全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 12期，2009年 12月 1191
收稿 2009-10-26 修定 　2009-11-17
资助 国家农业行业计划(nyhyzx0 7 -00 7 )、北京市科技计划
项目(Z09090501040902)和现代农业产业技术体系建设
专项资金。
* 通讯作者(E-mail: zhangfenglan@nercv.org; Tel: 010-
5 1 5 0 3 0 3 8 )。
大白菜中小孢子胚胎发生相关基因 cDNA片段的克隆与表达分析
汪维红 1,2, 于拴仓 2, 许明 1, 赵岫云 2, 张凤兰 2,*, 余阳俊 2, 张德双 2
1沈阳农业大学园艺学院, 沈阳 110866; 2北京市农林科学院蔬菜研究中心, 北京 100097
提要: 以易出胚大白菜 ‘09C3’为材料, 克隆到7个小孢子胚胎发生相关候选基因的cDNA核心片段, 并采用半定量RT-PCR
方法研究了这些基因在游离小孢子热激处理和培养期间的表达。结果表明, 获得的 7个基因的核心片段长度在 213 bp和
417 bp之间, 克隆号分别为C31、C33、99H6、99H8、EV14、EX01和C35。NCBI进行Blastn和Blastx分析结果显示, 这
些片段与源基因 HSP70、BcHSP、Lec 2、Fus 3、PAP14、HSP17.6和HSP18.2的同源性均超过 80%。半定量 RT-PCR结
果表明, HSP70和 Lec 2在热激 24 h后上调表达, 而常温培养下 24 h后没有变化; BcHSP、HSP18.2、Fus 3和HSP17.6在热
激 24 h后和常温下24 h都上调表达; PAP14在热激 24 h后和常温下 24 h表达下调。
关键词: 大白菜; 小孢子胚胎发生; 热激; 半定量RT-PCR
Cloning and Expression Analysis of cDNA Fragments of Genes Related to Mi-
crospore Embryogenesis in Chinese Cabbage
WANG Wei-Hong1,2, YU Shuan-Cang2, XU Ming1, ZHAO Xiu-Yun2, ZHANG Feng-Lan2,*, YU Yang-Jun2, ZHANG De-Shuang2
1College of Horticulture, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China; 2Beijing Academy of Agriculture and Forestry
Science (BAAFS), Beijing 100097, China
Abstract: The highly embryogenic inbred line ‘09C3’ was used to clone cDNA fragments of seven candidate
genes involving in microspore embryogenesis of Chinese cabbage, and the expression of these genes were
studied by semi-quantitative RT-PCR to monitor the effect of 24 h heat-shock and gene behavior after 24 h non-
heat-shock culture. The length of seven obtained fragments ranged from 213 bp to 417 bp (the cloning IDs
were C31, C33, 99H6, 99H8, EV14, EX01 and C35, respectively). By Blastn and Blastx on the NCBI, these
fragments showed over 80% in amino acid identity against HSP70, BcHSP, Lec 2, Fus 3, PAP14, HSP17.6 and
HSP18.2, respectively. The results from semi-quantitative RT-PCR showed that HSP70 and Lec 2 were up-
regulated after 24 h heat shock, while no changes were found in normal culture. BcHSP, HSP18.2, Fus 3 and
HSP17.6 were up-regulated under both treatments, while PAP14 was down-regulated.
Key words: Chinese cabbage; microspore embryogenesis; heat shock; semi-quantitative RT-PCR
大白菜游离小孢子培养研究虽然取得了很大
进展, 但对小孢子胚胎发生的启动机制、微观发育
机制、发育途径以及与之相对应的生理生化及分
子机制的研究还很不完善。很多研究(Dias 2001;
Touraev等1996)都证明, 预处理能改变小孢子的发
育途径, 促使其从配子体发育途径转向孢子体发育
途径, 从而诱导小孢子胚胎的形成。在芸薹属作物
中, 应用最为普遍的是热激处理, 一般认为 32~33
℃热激处理 1~3 d的效果最好。刘公社等(1995)认
为, 在大白菜游离小孢子培养开始时, 12 h的高温
处理能大大促进小孢子均等分裂, 24 h的高温处理
则能大大提高小孢子胚的诱导率。栗根义等
(1993)研究了高温预处理对提高小孢子胚诱导频率
的作用, 认为高温热激可改变小孢子发育途径, 阻
止小孢子形成成熟花粉粒, 促进其沿胚胎发育途径
发展, 最后形成小孢子胚。因此, 研究和探讨高温
预处理诱导白菜游离小孢子培养胚胎发生的机制,
可为提高不同基因型的出胚率提供理论依据, 对加
快白菜类蔬菜种质创新有意义。
Seguí-Simarro等(2003)的研究表明, 热激预处
理能诱导热激蛋白(heat shock protein, HSP)的积
累, 包括HSP70、HSP90和一些低分子量的HSP。
经过热激后, HSP70伴随着核蛋白结构在染色质和
核仁中出现, 而 HSP90只在染色质中出现。小孢
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子胚胎发生过程中, 这种HSP的合成导致一些能阻
止花粉分化的特异蛋白合成失败, 诱导孢子体发育
的发生(Telmer等 1995)。Volkov等(2005)的研究
表明, 小分子量的热激蛋白不仅在营养组织中表达,
而且在花粉中也表达, 其表达量与热激的小孢子胚
胎发生密切相关。此外, 在甘蓝型油菜、烟草、
大麦、小麦和玉米中, 一些小孢子胚胎发生早期表
达的基因已经得到鉴定。从大麦小孢子培养中已
分离了包括非特异的脂质转移蛋白(early culture
abundant lipid transfer protein, ECLTP)、谷胱甘肽
硫转移酶(early culture glutathione-S-transferase,
ECGST)和未知蛋白(如 ECA1) 在内的差异表达基
因(Vrinten等 1999)。在甘蓝型油菜中, 消减杂交
被成功应用于分离早期小孢子胚胎发生基因, 发现
含有 BURP结构域的蛋白与小孢子胚胎发生有关
(Hattori等 1998) 。在拟南芥中, LEAFY COTYLE-
DON (LEC) 1、LEC 2和WUSCHEL (WUS) 基因的
过量表达可能导致一些基因型异常或自发的胚胎发
生(Ogas等 1999)。小孢子胚胎发生是一个复杂的
生物学过程, 有很多的基因参与这一过程, 分离与
鉴定相关功能基因是一项艰巨的任务, 还需要做很
多工作(Reynolds 1997)。
在大白菜中, 关于小孢子胚胎发生分子机制的
研究还未见报道。本文针对前人报道的 7个与小
孢子胚发生相关的候选基因, 选用易出胚大白菜
‘09C3’为材料, 研究这些基因在热激处理和培养期
间的表达, 以期从分子水平上揭示白菜胚胎发生的
机制。
材料与方法
易出胚大白菜 ‘09C3’(Brassica rapa ssp.
pekinensis), 由北京市农林科学院蔬菜研究中心白
菜课题组提供。所用试剂除注明外, 均为天根生化
科技有限公司提供。
用 Primer Premier 5.0软件根据候选基因序列
设计引物(表 1), HSP70、Lec 2、Fus 3和 PAP14
基因序列来源于甘蓝型油菜(Brassica napus) ,
BcHSP、HSP17.6和 HSP18.2序列来源于白菜
(Brassica rapa)。引物均由北京赛百盛基因有限公
司合成。
表 1 根据候选基因序列设计的引物
Table1 Primer pairs designed from candidate genes
基因 来源 序列号 引物(5→ 3)
HSP70 Brassica napus ES269567 ATCAACCGAAACACCACCAT
ACCATTTGCGTCAATGTCAA
BcHSP Brassica rapa AB367955 AGACCTGTATGACCCGTTCG
TTCTCGCTGCTTCTCTCTCC
Lec 2 B. napus DY021430 TTGCAATGGAATCGTCTTCA
ACAGCGATGTTGGGTCACTT
Fus 3 B. napus DY012343 GACACGACGGCTCTAACCTC
TTTCATATCGGGCATGGATT
PAP14 B. napus EV141452 TGGGTCGCCTCTCTTCTTTA
CCACCAGCGTAACAAAGGTT
HSP17.6 B. rapa EX017137 CAACATCACGGAAGGACA
GGAGGATAAGAACGACACG
HSP18.2 B. rapa BG544107 TTGGAGGACGGAGATCAAAC
CTCATAAACTTCCCGCTTGC
选取长度为2.5~3.5 mm的花蕾(小孢子主要处
于单核靠边期), 用 70%酒精浸泡 30 s, 2%次氯酸
钠溶液洗涤 15 min, 无菌蒸馏水冲洗 3遍。用 B5
提取培养基提取小孢子, 30 μm无菌微孔纱布过滤,
滤液以 178×g离心 3次, 每次 3 min。游离的小孢
子用 1/2NLN-13 (蔗糖浓度为 13%)液体培养基培
养, 用血球记数板调整小孢子浓度为1×105 mL-1~2×105
mL-1。试验分 2种处理, 每种处理均以未经处理的
新鲜小孢子为对照, 处理 1为 33 ℃热激 24 h后取
样, 处理 2为直接进行 25 ℃常温培养 24 h后取样。
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收集不同处理的小孢子悬浮液, 以 715×g离心 2
min, 弃去上清液, 回收小孢子沉淀, 立即置于液氮
中研磨, 加入 Trizol提取 RNA。
采用 Trizol试剂盒 (Invitrogen公司)提取总
RNA。用 RNase Free DNase I (TaKaRa公司)处理
总 RNA, 去除残留的基因组DNA。用Quant Re-
verse Transcriptase合成 cDNA第一链, 具体步骤参
照试剂盒说明。
RT-PCR扩增候选基因同源片段的反应体系
(10 μL)为: 1 μL cDNA模板, 1 μL 10×buffer, 0.75 μL
dNTP, 0.25 μL Taq DNA聚合酶, 6 μL ddH2O, 上下
游引物各 0.5 μL。反应条件为: 94 ℃预变性 5 min;
94 ℃变性 30 s, 退火 30 s, 72 ℃延伸 40 s, 35个循
环; 72 ℃延伸 7 min。其中不同基因的退火温度不
同, HSP70为 53 ℃, BcHSP和 Lec 2为 55 ℃, Fus
3、PAP14、HSP17.6和HSP18.2为 56 ℃。PCR
产物于 4 ℃保存。
取PCR扩增产物, 用1.5%琼脂糖凝胶电泳, 在
紫外灯下切下目的条带, 用DNA凝胶回收试剂盒
(北京博迈德公司)回收目的片段。用克隆试剂盒
将目的片段重组入克隆载体, 具体步骤参照说明。
每条片段随机挑选 3~5个阳性克隆送天根公司测
序。将测序得到的序列在NCBI上应用 Blast程序
进行同源性检索(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast);
利用DNAMAN软件去除载体序列, 并对基因序列
进行比对分析。
以GAPDH为参照基因, 根据琼脂糖凝胶电泳
的结果, 对处理 1和处理 2共 4个时期进行 PCR扩
增(25个循环), 调整模板浓度。除 Fus 3外, PCR
扩增时获得的条带均为单一条带; 因为候选基因来
源于白菜或甘蓝型油菜序列, 可以直接用原引物序
列进行半定量RT-PCR检测。对于Fus 3, 用Primer
Premier 5.0软件设计半定量 RT-PCR特异扩增引
物, 上游引物为5-GACACGACGGCTCTAACCTC-
3, 下游引物为 5-ACCCTCGAATGATCCAACCT-
3。针对每个基因设置不同的 PCR循环数进行半
定量 RT-PCR分析, 其中HSP70和 Fus 3为 36个
循环, BcHSP、Lec 2、PAP14和 HSP18.2为 34
个循环, HSP17.6为 29个循环。
实验结果
1 大白菜胚胎发生相关基因的扩增结果
使用特异扩增引物进行PCR扩增的结果见图
1。各引物对均扩增出目的条带, 其产物大小均与
图 1 小孢子胚胎发生相关基因的 PCR扩增产物
Fig.1 PCR products of microspore embryogenesis genes in Chinese cabbage
M: 10 0 bp D N A La dder 分子量标准, 共 1 1 条带, 由大到小依次是 1 5 00、1 00 0、9 00、80 0、7 00、60 0、50 0、40 0、
300、200和 100 bp, 图中标出 500和 200 bp。1~7: 33 ℃热激 24 h后的 PCR产物; 克隆号如下, 1: C31; 2: C33; 3: 99H6; 4: 99H8;
5: EV14; 6: EX01; 7: C35。
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预期一致, 分布在 200 bp到 400 bp之间, HSP70和
BcHSP扩增出的条带大小都为 200 bp左右, 克隆
号分别为C31和C33; HSP18.2扩增出的条带为300
bp左右, 克隆号为 C35; HSP17.6扩增出的条带为
340 bp左右, 克隆号为 EX01; Fus 3扩增出的条带
为 350 bp左右, 克隆号为 99H8; Lec 2和 PAP14扩
增出的条带都为 400 bp左右, 克隆号分别为 99H6
和 EV14。除 99H8外, PCR扩增产物均为单一条
带, 各引物对的特异性较高。
2 大白菜小孢子胚胎发生相关基因的克隆、测序
及序列分析
对克隆得到的上述7个目的条带进行测序, 去
除载体序列后在NCBI上进行Blastn和Blastx分析。
Blastn结果显示(表 2), C31、C33、99H8和 EV14
与候选基因源序列的核苷酸序列同源性为 100%,
EX01为 99%, 99H6为 98%, C35为 91%。Blastx
结果显示(表3), C33与BcHSP的氨基酸序列同源性
为 100%, C31与HSP70为 97%, EX01与HSP17.6
为 96%, C35与HSP18.2为 92%, EV14与PAP14为
88%, 99H6与LEC 2为83%, 99H8与FUS 3为82%。
本文获得的基因片段与 7 个候选基因 H S P7 0、
BcHSP、Lec 2、Fus 3、PAP14、HSP17.6和
HSP18.2的核苷酸序列及其编码氨基酸序列的同源
性均超过 80%, 为候选基因的核心片段, 并且蛋白
功能已知。7条序列已提交GenBank数据库, 登录
号分别为 GT053407 (C31)、GT053408 (C33)、
G T 0 5 3 4 1 0 ( 9 9 H 8 )、G T 0 5 6 0 5 8 ( 9 9 H 6 )、
GT05 605 9 (EV14 )、GT05 606 0 (EX 01 )和
表 2 差异序列Blastn相似性比较
Table 2 Comparison of different sequences by Blastn
Blastn
克隆号 登录号 片段长度 / bp
序列 ID 同源性 /% E值 相似核酸信息
C31 GT053407 213 ES269567 100 6e-104 甘蓝型油菜 JKBNM4, mRNA序列
C33 GT053408 222 AB367955 100 7e-109 小白菜 BcHSP, mRNA序列
99H6 GT056058 399 DY021430 9 8 0 甘蓝型油菜 63JKCOT5, mRNA序列
99H8 GT053410 364 DY012343 100 0 甘蓝型油菜 40JKME7D, mRNA序列
EV14 GT056059 417 EV141452 100 0 甘蓝型油菜早期花药 cDNA, mRNA 序列
EX01 GT056060 339 EX017137 9 9 8e-168 大白菜花药 cDNA文库KBAY-28A08, mRNA序列
C35 GT056147 328 BG544107 9 1 3e-129 大白菜幼苗 cDNA文库 E1889, mRNA 序列
表 3 差异序列Blastx相似性比较
Table 3 Comparison of different sequences by Blastx
Blastx
克隆号 登录号 片段长度 / bp
序列 ID 同源性 /% E值 相似蛋白信息
C31 GT053407 213 BAD94381 9 7 2e-31 拟南芥HSP70类似蛋白
C33 GT053408 222 BAG82627 100 2e-28 小白菜热激蛋白
99H6 GT056058 399 ABE65660 8 3 3e-18 拟南芥 LEC 2; DNA 结合 /转录因子
99H8 GT053410 364 AAC35247 8 2 2e-08 拟南芥 FUSCA 3
EV14 GT056059 417 AAW29948 8 8 7e-65 拟南芥 PAP14; 酸性磷酸酶 /丝氨酸蛋白 /苏氨酸磷酸酶
EX01 GT056060 339 NP_180511 9 6 4e-26 拟南芥HSP17.6B-CI
C35 GT056147 328 NP_200780 9 2 1e-43 拟南芥 HSP18.2
GT056147 (C35)。
3 小孢子胚胎发生相关基因的半定量RT-PCR检测
根据已获得的 7个小孢子胚胎发生相关基因
序列设计特异扩增引物, 采用半定量RT-PCR方法
检测这些基因的表达。7个基因的表达模式可分
为 3类。(1)只在热激 24 h后上调表达, 有 2个基因,
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分别为HSP70和 Lec 2。其中 Lec 2只在热激 24 h
后表达, 其它时期不表达。(2)热激和常温培养 24 h
后表达都上调, 有 4 个基因, 分别为 B c H S P、
HSP18.2、Fus 3和HSP17.6。其中HSP18.2和Fus
3只在热激 24 h后和常温 24 h后表达, HSP18.2在
常温下培养 24 h的表达量要明显高于热激 24 h后
的表达量, 而 Fus 3在热激 24 h后的表达量明显高
于常温下培养 24 h的表达量。(3)热激和常温培养
24 h后表达都下调, 只有 1个基因, 为 PAP14 (表
4)。由此推测, 小孢子经过热激或常温 24 h后, 启
动了 HSP18.2、Lec 2和 Fus 3的表达, 而对于
HSP70、BcHSP、PAP14和 HSP17.6来说, 热激
或常温 24 h只可诱导表达量的变化。
讨　　论
33 ℃热激24 h对十字花科植物诱导小孢子胚
胎的发生和发育非常重要。经过热激诱导后, 一些
小孢子开始对称分裂并转向孢子体途径, 最后形成
胚状体。在此过程中, 植物体形成一系列保护蛋白
(如 HSPs) (Boorstein等 1994)。在这些蛋白中,
HSP70家族是最丰富的和进化中最保守的。在甘
蓝型油菜小孢子胚胎发生过程中, 热激诱导后的
HSP70家族基因表达上调(Cordewener等 1995)。
本文在大白菜中也获得类似的结果。Volkov等
(2005)的研究表明, 小分子量的热激蛋白不仅在营
养器官中表达, 而且在花粉中表达, 其表达量与热
激的小孢子胚胎发生密切相关。本文也研究了低
分子量的HSPs, 如 BcHSP、HSP18.2和HSP17.6。
结果表明, 这些基因不仅在热激 24 h后表达上调,
而且常温下培养24 h后也表达上调。由此推断, 在
大白菜小孢子胚胎发生过程中, 不同分子量的HSPs
可能具有不同的功能, 低分子量的HSP可能具有更
重要的作用。由于本文取样时间点有限, 这些小分
子HSP的表达谱还不十分清楚, 有待进一步查明。
LEC 1编码了一个CCAAT 框结合转录因子的
HAP3亚单元(Lotan等 1998)。此外, LEC 1的过
量表达对诱导营养细胞的胚胎发生有决定性作用
(Stone等 2001)。LEC 2、ABI 3和 FUS 3是
包含转录因子的 B3结构域(Koornneef等 1998)。
ABI 3和 FUS 3首次被发现参与 ABA信号途径
(Finkelstein等 2002)。近年来的研究表明, 这些基
因不仅与种子的发育和成熟有关, 还与早期胚胎发
生有关(Gaj等 2005)。LEC 1、LEC 2、FUS 3、
ABI 3、WOX 2、WOX 9和 BBM 1是小孢子胚
胎发生过程中的7个标记基因, 而且都是转录因子
(Malik等 2007)。本文在大白菜中以 RT-PCR克隆
到的 LEC 2和 FUS 3基因片段检测其基因的表达,
结果显示, 它们都为热激 24 h后上调表达。
紫色酸性磷酸酶(purple acid phosphatase, PAP)
是活性中心含有双金属核的金属磷酸酯酶(Schenk
表 4 小孢子胚胎发生相关基因的半定量RT-PCR
Table 4 Semi-quantitative RT-PCR of genes related microspore embryogenesis
半定量 RT-PCR结果
类型 克隆号 基因名称
H0 H24 R0 R24
热激 24 h后表达上调 C31 HSP70
99H6 Lec 2
热激和常温培养 24 h后表达上调 C33 BcHSP
99H8 Fus 3
C35 HSP18.2
EX01 HSP17.6
热激和常温培养 24 h后表达下调 EV14 PAP14
参照基因 - GAPDH
　　H0 和 H24分别为新鲜小孢子和 33℃热激处理 24 h; R0和 R24分别为新鲜小孢子和常温培养 24 h。
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等 2000)。已对真核生物和细菌中的一系列 PAPs
基因做了鉴定。在高等植物中, 由于磷酸盐胁迫诱
导了许多PAPs基因的表达, 推断PAPs在磷酸盐代
谢中可能有作用(Li等 2002)。据报道, 拟南芥衰老
叶片中的PAP还受活性氧胁迫的诱导表达(del Pozo
等 1999)。另外, 还有报道称 PAP在百合花粉粒中
也显著表达(Kim和An 1996)。本文也克隆出一个
PAP基因片段, 与拟南芥 PAP蛋白高度同源, 半定
量RT-PCR检测基因的表达表明, 在热激处理后和
常温下培养期间游离小孢子中该基因的表达均下
调, 究竟此基因在胚胎发生过程中有什么样的生物
学功能, 还有待进一步研究。
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