方法
进行。
3 HbTIM23-1全长cDNA克隆、序列及进化分析
根据橡胶树TIM23-1基因部分片段设计5和3
RACE特异性引物(表1), 之后按照SMARTTM RACE
cDNA Amplification Kit (Clontech)说明书进行5 和
3 RACE操作。5 RACE两轮扩增程序为94 ℃预变
性5 min; 94 ℃变性30 s, 72 ℃延伸2 min, 5个循环;
94 ℃变性30 s, 70 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1.5 min, 5
个循环; 之后是94 ℃变性30 s, 68 ℃退火30 s, 72
℃延伸1 min, 25个循环; 72 ℃延伸7 min。3 RACE
第1轮扩增条件为94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性30
s, 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 25个循环; 72 ℃
延伸7 min。用3 RACE第一轮扩增稀释产物为模
板进行第二轮PCR扩增, 扩增程序同第一轮, 扩增
产物经胶回收后连接到pMD18-T载体, 挑取阳性
克隆经PCR和酶切验证后送上海生工生物工程技
术服务有限公司测序。
表1 HbTIM23-1基因克隆和表达分析所用引物序列
Table 1 The primers used in gene cloning and expression analyses of HbTIM23-1
引物名称 引物序列(5→3) 用途
HbTIM23-1-5R1 CAGTTTCAACGTATCGGTGG 5 RACE
HbTIM23-1-5R2 GAGATTCTTCGGTGAAGAGG
HbTIM23-1-3R1 CCTCTTCACCGAAGAATCTC 3 RACE
HbTIM23-1-3R2 CCACCGATACGTTGAAACTG
HbTIM23-1F GCAAAAAAAAACTCTTAAGGCTC 验证cDNA全长
HbTIM23-1R ACAAGTTGAAAATTTTTCATCAGG
Hb18SF GCTCGAAGACGATCAGATACC 扩增内参
Hb18SR TTCAGCCTTGCGACCATAC
HbTIM23-1-RTF GGTGAATAGGATTCTCAACTC 检测HbTIM23-1表达水平
HbTIM23-1-RTR CTATCCGTAACTGCCACAAC

植物生理学报1738
根据获得的HbTIM23-1序列设计正反向引物
HbTIM23-1F和HbTIM23-1R (表1), 用PyrobestTM
DNA酶进行PCR扩增以验证HbTIM23-1全长序
列。扩增程序为94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性30 s,
58 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 35个循环; 72 ℃延
伸7 min。回收扩增产物后连接pMD18-T载体, 挑
取阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公
司测序。
利用NCBI的ORF finder查找HbTIM23-1最长
开放阅读框。通过BLAST进行序列比对分析, 选
择与HbTIM23-1同源的其他物种PRAT家族氨基酸
序列, 分别用ClustalX 2和MEGA 6.06软件对PRAT
家族蛋白进行序列多重比对和进化树分析。
4 HbTIM23-1表达模式分析
采用罗氏公司的LightCycler2.0实时荧光定量
RT-PCR系统分析HbTIM23-1基因表达模式。取不
同样品逆转录合成cDNA第一链, 稀释5倍后为实
时定量分析模板, 反应体系为20 μL, 包括2 μL模
板、10 μL 2×SYBR Premix、10 μmol·L-1的上游和
下游荧光定量特异引物各0.3 μL (终浓度为0.15
μmol·L-1)。PCR反应程序如下: 94 ℃预变性30 s;
94 ℃变性5 s, 58 ℃退火30 s, 72 ℃延伸20 s, 45个
循环; 72 ℃延伸7 min。以橡胶树18S rRNA基因作
为内参基因, 序列见表1。每个样品设3个重复, 利
用LightCycler 4.05自动进行基线和Cp值分析, 计算
HbTIM23-1基因的相对表达量。
实验结果
1 HbTIM23-1克隆及序列分析
在分析橡胶树转录组测序数据时, 我们发现
一条与拟南芥TIM23-1基因高度相似的序列。根
据该序列设计RACE特异引物, 利用RACE、PCR
和测序技术获得该基因5端和3端序列, 拼接该基
因已知序列、5端和3端序列得到该基因全长
cDNA为898 bp, 该基因5和3非编码区分别长68和
263 bp, 最长开放阅读框567 bp, 预测编码蛋白包含
188个氨基酸残基(图1)。该基因预测编码蛋白与
拟南芥TIM23-1、TIM23-2和TIM23-3一致性分别
为74%、72%和51%, 因此, 将从巴西橡胶树中得
到的基因命名为HbTIM23-1。
图1 HbTIM23-1核酸及推导的氨基酸序列
Fig.1 The nucleotide acid and deduced amino acid sequences of HbTIM23-1
小写字母表示非翻译区, 星号表示终止密码子。
2 多序列比对及系统发生分析
分析拟南芥TIM23蛋白发现, AtTIM23与At-
TIM22和AtTIM17属前蛋白和氨基酸转运体
(PRAT)家族 , 我们对橡胶树TIM23-1、3个At-
TIM23、2个AtTIM22、3个AtTIM17及酵母
TIM17、TIM22和TIM23进行序列比对, 结果显示,
前蛋白和氨基酸转运体家族都含有预测转膜区域
和PRAT结构域, 与其他区段相比, PRAT结构域保
守性相对较高(图2)。在序列比对基础上, 对上述
蛋白进行进化分析 , 结果表明 , 尽管TIM17、
TIM22和TIM23同属于PRAT蛋白家族, 3类蛋白明
显分为TIM17、TIM22和TIM23 3个分支。Hb-
陈江淑等: 巴西橡胶树TIM23-1基因克隆、进化及表达分析 1739
TIM23-1同拟南芥和酵母的TIM23为一个分支，
且与拟南芥3个TIM23蛋白中AtTIM23-1和At-
TIM23-2的亲缘关系较近(图3)。
3 HbTIM23-1在不同组织及死皮和叶片不同发育
时期的表达分析
以Hb18S rRNA为内参, 利用实时定量RT-PCR
图2 HbTIM23-1与其他PRAT蛋白序列比对
Fig.2 Amino acid alignment of HbTIM23-1 with other PRAT proteins
灰色背景为预测转膜区域, 双下划线部分为PRAT结构域。AtTIM23-1: NP_564028 (拟南芥); AtTIM23-2: NP_177419 (拟南芥); At-
TIM23-3: NP_187131 (拟南芥); AtTIM17-1: NP_173460 (拟南芥); AtTIM17-2: NP_181277 (拟南芥); AtTIM17-3: NP_196730 (拟南芥);
AtTIM22-1: NP_173268 (拟南芥); AtTIM22-2: NP_566368 (拟南芥); ScTIM23: NP_014414 (酵母); ScTIM22: NP_010064 (酵母); ScTIM17:
NP_012392 (酵母)。
图3 HbTIM23-1与其他PRAT蛋白的系统进化关系
Fig.3 Phylogenetic analyses of HbTIM23-1 and other PRAT protein
植物生理学报1740
方法分析HbTIM23-1的表达模式。结果表明, Hb-
TIM23-1在巴西橡胶树胶乳、叶片、雌花、树
皮、雄花和花药组织中均有表达, 在胶乳中表达
最高, 树皮中表达量最低(图4-A)。在叶片不同发
育时期HbTIM23-1表达量存在变化, 淡绿期和衰老
期表达较高且相近, 古铜期、变色期和稳定期表
达量相当, 且相对较低(图4-B)。
讨　　论
线粒体是一种存在于真核细胞中由两层膜包
被的细胞器, 它不仅为细胞活动提供能量, 还参与
调控细胞代谢、细胞周期、细胞发育、抗病毒和
细胞凋亡等重要的生命活动(Schatz 2007)。因线
粒体自身合成蛋白数量有限, 大量蛋白由细胞核
DNA编码并转运到线粒体, 蛋白的转运过程由线
粒体蛋白质转运系统参与并完成。细胞核DNA编
码进入线粒体对其行使功能至关重要。TIM23复
合体是线粒体蛋白质转运系统的重要组成部分,
图4 HbTIM23-1不同组织(A)及叶片不同发育时期(B)的表
达模式
Fig.4 HbTIM23-1 expression patterns in different tissues (A)
and different developmental stages of leaves (B)
4 HbTIM23-1在干旱和低温处理、死皮和健康橡
胶树胶乳中的表达分析
由图5-A和B可见, 低温和干旱处理均调控Hb-
TIM23-1表达, 但两者表达模式不同。低温处理3 h
后, HbTIM23-1表达量有所下降, 之后表达量明显
升高, 24和48 h表达量显著高于处理前水平(图
5-A); 在干旱处理条件下, HbTIM23-1表达在3 h明
显升高, 之后表达持续下降, 48 h表达量下降至处
理前1/2水平(图5-B)。相比之下, HbTIM23-1在对
照不同时间点表达基本无变化。与健康橡胶树相
比, HbTIM23-1在死皮橡胶树胶乳中表达量明显下
降, 说明HbTIM23-1与橡胶树死皮相关(图5-C)。
图5 HbTIM23-1在低温(A)和干旱(B)处理及死皮和健康橡
胶树胶乳(C)中的表达模式分析
Fig.5 HbTIM23-1 expression patterns under low temperature
(A), drought (B) treatments as well as TPD
and healthy rubber trees (C)
陈江淑等: 巴西橡胶树TIM23-1基因克隆、进化及表达分析 1741
它主要由TIM23、TIM50、TIM17和TIM21 4个亚
基组成。TIM23形成TIM23复合物的跨膜通道, 并
与TIM17组成TIM23复合物整合跨膜中心 , 在
TIM23复合物孔道开放中发挥着重要作用。
尽管人们对TIM23蛋白的研究已有一些进展,
但对其认识还远不清楚, 在植物中尤为如此。本
研究首次从巴西橡胶树中克隆了首个TIM23基因,
命名为HbTIM23-1。鉴于拟南芥有3个TIM23基因,
橡胶树是否还有其他TIM23成员还有待于进一步
研究。序列比对发现橡胶树TIM23-1蛋白与其他
前蛋白和氨基酸转运体家族蛋白相似, 具有预测
转膜区域和PRAT结构域 , 以上特征对橡胶树
TIM23-1蛋白行使功能至关重要。HbTIM23-1与
拟南芥和酵母的TIM23为一个分支, 与AtTIM23-1
的亲缘关系较近, 氨基酸水平一致性高达74%, 推
测橡胶树TIM23-1蛋白与AtTIM23-1功能相似。
与拟南芥TIM23基因在不同组织和发育时期
表达存在差异结果一致(Meier等2005), HbTIM23-1
在不同组织和叶片不同发育时期表达同样存在变
化。HbTIM23-1在胶乳、树皮、叶片、雄花、雌
花和花药中均有表达, 以胶乳中表达量最高, 树皮
中最低, 说明HbTIM23-1可能在胶乳中功能相对重
要。在橡胶树叶片不同发育时期HbTIM23-1表达
存在变化, 在淡绿期和衰老期表达较高, 古铜期、
变色期和稳定期基本一致, 说明HbTIM23-1可能与
橡胶树叶片发育相关。低温和季节性干旱是影响
我国天然橡胶生产的主要逆境, 研究发现低温和
干旱均显著调控HbTIM23-1表达, 说明HbTIM23-1
可能参与橡胶树低温和干旱反应。与健康橡胶树
相比, 死皮树胶乳中HbTIM23-1表达量下降。Ven-
katachalam等(2009)报道HbTOM20在健康橡胶树
胶乳中表达量上调。因TOM20是TOM复合物的重
要组成部分, TOM和TIM复合物同时参与蛋白进
入线粒体过程。推测HbTIM23-1和HbTOM20表达
下调可能影响线粒体蛋白转运, 引起ATP水平降低
和胶乳合成能力下降从而导致橡胶树死皮发生。
当然, 这一推测还有待于进一步实验验证。
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