全 文 ：植物生理学通讯 第 46 卷 第 5 期, 2010 年 5 月 453
收稿 2010-01-27 修定 　2010-04-28
资助 国家科技支撑项目(2009BADB8B00-03)、大宗蔬菜产业
技术体系建设专项资金、北京市自然科学基金(6102011)
和北京市科技计划项目(Z09090501040902)。
* 通讯作者(E-mail: zhangfenglan@nercv.org; Tel: 010-
5 1 5 0 3 0 3 8 )。
大白菜霜霉菌诱导抑制性消减杂交 cDNA文库的构建和分析
唐永洽 1,2, 于拴仓 2, 朱月林 1, 张凤兰 2,*, 余阳俊 2, 赵岫云 2, 张德双 2
1 南京农业大学园艺学院, 南京 210095; 2 北京市农林科学院蔬菜研究中心, 北京 100097
提要: 以抗霜霉病大白菜双单倍体系(DH) ‘T12-19’为材料, 构建了霜霉病诱导表达的正向抑制性消减文库, 并利用反向
Northern斑点杂交技术对 768个阳性克隆进行了筛选, 共获得 57个病原菌诱导上调表达的克隆。测序后得到 55条通读表
达序列标签(ESTs), 对这些 ESTs序列进行聚类和拼接分析, 共获得 50个 unigenes。Blast分析表明, 37个 unigenes与已知基
因高度同源, 占全部非重复序列的 67.3%。对已知功能基因按MIPS的分类方法进行功能分类, 发现这些基因的功能主要
涉及物质与能量代谢、转录调控、蛋白质合成与代谢、膜及转运、信号转导、抗病防御等。为了验证文库筛选结果的可
靠性, 采用实时荧光定量 PCR技术分析了其中 2个克隆BFCH10和BFIA7的表达谱。结果表明, 这 2个克隆在接种病菌 6
h后明显上调表达, 与反向Northern斑点杂交结果基本一致。
关键词: 大白菜; 霜霉病; 抑制性消减文库; 实时荧光定量PCR
Construction and Analysis of Suppression Subtractive Hybridization cDNA Li-
brary in Chinese Cabbage (Brassica rapa ssp. pekinensis) Leaves Induced by
Peronospora parasitica
TANG Yong-Qia1,2, YU Shuan-Cang2, ZHU Yue-Lin1, ZHANG Feng-Lan2,*, YU Yang-Jun2, ZHAO Xiu-Yun2, ZHANG De-
Shuang2
1College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2Biejing Vegetable Research Center, Beijing
Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing 100097, China
Abstract: A forward suppression subtractive hybridization (SSH) library was constructed from leaves of Chi-
nese cabbage (Brassica rapa ssp. pekinensis) double haploid (DH) line ‘T12-19’ resistant to downy mildew
which was induced by Peronospora parasitica. By reverse Northern blot analysis, 57 up-regulated expressed
sequence tags (ESTs) were identified from 768 clones of the SSH library and were sequenced to generate 55
high-quality ESTs. These sequences clustered into 50 unigenes. Blast analyses showed that 37 unigenes shared
high identity with genes of known functions involved in energy metabolism, transcription regulation, protein
synthesis and fating, membrane transportation, signal transduction, defense, etc. To verify the screening efficiency,
the expression profiling of two clones, BFCH10 and BFIA7, was analyzed by real-time PCR. The significant up-
regulation was observed in leaves of 6 h post-inoculation for these two clones. These results matched the study
by reverse Northern blot analysis.
Key words: Brassica rapa ssp. pekinensis; downy mildew; suppression subtractive hybridization (SSH); real-
time PCR
大白菜原产于我国, 是我国栽培面积最大的蔬
菜作物, 目前已逐渐成为世界性的蔬菜作物。霜霉
病是大白菜三大病害(病毒病、霜霉病和软腐病)
之一, 其病原菌为寄生霜霉菌。该病从苗期到包心
期及其生殖生长阶段均易发生, 严重影响了大白菜
的产量及品质。
关于芸薹属植物霜霉病的遗传规律研究主要
集中在青花菜、甘蓝和花椰菜上, 在这些作物中都
发现了由主效基因控制的抗病基因(Mahajan 等
1995; Farnham等 2002; Coelho 和 Monteiro 2003;
Monteiro等 2005)。Farinho等(2004)鉴定出了与青
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花菜抗霜霉病基因 Pp523 紧密连锁的分子标记
OPK17-980和AT.CTA-133/134, 进而将其转化为稳
定的SCAR (sequence-characterized amplified region)
和CAPS (cleaved amplified polymorphism sequences)
标记(Farinho 等 2007)。冷月强等(2007)在不结球
白菜中, 获得了与抗霜霉病基因紧密连锁的RAPD
(random ampli f ied polymorphic DNA)标记
AY121238。Yu 等(2009)利用双单倍体系(double
haploid, DH)群体定位了控制大白菜苗期霜霉病抗
性的主效QTL (quantitative trait loci), 并获得了与之
紧密连锁的 SSR (simple sequence repeat)和 RAPD
标记。然而, 关于大白菜与霜霉菌互作的分子机制
的研究尚未见报道。
目前, 植物与病原菌互作分子机制的研究方法
有很多, 最常用的有 cDNA-AFLP (amplified frag-
ment length polymorphism) (Bachem 等 1996)、
DDRT-PCR (differencial display reverse transcription
PCR) (Liang和Pardee 1992)和RDA (representational
difference analysis) (Lisitsyn 等 1993)等。与之相
比, 抑制差减杂交技术(suppression subtractive
hybridization, SSH)具有快速、高效、假阳性率低
的特点(von Stein 等 1997)。该技术已经在植物上
得到广泛的应用(Degenhardt等2005; Lin等2006; Li
等 2006; Liu等 2008)。鉴于 SSH 技术的诸多优点,
本文利用SSH方法, 构建了大白菜霜霉病诱导的正
向差异表达文库, 以期研究大白菜在霜霉病诱导下
的差异表达基因, 为进一步揭示大白菜霜霉病抗性
的分子机制及分子辅助育种打下基础。
材料与方法
抗霜霉病大白菜(Brassica rapa ssp. pekinensis)
DH系材料‘T12-19’由北京市农林科学院蔬菜研究
中心通过小孢子培养技术得到。幼苗在空调温室
中培养, 温度控制在 20~25 ℃。当幼苗长至三周
龄、两片真叶完全展开时接种霜霉菌。病菌的采
集和保存、病菌孢子悬浮液的制备以及喷施参照
Yu 等(2009)的方法。
在霜霉菌接种后 0、6、12、24、48 和 72
h分别采集第二片真叶, 用灭过菌的棉球擦净叶片
后立即用液氮速冻, -80 ℃保存。总 RNA 提取采
用TRIZOL试剂盒(TIANGEN)。使用TaKaRa公司
的 DNase I 去除痕量基因组 DNA。
SSH 按Diatchenko等(1996)报道的方法, 采用
PCR-Select cDNA Subtraction Kit (Clontech)构建抑
制性消减文库, 文库以抗病材料‘T12-19’接种大白
菜霜霉菌后6个时期的双链cDNA混合池作为消减
杂交的实验方(tester), 以喷清水材料 6 个时期的双
链 cDNA 混合池作为驱动方(driver)。SSH 第二轮
PCR 产物经纯化后与 pGM-T 载体连接, 连接产物
的热激转化大肠杆菌 Top 10, 参照 pGM-T 克隆试
剂盒(TIANGEN)说明书进行。
使用反向 Northern 斑点杂交进一步筛选差异
表达克隆。以 24 h 接种霜霉菌和 24 h 喷水对照
cDNA 作为探针。探针的标记及免疫检测按照地
高辛标记试剂盒(DIG High Prime DNA Labeling and
Detection Starter Kit I, Roche)说明书进行。取 10
μL PCR扩增产物沸水浴变性10 min, 立即冰浴; 然
后取 1 μL样品分别点于两张96点阵Hybond-N+尼
龙膜(Amersham)上, 进行反向 Northern 斑点杂交。
120 ℃烘膜固定 30 min, 杂交温度为 42 ℃。
为了验证文库筛选结果的可靠性, 采用实时荧
光定量 PCR 技术分析其中 2 个克隆的表达谱。荧
光定量 PCR 仪器为 LightCycler480 (Roche), 所用
荧光染料为SYBR Green I, 以大白菜甘油醛三磷酸
脱氢酶(GAPDH)为内参照基因, 0 h 样品作为标准
品进行均一化处理。选取 BFCH10 和 BFIA7 两个
克隆进行相对定量分析, 这两个基因在核苷酸水平
上分别与编码拟南芥钙调蛋白结合蛋白和拟南芥钙
调蛋白结合 /转录调节因子有很高的同源性。荧光
定量 PCR 引物参照表 1。PCR 反应体系为 10 μL,
循环参数为: 95 ℃ 3 min; 95 ℃ 15 s, 57 ℃ 20 s, 68 ℃
20 s, 40个循环。熔解曲线分析在 65 ℃以 0.11 ℃·s-1
上升到 95 ℃进行, 重复 3 次。为了检测 PCR 扩
增效率, 将 cDNA 样品模板按 5 倍梯度稀释(1:1、
1:5、1:25、1:125 和 1:625)。利用 LightCycler
Version 1.5 (Roche Diagnostics)软件分析相关的数
据。
采用Pfaffl法(2001)进行相对定量分析。表达
水平=(E目标)ΔCt目标(对照-试验)/(E参照)ΔCt参照(对照-试验)。E指
实际扩增效率, Ct值指每个反应管内的荧光信号达
到设定的阈值时所经历的循环数。
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实验结果
1 差减与未差减杂交产物的二次PCR
如图1所示, 两轮PCR产物均呈现弥散状。第
二次 PCR 后, 差减后样品片段分布在 200~800 bp
之间, 要明显小于未差减的对照样品分布, 这说明
差减较为成功。
2 文库插入片段大小的检测
经菌落 PCR检测, 得到阳性克隆共 768个。经
1.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果(图2)表明, 文库的插
入片段分布在200~1 000 bp, 主要集中在200~500 bp。
3 反向Northern斑点杂交和序列比对
将反向Northern斑点杂交得到的 57个差异克
隆测序, 共获得55条高质量的表达序列标签(expre-
ssed sequence tags, ESTs), 测序成功率为 96.5%。
表 1 荧光定量 PCR 的引物
Table 1 Primers for real-time PCR
基因名称 登录号 引物序列(5 → 3) 产物大小 /bp
GAPDH AF536826 CAGGTTTGGAATTGTCGAGG; GAGCTGTGGAAGCACCTTTC 175
BFCH10 GT053404 ACTCTCCACGATGGTCCTTG; GGGACGTTAGGGGAGCTTAT 157
BFIA7 GT087893 TTGGATTTCCGTGATAAGCA; GTCGGGTCTGTCACCAAGTT 122
图 1 差减及未差减杂交样品的巢式 PCR 产物
Fig.1 The nested PCR products of unsubtracted
and subtracted samples
1: 100 bp DNA Ladder 分子量标准; 2: 差减杂交样品第一次
PCR 扩增结果; 3 和 4 分别为差减杂交样品和未差减杂交样品第
二次 P C R 扩增结果。
图 2 差减 cDNA文库插入片段的 PCR 检测
Fig.2 PCR analysis of inserted fragments from the subtracted cDNA library
M: 100 bp DNA Ladder 分子量标准; 1~20: 随机挑取的克隆。
55 条 ESTs 序列提交 GenBank 数据库(登录号:
GT053377~GT053406, GT087878~GT087902)。对
55 条 ESTs 序列进行聚类和拼接后, 共获得 4 个
contigs, 46 个 singlets。将所得序列与 GenBank 中
nr 数据库进行Blastx与Blastn同源比较, 同时在国
际白菜基因组网站(http://www.brassica-rapa.org/
BRGP/index.jsp)上进行Blastn/unigene比对, 共得到
50 个 unigenes, 其中有 37 个为功能已知序列, 占
74%; 有 7 个 unigenes 为假定或未知蛋白; 有 4 条
ESTs 为白菜克隆序列, 功能未知。
根据MIPS (http://mips.helmholtz-muenchen.de/
proj/funcatDB/search_main_frame.html)基因功能分
类方法, 50条unigenes非重复序列可以细分为10类
(表 2), 主要包括物质与能量代谢、转录调控、信
号转导、蛋白质合成与代谢、膜及转运、抗病
防御等。在已知功能序列中, 物质和能量代谢以及
信号通路各占 37.8%, 其中信号通路主要包括转
录、蛋白质合成与代谢等。逆境应答类为第三大
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表 2 序列同源性比较结果
Table 2 Comparison result of sequence homology
功能分类 克隆号 登录号 同源序列 E 值
代谢 BFGH3 GT053377 木质葡聚糖内转糖基化酶 Nu 1E-26
BFGH10 GT053378 丙酮酸磷酸二激酶 Nu 1E-179
BFGH12 GT053379 拟南芥核酮糖 -1,5- 二磷酸羧化酶 / 加氧酶小亚基 Nu 2E-30
BFAG12 GT053381 甘蓝性油菜 BURP 结构域蛋白 X 3E-51
BFAG9 GT053385 拟南芥类硫氧还蛋白 2X 4E-6
BFAB6 GT053387 甘蓝性油菜硝酸还原酶 Nu 1E-152
BFBA11 GT053390 拟南芥类胡萝卜素裂解双加氧酶 1Nu 7E-43
BFBG4 GT053393 拟南芥 E1α 丙酮酸脱氢酶 Nu 2E-45
BFCA6 GT053397 拟南芥蛋白酶体亚基 PAB1Nu 1E-164
BFAA7 GT087883 拟南芥短链脱氢 / 还原酶家族蛋白 Nu 6E-63
BFIB10 GT087890 拟南芥蛋白激酶家族蛋白 Nu 1E-34
BFIC4 GT087895 拟南芥尿黑酸 1,2- 双加氧酶 N 4E-38
BFID7 GT087897 拟南芥 M50 肽酶家族蛋白 N 1E-07
BFHC4 GT087902 拟南芥 PRLI 相互作用因子 KN 2E-110
信号通路 BFAF10 GT053384 拟南芥结合 mRNAN 8E-70
BFCA3 GT053396 拟南芥 60S 核糖体蛋白 L9Nu 1E-53
BFCD11 GT053399 拟南芥富含精氨酸 / 丝氨酸剪接因子 Nu 4E-79
BFCB3 GT053405 拟南芥胚珠败育蛋白 5X 6E-63
BFCB6 GT053406 拟南芥谷氨酰胺合成酶 Nu 0
BFHF4 GT087878 拟南芥放氧加强蛋白 2Nu 1E-106
BFHE3 GT087879 拟南芥含 CP12 结构域蛋白 1Nu 1E-53
BFEG3 GT087880 拟南芥 Argonaute 1Nu 1E-148
BFIB3 GT087886 拟南芥脱水早期应答蛋白 1N 2E-86
BFIB4 GT087887 拟南芥 60S 核糖体蛋白 L6Nu 1E-23
BFIB6 GT087888 拟南芥转录因子 N 3E-89
BFIA7 GT087893 拟南芥钙调蛋白结合 / 转录调节因子 N 5E-50
BFIC6 GT087899 拟南芥泛素连接酶 N 2E-34
转运 BFAB12 GT053383 拟南芥液泡膜 H(+)-PPaseNu 5E-72
BFIB9 GT087889 拟南芥光系统 II 亚基 Q-2Nu 5E-46
胁迫应答 BFAG8 GT053386 拟南芥信号识别颗粒 54 蛋白 Nu 1E-135
BFBA10 GT053391 拟南芥假定丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶 Nu 1E-102
BFDE7 GT053395 拟南芥含有 DNAJ 热休克 N 末端结构域的蛋白Nu 1E-14
BFCE4 GT053401 拟南芥环核苷酸通道 4 蛋白 X 3E-16
BFCH10 GT053404 拟南芥钙调蛋白结合蛋白 Nu 1E-82
BFHF9 GT087882 拟南芥 AN1 型锌指蛋白 Nu 4E-24
BFIE5 GT087892 大白菜几丁质酶 N 0
功能未知蛋白 BFAD9 GT053382 拟南芥未知蛋白 Nu 1E-114
BFEE1 GT053388 拟南芥假定蛋白 Nu 0
BFBB10 GT053389 拟南芥假定蛋白 Nu 0
BFCD9 GT053398 拟南芥未知蛋白 N 2E-34
BFCE5 GT053402 拟南芥假定蛋白 N 1E-32
BFEG4 GT087881 拟南芥未知蛋白 N 4E-133
BFIC9 GT087891 拟南芥未知蛋白 Nu 1E-112
其它 ESTs BFBB4 GT053392 拟南芥 rRNAN 1E-51
BFCE10 GT053403 大白菜克隆 KBrS003O10N 1E-65
BFIB2 GT087885 大白菜克隆 KBrB037F09N 0
BFIB8 GT087894 大白菜克隆 KBrB007O13N 1E-134
BFID6 GT087896 大白菜克隆 KBrB037F09N 4E-51
　　X: Blastx 分析; N: Blastn 分析; Nu: Blastn/unigene 分析。
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类, 涉及信号转导及抗病防御等, 占 19.4%。
4 荧光定量PCR相对定量分析
为了进一步验证反向 Northern 斑点杂交筛选
结果的可靠性, 本研究采用荧光定量PCR的方法验
证了文库中可能与抗病性相关的两个克隆BFCH10
和BFIA7。结果显示: GAPDH、BFCH10和BFIA7
熔解曲线均为锐利的单一峰, 扩增曲线的斜率分别
为: -3.416、-3.276 和-3.484, 符合实验的要求。
利用软件分析分别求出每个基因不同时期相对于0
h的表达水平。BFCH10和BFIA7荧光定量检测结
果见图 3, 接种霜霉菌后, 二者均表现为先升高后
降低的表达趋势, 在接种霜霉菌后 6 h 相对表达量
达到最高, 相对于未处理(0 h)上升了 10倍左右, 随
后又逐渐回落至初始水平。BFCH10 和 BFIA7 喷
水对照处理在各时期的表达也呈相同的变化趋势,
但相对表达量均低于同时期接种霜霉菌的相对表达
量。
讨　　论
植物抗病机理的研究一直是植物学领域研究
的热点问题。植物与病原体(病毒、细菌以及真
菌等)的互作关系是两个有机体之间的竞争关系。
高等植物已经在长期的进化过程中形成了复杂的防
御系统进而保护自身不受侵害(McDowell和Dangl
2000)。目前, 关于大白菜与霜霉菌互作的分子机
制的研究尚未见报道。鉴于SSH技术的诸多优点,
本文采用该方法构建了大白菜霜霉病诱导的正向差
异表达文库, 以期研究大白菜在霜霉病诱导下的差
异表达基因, 为进一步揭示大白菜霜霉病抗性的分
子机制奠定基础。在文库构建的过程中, 本研究对
其中的关键环节, 包括总 RNA 质量、接头连接效
率、差减效率等进行了严格的控制, 保证了文库的
质量。菌液 PCR 扩增结果表明 cDNA插入片段大
小主要分布在 200~500 bp 之间, 符合实验预期要
求, 为高效筛选差异表达基因奠定了基础。
本研究采用反向Northern杂交的方法, 从文库
中筛选获得了 37 个与已知功能基因同源的 ESTs,
其中包含了与几丁质酶基因序列相似性达 99% 的
克隆 BFIE5。几丁质酶是一种重要的病程相关蛋
白, 能催化水解真菌细胞壁中的几丁质, 从而抑制
真菌的生长和繁殖, 能够提高植物的抗真菌能力
(Melchers 和 Stuiver 2000)。李新玲等(2008)研究
表明, 转几丁质酶基因的小麦后代对白粉病田间混
合菌种的抵抗能力增强。在文库中还筛选出了与
信号转导有关的克隆, 这些克隆包括 BFBA10、
BFCE4、BFCH10 和 BFIA7, 它们分别与拟南芥假
定丝氨酸 / 苏氨酸激酶(serine/threonine protein
kinase, putative)、核苷酸通道 4 蛋白(cyclic nucle-
otide-gated cation channel 4, CNGC4)、钙调结合
蛋白(calmodulin-binding protein, CaMBP)和钙调蛋
白结合/转录调节因子(calmodulin binding/transcrip-
tion regulator)等的同源性都在 90% 以上。由 CaM
调控的CNGCs在信号转导、代谢和生长过程中具
有重要作用。在病原菌侵染时参与过敏反应抗病
信号应答(Balague等2003)。CaMBP能够提高CaM
图 3 荧光定量 PCR 法分析 BFCH10 和
BFIA7 受病菌侵染后的表达
Fig.3 Expression analysis of BFCH10 and BFIA7 in
response to infection by real-time PCR
i: 接种霜霉菌处理样品; ui: 未接种霜霉菌的喷水对照样品。
**: 同时期处理与对照差异极显著; *: 同时期处理与对照差异显
著; 没有标注的时期处理与对照差异不显著。
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结合 Ca2+ 的能力, 并激活其它的酶类活性(Liao 等
1996)。而 CaM 是 Ca2+ 信号受体中最重要的一种
(Bouche 等 2005)。钙调蛋白结合 / 转录调节因子
是一种乙烯诱导型钙调结合蛋白(Reddy 等 2002)。
由此可以推断, 在霜霉病菌的诱导下, 大白菜产生
了应激信号, 并将信号向体内传导, 进而引起一系
列的防御反应。为了进一步验证反向 Northern 斑
点杂交筛选结果的可靠性, 本研究采用荧光定量
PCR的方法分析了BFCH10和BFIA7在霜霉病诱导
后的表达谱。结果表明, BFCH10和BFIA7受霜霉
菌诱导后 6 h 都明显上调表达, 且接病处理与喷水
处理差异极显著, 这与反向Northern斑点杂交所得
结果一致。
综上所述, 该文库的构建具有一定的科学性,
从文库中通过筛选测序得到的克隆具有一定的代表
性, 是受霜霉菌侵染后差异性表达的克隆。不过少
量的验证难免有一些片面性, 不足于说明复杂的抗
病机理, 因此还需要对文库中筛选出的其它差异表
达的克隆作进一步的定量分析和功能验证。
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