全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 1期，2009年 1月8 0
植物吸收利用铵态氮和硝态氮的分子调控
李宝珍 1,2, 范晓荣 2, 徐国华 2,*
1中国科学院南京土壤研究所土壤与农业可持续发展国家重点实验室, 南京 210008; 2南京农业大学资源与环境科学学院,
南京210095
Molecular Regulation for Uptake and Utilization of Ammonium and Nitrate in
Plant
LI Bao-Zhen1,2, FAN Xiao-Rong2, XU Guo-Hua2,*
1State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture, Nanjing Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing
210008, China; 2College of Resource and Environmental Science, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
提要: 本文介绍了植物吸收和利用 NH4+、NO3-的转运系统和相关基因的表达调控特征, 以及与氮还原、同化相关的酶及
其调控基因的发现和功能的研究进展。
关键词: 铵; 硝; 转运; 还原同化; 调控表达
收稿 2008-08-06 修定 2008-12-08
资助 中国博士后科学基金(20070421031)、国家重点基础研
究发展计划(“973”计划) (2005CB120903)和国家自然
科学基金(30 50 0 30 9)。
* 通讯作者(E-mail: ghxu@njau.edu.cn, Tel: 025-84396246)。
铵态氮(ammonium N, NH4+-N)和硝态氮(nitrate
N, NO3--N)作为植物吸收和利用的主要无机氮源, 对
植物生长发育和作物的产量有着极为重要的影响。
农业生产中, 为保证粮食产量, 氮肥的投入不断增
加, 但其利用率却越来越低, 在一定程度上造成资
源浪费, 并给环境造成极大的压力, 引起一系列的
环境污染问题(朱兆良 2000)。因此, 如何提高氮肥
的利用率, 充分发挥肥料的增产效应是急需解决的
问题。随着植物营养研究的不断深入, 探究植物氮
高效吸收、转运和储存的分子机制, 寻找提高植物
氮素利用率的调控基因, 为从生物学途径改良植物
对氮的吸收和利用提供了重要的科学依据。本文
介绍植物吸收和转运NH4+和NO3-的分子调控机制
以及与氮还原同化相关的酶及其调控基因的研究进
展。
1 植物对铵态氮的吸收和转运
1.1 高亲和和低亲和铵转运系统 植物根系对NH4+
的吸收可分为高亲和力转运系统(high a ffini ty
transporter, HATS)和低亲和力转运系统(low affin-
ity transporter, LATS) (Glass等2002)。当外界NH4+
离子浓度([NH4+]ext)低于 1 mmol·L-1时, 主要是高亲
和转运系统承担 NH4+的吸收; 当[NH4+]ext大于 1
mmol·L-1时, 低亲和转运系统才被激活(Wang等
1993)。研究表明, 植物对NH4+的吸收属于不同铵
转运蛋白家族的多个基因调控, 这些系统的亲和性
和功能的行使依赖于相应基因的在转录和/或翻译
水平上的表达调控, 所以高亲和转运系统的动力学
参数不仅在不同植物间相差很大, 而且对同一植物
而言也受环境因素的影响(von Wiren等 2000a)。
1.2 铵转运蛋白基因的克隆 高等植物如水稻(Suenaga
等 2003)、番茄(Lauter等 1996; von Wiren等
2000b)、油菜(Pearson等 2002)、白菜(D’Apuzzo
等 2004)、小麦等已鉴定了多个铵转运(ammonium
transporter, AMT)基因(图 1)。几乎所有这些 AMT
家族的成员都有相似的拓扑学结构: 11个跨膜区, 其
N端在质外体, C端在细胞质内(Marini和 Andre
2000)。AMT的蛋白质序列和结构具有高度的保
守性。有研究表明, 细菌氨转运蛋白AmtB的结构
对吸收和利用氨起着关键的作用(Li等2006; Javelle
等 2008)。同样, 高等植物中铵转运蛋白晶体结构
的变化及其相互作用, 亦是其铵吸收、转运或进行
铵解毒作用的机制(Loque等 2007)。Ludewig等
(2003)研究番茄的铵转运蛋白基因LeAMT1.1表明,
在铵转运蛋白 C端的高度保守的氨基酸突变后,
LeAMT1.1对铵的转运活性丧失, 推测AMT蛋白质
植物生理与分子生物学 Plant Physiology and Molecular Biology
植物生理学通讯 第 45卷 第 1期，2009年 1月 8 1
的结构特别是 C端的保守序列调控着铵的吸收。
2007年, Loque等和Neuhauser 等分别利用拟南芥
作为模式作物, 先后证明了AMT的C端高度保守氨
基酸与其邻近的单体相互作用调控着铵的吸收, 这
些氨基酸的突变引起AMT蛋白质的晶体构象的变
化而使其转运铵的活性丧失, 但几个突变基因在酵
母中共表达, 又因互补作用而恢复其转运铵的能
力。
1.3 铵的吸收和转运蛋白基因的表达调控 AMT表
达的转录水平强烈受到氮营养状况的调控。拟南
芥缺氮 3 d后, 根部AtAMT1;1和AtAMT1;3基因的
表达量增强; 随着氮饥饿时间的增加, AtAMT1;2和
AtAMT2;1的表达也趋向于增强(Loque和von Wiren
2004)。利用 T-DNA插入的拟南芥铵转运蛋白的
突变体研究表明, AtAMT1;1基因单突变导致高亲和
NH4+的内流(供NH4+浓度小于 250 µmol·L-1)降低
30% (Kaiser等 2002); AtAMT1;1和AtAMT1;3基因
双突变使得NH4+的吸收相对于野生型下降约70%
(Loque等 2006), 表明在高亲和的条件下, AtAMT1;1
和 AtAMT1;3对 NH4+的吸收起非常重要的作用。
AtAMT1;1的表达水平还可以表征拟南芥体内氮的
营养状况, 并依赖于氮供应水平的转录后调控
(Engineer和 Kranz 2007; Yuan等 2007)。在氮饥
饿的条件下, AtAMT1;1在根系强烈表达, 氮充足供
应时则在叶片强烈表达(Engineer和Kranz 2007)。
昼夜变化和糖水平也影响 AtAMT1;2和 AtAMT1;3
的表达水平, 而对 AtAMT1;1影响小一些(Lejay等
2003)。番茄在NO3-和低CO2处理下, LeAMT1;1和
LeAMT1;3在叶中表达量相对较高, 表明它们相应
的蛋白有可能运输光呼吸产生的NH3; 而 LeAMT1;2
则是受NH4+诱导在根系强烈表达, 加NO3- (NH4+和
NO3-混合)处理增强其表达。AMTs同源基因在水
稻中表达不同于拟南芥和番茄。S o n o d a 等
(2003a)研究发现氮饥饿 3个星期的水稻再供氮
[0.15 mmol·L-1 (NH4)2SO4、0.3 mmol·L-1 KNO3] 2 h
后, OsAMT1;1在NH4+处理下增强表达; OsAMT1;2
在NH4+诱导下根部强烈表达; OsAMT1;3是低峰度
表达, Norther印迹检测不到它的信号, 但用半定量
PCR分析发现OsAMT1;3仅在根部表达, 且缺氮表
达最强, NH4+处理其次, NO3-处理表达最弱(Li等
2006)。Kumar等(2003)研究发现, 当水稻在 10
mmol·L-1的 NH4+营养液中预处理后, 再转入 10
µmol·L-1 NH4+营养液中处理 2 d后OsAMT1;1和
OsAMT1;2的表达均明显增强, 其中OsAMT1;2的
增加量是OsAMT1;1的 50%, 但OsAMT1;3的变化
不是很明显。进一步的研究表明, 这 3个NH4+转
运蛋白的表达并不是受NH4+本身供应状况的影响,
而是受谷氨酰胺的反馈调控(Sonoda等 2003b)。油
菜的铵转运蛋白基因BnAMT1.2 在地上部表达, 它
与叶片中GS2的活性有相同的调控趋势, 在叶部供
铵时显著增加 BnAMT1.2的表达(Pearson等 2002),
而在叶部供应有机氮源谷氨酸或谷氨酰胺时表达受
图 1 高等植物铵转运蛋白的同源性分析
氨基酸序列来自 NCBI, 生物软件 DNAMAN 6.0。
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抑制。
2 植物吸收和转运硝酸盐的分子机制
在通气良好的土壤上, NO3-是植物吸收的主要
氮源。NO3-不仅是一种重要的营养物质, 还可以
作为信号物质, 负反馈调控根系的生长(Stitt和Feil
1999; Mantelin和 Touraine 2004)。最新的研究表
明, NO3-也可以直接或通过对根尖谷氨酸的抑制作
用来间接刺激主根的生长(Walch-Liu和 Forde
2008)。
2.1 高亲和和低亲和的硝酸盐转运系统 NO3-的吸
收亦是受两个不同的系统调控的, 即高亲和力转运
系统和低亲和力转运系统。当外界低NO3-浓度低
于 1 mmol·L-1时, HATS 对NO3-的内流起主要的调
节, 当外界NO3-的浓度大于 0.5 mmol·L-1时, LATS
就开始发挥作用了; HATS又分为组成型(constitutive
HATS, cHATS)和诱导型(inducible HATS, iHATS)
(Crawford和Glass 1998)。
2.2 硝酸盐转运蛋白基因的克隆和功能鉴定 NO3-
的吸收通过硝酸盐转运蛋白(nitrate transporter,
NRT), 即NRT1 (低亲和)和NRT2 (高亲和)家族的
转运蛋白调控。目前为止, 在拟南芥中发现NRT1
家族中至少有 50多个成员, NRT2家族中有 7个成
员(Okamoto等2003), 水稻NRT1家族成员更多, 至
少有 100多个, NRT2家族中发现有 6个(Araki和
Hasegawa 2006)。由于高亲和的NRT2在外界低
NO3-浓度时对NO3-吸收有积极的作用, 故NRT2家
族的成员是科研工作者研究的焦点。
NRT2是 NO3--NO2-共运蛋白(nitrate-nitrite
porter, NNP)家族, 在原核生物和真核生物中均存
在。该家族蛋白质在结构上归属于 17个转运蛋白
MFS (major facilitator superfamily)成员之一(Forde
2000), 其特点是: (1)是位于原生质膜上的膜蛋白,
一般含有 500~600氨基酸, 有 12次跨膜, 且在蛋白
质中部含有一个带电荷的亲水区域, 将跨膜域分为
6个一组的左右两部分; (2)在第 2和第 3个跨膜域
之间, 含有一个D/N-R-X-G-R-R/K保守序列; (3)在
第4个跨膜域内部含有一个在氨基酸组成上为I-X-
X-R-X-X-X-G-X-X-X-G保守序列; (4)在第 5个跨
膜域中, 含有保守氨基酸序列基元[ FY K ] -x 3 -
[ILQRK]-x-[GA]-x-[VASK]-x-[GASN]-[LIVFQ]-x1,
2-G-x-G-[NIM]-x-G-[GVTA] (Pao等1998), 其拓扑
结构中的 C端、N端以及亲水域的中心环均位于
胞质一侧。最早在低等植物衣藻中发现 3个NO3-
转运蛋白基因, 即CrNRT2;1、CrNRT2;2和CrNRT2;3。
但CrNRT2;1和CrNRT2;2不能转运NO3-, 还需要一
个辅助蛋白 CrNAR2的帮助才能转运 NO3-, 即
CrNRT2;1和CrNAR2两个蛋白一起或CrNRT2;2和
CrNAR2两个蛋白一起工作才能转运NO3- (Forde
2000)。之后, 高等植物中也克隆到 NRT2和 NAR2
基因, 例如大麦、大豆、烟草、拟南芥和水稻等
作物(图 2) (Okamoto等 2003; Ryoichi和 Hiroshi
2006; Vidmar等 2000; Yokoyama等 2001), 它们对
NO3-的吸收转录调控是相当复杂的。
2.3 硝的吸收和转运蛋白基因的表达调控 环境因
素和内部信号通过调控高亲和、低亲和的硝酸盐
转运系统来控制 NO3-的吸收(Crawford和 Glass
1998; Forde 2000; Glass等 2002)。不同的植物或
是同一植物的不同品种, 其对氮的利用能力是不一
样的。Richard-Molard等(2008)研究拟南芥的两个
品种(‘RIL282’和 ‘432’)发现, ‘432’在NO3-饥饿的
初期对NO3-更高吸收和储藏能力, 在氮供应变动的
条件下, AtNRT1.1、AtNRT2.1和 AtNRT2.4基因的
表达更高, 是 ‘RIL282’的 2~9倍。
不同的氮营养调控着NO3-转运蛋白基因的表
达从而影响着NO3-的吸收。在拟南芥中 NRT2的
7个成员在不同氮营养和其它环境因子调控下表达
不一样。Okamoto等(2003)用 1 mmol·L-1 NO3-处
理拟南芥, 通过半定量 PCR 研究根系和地上部
NRT1的 4个成员(AtNRT1.1~1.4)和 NRT2家族的 7
个成员(AtNRT2.1~2.7)的表达特性, 把它们化分为
NO3-诱导、NO3-抑制和NO3-组成型基因。AtNRT 1.1、
AtNRT2.1和AtNRT2.2暴露在 1 mmol·L-1 NO3- 3~12 h
后强烈被NO3-诱导, 之后又下降了; 相比较而言,
AtNRT2.4是中度受硝诱导了。AtNRT2.5是NO3-
抑制型的, 当暴露在NO3-的营养液时, 其表达在地
上部和地下部均强烈受到抑制。A t N R T 1 . 2、
AtNRT1.4、AtNRT2.3、AtNRT2.6和 AtNRT2.7受
NO3-影响较小, 被化分为NO3-组成型基因。特别
要指出的是, AtNRT1.1是一个双亲和的NO3-转运基
因, 组成性表达, 但NO3-营养中增强它的表达(Guo
等 2001), 并可以扮演传感器的角色, 以致NO3-刺
激侧根或主根的生长(Walch-Liu和 Forde 2008)。
AtNRT2.1定位于根细胞的质膜上, 在高亲和硝转运
系统中扮演主要角色, 它既可以把NO3-从根细胞吸
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收转运至地上部和种子(Chopin等2007a), 也影响根
系构型的发展(Remans等 2006)。因此, NRT2.1对
根的生长发育方面类似于NRT1.1也具有双重的角
色: 一方面通过间接地吸收NO3-来调控, 另一方面
在低NO3-供应情况下直接调控侧根的生长, 这与植
物体内碳氮的比例相关(Desnos 2008); 生长素也影
响着 NRT2.1基因的表达和氮素的吸收。Leblanc
等(2008) 研究油菜时发现, ACC刺激了根系的生长
和根毛的增多, 但却降低 BnNRT2.1的表达和氮素
吸收。AtNRT2.7主要在再生器官和种子的夹果中
表达, 对种子中NO3-的积累起着特殊的作用(Chopin
等 2007b)。另外, Okamoto等(2006)用 T-DNA插
入突变AtNRT3.1基因(它同源于衣藻的CrNAR2基
因)的拟南芥突变体研究发现, NO3-营养处理下在
Atnrt3.1的突变株中减弱 AtNRT1.1和 AtNRT2.1基
因的转录水平, 也降低了NO3-的内流, 说明AtNRT3.1
图 2 高等植物和低等生物的硝酸盐转运蛋白家族的同源性分析
氨基酸序列来自 NCBI; 生物软件 DNAMAN 6.0。
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对AtNRT1.1和AtNRT2.1转运NO3-时有辅助作用。
Loque等(2003)研究拟南芥NRT1;1和NiR的表达发
现, 增加介质中NO3-含量, 降低了NRT1;1和NiR的
转录水平; 另外在氮饥饿的植物中添加NO2-, NRT1;1
和NiR的转录水平强烈降低。施用NH4+-N或氨基
酸态氮, 植物中 NRT2的转录水平下调了(Zhuo等
1999)。在大麦中有 7~10个高亲和NO3-转运蛋白
(HvNRT2), 目前已经分离到 4个基因, 它们蛋白的
分子量在 54~55 kDa之间, 均是NO3-诱导型的, 有
NO3--N供应的条件下, HvNRT2基因的转录水平均
增加。而且HvNRT2是后转录调控的, 在丝氨酸作
为氮源的培养下, HvNRT2转录水平和NO3-的内流
分别降低了97%和95%, 同时也降低Glu含量却增
加了Gln的水平, 说明是Gln对HvNRT2表达起下
调作用(Vidmar等 2000)。水稻的OsNRT1基因仅
仅是表现出低亲和性, 与 AtNRT1.1双亲和性不一
致, 而且是组成性表达(Lin等 2000)。水稻也鉴定
到 4个NRT2和 2个NAR2基因(Araki和Hasegawa
2006)。OsNRT2.1和OsNRT2.2的开放阅读框完全
一致, 类似于拟南芥的 AtNRT2.1和 AtNRT2.2、大
麦的HvNRT2.1和 HvNRT2.3、番茄的 LeNRT2.1
和LeNRT2.2, 而且与它们的同源性在70%~90% (图
2)。Araki和Hasegawa (2006)的研究表明, OsNRT2.1
是NO3-诱导表达, OsNRT2.2是氮诱导表达, 缺氮均
抑制它们在根系的表达; O sN AR 2 .1 被认为是
OsNRT2.1基因的激活者, 它对NRT2基因转运NO3-
起到辅助作用, 本身并不能起到转运的作用, 所以它
与OsNRT2.1表达有一致的趋势。
3 植物氮的同化
N的同化是指NO3-还原为NH4+和NH4+同化为
各种氨基酸的过程(图3), 在这个途径中, NO3-还原
中的硝酸还原酶(NR)和亚硝酸还原酶(NiR), 以及
NH4+同化的一系列酶促反应中的 2个主要酶谷氨
酰胺合成酶(GS)、谷氨酸合酶(GOGAT), 在氮的
同化过程中起着重要的作用。在此我们主要对它
们近年来的研究作一个简单的介绍。
3.1 硝酸盐的还原及其调控 NO3-通过NR还原成
NO2-主要在细胞质中进行, 而NO2-的还原则在叶绿
体中进行, 所以一般而言NO3-的同化力在叶片中是
比较充足的(沈其荣等 2003)。
NR受转录后调控, 光照下, 细胞酸化、二氧
化碳以及蔗糖都会促使NR磷酸化状态 (无活性)去
磷酸化, 活化储备的这部分NR蛋白, 增加NR活力;
而在黑暗中, 细胞碱化、低二氧化碳条件都会促使
有活性的 NR磷酸化, 降低 NR的活力(Kaiser和
Huber 2001), 而糖信号转导途径中的重要蛋白激酶
SnRK1通过磷酸化作用调节底物NR酶的活性(谢
祝捷等 2002)。Fan等(2006)发现: 外源谷氨酰胺
(Gln)在 2 h内显著降低了硝酸还原酶活化状态, 从
而导致了细胞质NO3-增加; 此外, 在增NH4+的作用
下, 可以更大地提高NR的活性(戴廷波等 2001)。
NR的半衰期很短, 仅为几小时, 所以细胞内NR的
含量不仅决定于NR的合成速率, 还决定于NR的降
解速率。光下NR的合成高于暗中, 35S标记的NR
在暗中的降解速率快于在光下(Weiner和 Kaiser
1999)。干旱条件下, NR蛋白增加, 同时也积累了
mRNA的量(Foyer等 1998)。
高等植物中已发现有两类NR酶基因, 一个是
NADH特异性诱导的基因Nia1, 另一个为NAD(P)H
为底物而表达的基因 Nia2 (Yu等 1998; Harris等
2000)。Loque等(2003)研究拟南芥表明, NR的活
性有可能直接影响Nia1基因的表达, 同时发现NO2-
也强烈地抑制Nia1基因的转录水平, 这种影响是迅
速的、特异的和可逆的。Loppes等(1999)报道了
图 3 氮的同化过程
NR: 硝酸还原酶; NiR: 亚硝酸还原酶; GS: 谷氨酰胺合成酶; GOGAT: 谷氨酸合酶。
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不同氮素形态(各种氨基酸和无机态氮)对Nia基因
的表达的结果表明, 当培养基中存在NH4Cl的时候,
Nia基因启动子的报告基因表达很低, 但是当培养
基中缺氮或供给硝态氮、亚硝酸盐、尿素、精
氨酸和谷氨酰胺时, 该报告基因强烈表达。利用基
因芯片的分析发现在低浓度(250 µmol·L-1)和高浓度
(5~10 mmol·L-1)硝态氮处理中, 强烈诱导 Nia基因
表达(Wang等2000), 且已经在Nia基因的上游发现
了很多受光调控的基序, 比如在菠菜中发现硝酸还
原酶基因 Nia上游的 TAGATc, 它的结合因子是
NIT2 Zn-finger 蛋白(Rastogi等 1997); 衣藻NR的
基因上游 cAAGGGTTCcAA也是受光调控诱导表
达 Nia1基因的基序(Navarro等 2005)。
3.2 铵的同化及其调控 NH4+同化中的GS有两种
同工酶, 即分别定位于胞质和叶绿体的GS1和GS2
(Ochs等 1999; Tobin和Yamaya 2001), 分别执行不
同的生理功能。位于叶绿体中的GS2的主要功能
是把叶绿体和光呼吸再合成的NH4+合成为谷氨酰
胺(Gln), 而处在根中的GS1则主要是参与根部氮的
合成, 但同时 GS2也参与这一过程。
分子生物学的研究表明, 编码GS酶的基因包
括细胞质中Gln1和叶绿体中Gln2基因, 它们有不
同的表达模式(Ochs等 1999)。Gln1主要是在根表
达, 不受光调控, Gln2主要在地上部表达, 且受光
调控(Lam等 1995)。水稻同功酶GS1包含两个基
因: OsGLN1;1 和OsGLN1;2, 它们在根中都有丰富
的表达, 且在氮缺乏的条件下, OsGLN1;1在皮层、
外皮层和内皮层大量地积累, 而OsGLN1;2只在一
些小细胞层中丰富表达; 且 NH4+处理的条件下,
OsGLN1;1和OsGLN1;2在根系伸长区的中柱中也
被诱导表达(Ishiyama等 2004)。最新的研究表明,
水稻的一个核蛋白OsACR9扮演着Gln传感器的角
色, 调控着Gln响应与氮同化相关的基因(Kudo等
2008)。
Gln1在所有的器官中都能检测到, 衰老的器官
Gln1基因的表达更强, 且不同Gln1基因的时空分
布也不同, 说明GS1的同工酶在氮的代谢中可能存
在不同的生理角色(Teixeira 等 2005)。水稻的
Gl n1; 1 对从衰老的器官再转运氮, 和 NADH -
GOGAT1对从发展的器官再利用氮分别起着关键
的作用(Tabuchi等 2007)。另外, 采用GUS报告基
因检测发现, Fd-GOGAT的表达在烟草幼嫩叶片比
衰老叶片更高, 且主要定位于叶脉中, 说明它利用
谷氨酸去合成和转运各种氨基酸方面起着重要的作
用(Masclaux-Daubresse等 2006)。值得关注的是,
GS酶的活性和其基因的转录表达特性对氮肥的利
用率密切相关(Lea和Azevedo 2007)。用一个根特
异性的启动子与大豆GS酶的一个基因Gln1;5融合
过量表达的植株研究表明, 根系GS酶的活性增加,
且植株的生物量和氮含量也显著增加, 分别比野生
型增加 17%和 54% (Fei等 2006)。GS酶也是高效
植物绿色组织中NH4+的解毒的关键因子(Flores等
2004)。Scarpeci等(2007)在研究营养状态对即将
成熟的小番茄GS水平调节作用时发现: 标准的营
养状态下, Gln2主要在绿色的果实中表达, 而在红
色的果实中检测不到, 在高营养时, 红色的果实中
GS的活性主要是决定于Gln1转录表达的增强, 这
就可能为同化额外氮提供了条件。
4 结语
采用分子生物学的手段, 已经克隆到多个铵、
硝转运蛋白基因和与它们还原同化相关的基因, 并
对其结构、功能和表达调控等方面进行了初步的
研究。但不同作物和同一作物的氮吸收和利用中
还有许多与氮的转运和同化相关的基因尚末被鉴定
和认识, 且目前的研究多集中于模式植物拟南芥上,
故农作物的氮转运蛋白基因和氮还原同化相关的基
因的鉴定, 表达和调控机制研究将是以后研究的重
点。水稻作为中国乃至世界的主要粮食作物, 全基
因组序列已经测序完成, 因此利用水稻作为模式作
物去研究植物吸收和代谢相关基因结构功能特性和
调控机制, 探究其可能参与的信号转导及与植物形
态构型的关系, 更深入地理解作物吸收和利用氮素
的机理, 将为从生物学的途径来改良品种, 提高作
物的产量和氮肥的利用率奠定基础。
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