全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 4期，2009年 4月 367
收稿 2009-01-09 修定 　2009-03-25
资助 国家自然科学基金(30 6 71 0 8 2)。
* 通讯作者(E-mai l : zgnlu ck 1 @1 6 3 .com; Tel : 0 3 79 -
6 4 2 8 2 3 4 0 )。
骆驼刺发根农杆菌转化系的原生质体培养和植株再生
张改娜 1,2, 贾敬芬 2,*
1河南科技大学农学院, 河南洛阳 471000; 2西北大学生命科学学院, 西安 710069
提要: 从发根农杆菌A4转化的荒漠植物——骆驼刺毛状根愈伤组织中分离的原生质体培养的结果表明, 酶解新转代7~10 d
的淡黄色松软愈伤组织, 可获得大量有活力的原生质体。原生质体在附加有1.5 mg·L-1 2,4-D、0.2 mg·L-1 6-BA、0.3 mol·L-1
甘露醇、2% (W/V)蔗糖和 500 mg·L-1水解酪蛋白的DPD培养基中进行液体浅层培养可持续分裂。培养基的最适渗透压为
(450±3) mOsm·kg-1, 原生质体的最适植板密度为4×105个·mL-1。制备原生质体的愈伤组织以低温(4 ℃)预处理后, 原生质体
的产率和分裂频率均提高, 分裂频率最高可达 50%。原生质体分裂形成的愈伤组织转移在附加1~2 mg·L-1 6-BA (或KT)和
0.2 mg·L-1 NAA的MS培养基上培养后, 可以分化并获得再生植株。纸电泳检测表明, 原生质体再生的愈伤组织和分化植
株仍然含有毛状根转化系的特异产物——冠瘿碱。
关键词: 骆驼刺; 发根农杆菌A4转化系; 原生质体培养
Protoplast Culture and Plantlet Regeneration from Cell Line of Agrobacterium
rhizogenes A4-transformed Alhagi pseudalhagi Desv
ZHANG Gai-Na1,2, JIA Jing-Fen2,*
1College of Agriculture, Henan University of Science and Technology, Luoyang, Henan 471000, China; 2School of Life Science,
Northwest University, Xi’an 710069, China
Abstract: The protoplasts were isolated from calli which were induced from hairy root segments of Agrobacterium
rhizogenes A4-transformed Alhagi pseudalhagi. After cultured in the DPD medium supplemented with 1.5
mg·L-1 2,4-D, 0.2 mg·L-1 6-BA, 0.3 mol·L-1 mannitol, 500 mg·L-1 casein hydrolysate (CH) and 2% (W/V) sucrose,
the protoplasts underwent sustained divisions and formed calli. The protoplast density of 4×105 mL-1 and (450±3)
mOsm·kg-1 osmotic pressure in culture medium were proved to be appropriate for obtaining higher division
frequency of protoplasts. A lot of protoplasts could be obtained by the enzymatic hydrolysis of yellowish
subcultured calli after cultured on MS medium supplemented with 1.5 mg·L-1 NAA, 1.0 mg·L-1 6-BA, 500 mg·L-1
CH and 2% (W/V) sucrose for 7–10 d. Lower temperature (4 ℃) pretreatment of subcultured calli enhanced
ratios of protoplast isolation and subsequent divisions. The division frequency of protoplasts was about 50%.
After transferred on the MS medium added with 1–2 mg·L-1 6-BA (or KT) and 0.2 mg·L-1 NAA, the protoplast-
derived calli differentiated and formed the regenerated plantlets. Paper electrophoresis analysis indicated that the
protoplast-derived calli and regenerated plantlets still contained special product––opine in transgenic root hairs.
Key word: Alhagi pseudalhagi; Agrobacterium rhizogenes A4-transformed cell line; protoplast culture
骆驼刺是一种耐盐抗旱性很强的半灌木豆科
植物, 在干旱荒漠区广泛分布(董志国 2000), 骆驼
刺原生质体的培养尚未见报道。我们研究室曾成
功地获得了高效的骆驼刺离体再生体系(步怀宇等
2000a)和发根农杆菌A4转化的骆驼刺毛状根转化
系, 并再生植株(步怀宇等 2000b)。发根农杆菌转
化系再生能力较强, 是很好的体细胞杂交材料; 且
具有激素自主型生长和产生特异产物——冠瘿碱
等特征, 可为远缘体细胞杂交提供筛选和鉴别标
记。本文以骆驼刺的毛状根转化系诱导的愈伤组
织为材料, 从中分离的原生质体持续分裂后, 获得
的愈伤组织长成完整的再生植株, 从而为将骆驼刺
的耐盐抗旱性状通过体细胞杂交技术转移到其它牧
草中的遗传操作建立了实验基础。
材料与方法
取我们研究室离体再生骆驼刺 ( A l h a g i
pseudalhagi Desv)的茎切段(0.5 cm)与发根农杆菌
植物生理学通讯 第 45卷 第 4期，2009年 4月368
共培养获得的毛状根, 切成 0.5 cm左右的小段, 接
种到附加 1.5 mg·L-1 NAA、1.0 mg·L-1 6-BA、500
mg·L-1水解酪蛋白(CH)、3%蔗糖和 0.65%琼脂粉
的MS培养基上, 诱导愈伤组织。经继代培养 4次
后获得质地疏松的淡黄色微粒状愈伤组织, 用于制
备原生质体。
将转代培养 8~12 d之间的松软的淡黄色愈伤
组织在 4 ℃条件下分批处理 0、3、5、8、10 h, 各
取 2 g, 按照张改娜等(2006)文中方法分离与纯化
原生质体。
将以低温处理5 h的愈伤组织获得的纯化的原
生质体悬浮于附加不同植物生长物质和渗透压的
DPD液体培养基(Durand等1973)中, 调整其密度至
4×105个 ·mL-1, 置入直径 6 cm的灭菌培养皿中, 每
皿放 2 mL。于(25±2) ℃、黑暗下进行液体浅层
培养。每天轻轻摇动培养皿 2次。定期观察培养
过程中原生质体的生长分裂状况。试验比较了不
同植物生长物质和渗透压对原生质体培养的影响;
并在附加成分均为 1.5 mg·L-1 2,4-D、0.2 mg·L-1
6-BA、500 mg·L-1 CH、2%蔗糖和 0.3 mg·L-1甘
露醇条件下, 还比较了B5培养基(Gambory等1968)
和DPD培养基对原生质体培养的影响。培养过程
中每隔 10 d向每个培养皿中添加 0.5 mL新鲜培养
基, 直至出现肉眼可见的大细胞团。相对分裂频率
以培养 15 d时发生分裂的原生质体数占植板的存
活原生质体总数的百分数表示。每次随机检查 20
个视野。每个处理至少重复 3次。原生质体的活
力用酚臧花红染色法(Widholm 1972)检查。
将原生质体分裂形成肉眼可见的小细胞团转
入不加外源生长物质的MS培养基上进行扩增, 以
获得大量的愈伤组织。为了诱导分化, 还将获得的
愈伤组织转移到含 2,4-D、6-BA、NAA、GA3和
KT等不同生长物质组合的MS固体培养基上, 在
(25±2) ℃、120 μmol·m-2s-1光照强度、光照 12 h·d-1
的条件下诱导苗的分化。获得再生幼苗后, 转至含
0.1 mol·L-1 NAA的MS培养基中诱导生根。将含
完整植株的培养瓶打开盖子, 移入空气湿度为
60%、温度 28 ℃的人工气候室炼苗 7 d, 然后移栽
到花盆土中。
参考Ohara等(2000)的方法检测转化组织中特
异产物甘露碱的存在, 以未经转化的正常愈伤组织
为对照。取 1 g待测的组织在 1 mL 0.1 mol·L-1的
HCl中研磨, 以 1 000×g离心 10 min, 取 10 µL上清
液点样于新华 1号滤纸上, 在 400 V条件下电泳 50
min。电泳时的缓冲液为甲酸:乙酸:水 =30:60:90
(V /V /V )。电泳结束后, 取出滤纸吹干, 以碱性
AgNO3法染色(Wang等 2001)并照相。
结果与讨论
1 毛状根转化系的愈伤组织生长状态与原生质体
产率的关系
用于制备原生质体的愈伤组织状态对原生质
体的产率和活力有很大影响。毛状根切段在含2,4-D
的MS培养基上诱导的初始阶段, 其愈伤组织质地
坚硬, 且愈伤组织细胞中含有大量的淀粉颗粒, 分
离的原生质体量很少。但在附加NAA (1.5 mg·L-1)
和6-BA (1 mg·L-1)的MS培养基上经过多次继代培
养后, 转化系的愈伤组织逐渐变成淡黄色颗粒状, 淀
粉粒大量减少, 具有胚性愈伤组织的特征。实验发
现该状态的愈伤组织是分离原生质体的适宜材料。
愈伤组织转入新鲜的同一种培养基上后, 取材时间
对分离原生质体的效果至关重要。图 1结果显示,
转代后生长 10 d左右的愈伤组织分离原生质体的
产量较高, 每克鲜重愈伤组织可分离出 3×106个原
生质体, 有活力的原生质体在 80%以上。这可能
是由于这一阶段的愈伤组织处于旺盛生长时期和细
胞处于增殖期所致。而转入新培养基生长时间较
短或生长时间较长(15 d以上)的愈伤组织, 其分离
图 1 骆驼刺发根农杆菌转化系愈伤组织相对
生长量与原生质体产量的关系
Fig.1 Relationship between calli relative growth and
protoplast yield in cell line of A. rhizogenes
A4-transformed A. pseudalhagi
植物生理学通讯 第 45卷 第 4期，2009年 4月 369
原生质体的产率都较低。这表明, 只有处于旺盛增
殖期的愈伤组织才能分离出大量的原生质体。
2 转化系毛状根愈伤组织的低温预处理与其原生
质体分裂的关系
未经处理的毛状根转化系诱导的愈伤组织分
离出来的原生质体数量很少, 分裂频率也不高, 但
愈伤组织经过一定的低温处理分裂频率明显提高。
从表 1可以看出, 4 ℃处理 3~8 h的愈伤组织, 其分
离的原生质体第一次分裂的启动时间虽然晚了一
些, 但分裂频率都明显提高, 其中处理 5 h的分裂
频率为最高, 可达到 45.7%。未经低温处理的或处
理时间过长(10 h), 其分离的原生质体, 分裂频率明
显较低。
渗透压, 比较了不同渗透压下原生质体存活状况和
分裂频率。表 2结果表明: 骆驼刺转化系的原生质
体在渗透压为430~700 mOsm·kg-1的范围内均可以
存活和分裂。渗透压为(540±3) mOsm·kg-1时, 分
裂频率最高(45.3%)。渗透压小于 430 mOsm·kg-1时,
转化系的一部分原生质体破裂, 存活率和分裂频率
明显较低。而渗透压高于 700 mOsm·kg-1, 多数原
生质体皱缩, 存活率很低。可见, 细胞内外的渗透
压值保持一定的平衡程度, 也是保证原生质体高存
活率和分裂频率的一个必需条件。
表 1 低温预处理对骆驼刺发根农杆菌转化系愈伤
组织原生质体分裂频率的影响
Table 1 Effects of low temperature pretreatment of hairy root
calli on the division frequency of protoplasts in cell line of
A. rhizogenes A4-transformed A. pseudalhagi
预处理 原生质体 第一次分裂 原生质体
时间 /h 活力 /% 起始时间 /d 分裂频率 /%
0 29.1±2.8 2 21.8±0.9
3 44.8±1.3 4 29.2±1.2
5 78.3±3.3 4 45.7±1.7
8 71.4±2.7 6 39.6±1.1
1 0 39.8±1.9 6 16.2±1.1
　　预处理温度为 4 ℃, 培养第 10 天的分裂频率。
表 2 不同渗透压对原生质体分裂频率的影响
Table 2 Effects of different osmotic pressures on
protoplast division frequency
甘露醇浓度 / 渗透压 / 存活率 / 分裂频率 /
mol·L-1 mOsm·kg-1 % %
0.2 430±3 11.1±3.4 4.1 (多数破裂)
0.3 540±3 79.8±2.7 45.3
0.4 610±3 70.5±4.7 34.8
0.5 700±3 19.8±3.6 11.8 (多数皱缩)
3 基本培养基对转化系愈伤组织原生质体分裂频
率的影响
培养基是维持离体细胞生活和生长最基本的
营养条件。原生质体是脱壁的细胞, 一般来说, 其
所用培养基的营养成分比植物组织或细胞培养所用
的培养基要丰富。我们在附加物相同的条件下, 比
较B5和DPD两种基本培养基对原生质体培养影响
的结果表明: 在用液体浅层培养到第10天时, B5培
养基中极少有原生质体分裂, 大部分细胞破碎死
亡。DPD培养基中原生质体的相对分裂频率大约
为 45%。显示DPD培养基更适合于骆驼刺原生质
体的培养。
4 培养基渗透压对原生质体分裂频率的影响
在培养基中其它成分相同的条件下, 采用附加
不同浓度的甘露醇, 用Vapro的Pression Osmometer
仪(德国 Eppendorf公司)渗透压计测量了培养基的
5 原生质体的分裂及其愈伤组织的形成和分化
原生质体在附加 1.5 mg·L-1 2,4-D、0.2 mg·L-1
6-BA、0.3 mol·L-1甘露醇、2% (W/V)蔗糖和 500
mg·L-1 CH的DPD培养基中, 起始时间培养密度为
4×105个 ·mL-1, 培养 5~6 d后开始出现第一次分裂
(图 2-a、b)。原生质体的一次和二次分裂都有对
称分裂、不对称分裂和出芽现象。不对称一次分
裂产生两个不等细胞(图 2-c)。出芽分裂很少能持
续分裂形成细胞团。二次分裂也有多种情况, 对称
分裂产生的两个等大细胞, 有同步(图 2-d), 也有不
同步分裂(图 2-c)。典型的二次分裂中, 第二次分
裂垂直进行, 但也存在平行分裂, 产生一串细胞(图
2 - f )。
原生质体培养 3周后可形成小细胞团(图 2-
h)。持续分裂形成肉眼可见的小愈伤组织。此时
将培养物移至 40 μmol·m-2·s-1光下培养, 可进一步
形成结构紧密的胚性愈伤组织(图 2-i)。胚性愈伤
组织扩增培养后, 转至不同生长物质组合的MS培
养基(表 3)上, 培养一段时间(25 d)后, 在 6-BA (1~2
mg·L-1)与NAA (0.2 mg·L-1)组合和KT (2 mg·L-1)与
NAA (0.2 mg·L-1)组合中, 逐渐由淡黄绿色变为深绿
色, 并有许多芽点和少许幼芽出现(图 2-j)。在培养
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基中加入 0.1 mg·L-1 GA3, 愈伤组织的分化率可显
著提高。再生幼苗在不附加任何生长物质的1/2MS
图 2 骆驼刺原生质体培养
Fig.2 Protoplast culture of A. pseudalhagi
a: 骆驼刺愈伤组织游离的原生质体; b: 骆驼刺原生质体的对称分裂; c: 原生质体一次对称分裂后的不同步分裂; d: 原生质体一次
对称分裂后的同步分裂; e: 原生质体一次不对称分裂后的同步分裂; f: 原生质体平行分裂; g: 原生质体不对称分裂; h: 肉眼可见的小愈
伤组织; i: 原生质体细胞来源的愈伤组织; j: 原生质体来源愈伤组织分化的芽; k: 原生质体来源的骆驼刺转化系再生植株。
生根培养基上培养50 d后, 经炼苗移栽至土中成活
(图 2-k)。
表 3 不同植物生长物质组合对愈伤组织分化的影响
Table 3 Effects of different plant growth substances on callus differentiation
植物生长物质 /mg·L-1 接种愈伤 分化愈伤
芽的分化率 /%
6-BA KT NAA GA3
组织数 /块 组织数 /块
1 0 0.2 0 6 7 8 11.94
1 0 0.2 0.1 8 2 2 9 35.37
1 0 1.0 0 8 6 2 0 23.26
2 0 0.2 0 8 2 17 (弱) 20.73
2 0 1.0 0 9 4 10 (玻璃化苗) 10.64
0 2 0.2 0 9 0 2 3 25.56
0 2 0.2 0.1 8 6 2 6 30.23
0 4 0.2 0 8 0 0 0
　　基本培养基: MS+3%蔗糖 +0.7%琼脂, pH 5.8~6.2。
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最后, 我们还检测了冠瘿碱, 以纸电泳检测农
杆碱和甘露碱合成酶活性的结果表明, 经发根农杆
菌转化愈伤组织制备的原生质体再生的愈伤组织中
能检测出农杆碱和甘露碱, 未经根癌农杆菌转化的
骆驼刺愈伤组织中则未检测到冠瘿碱(图 3)。这表
明发根农杆菌A4的 Ri T-DNA在骆驼刺原生质体
形成的愈伤组织中可稳定遗传。
参考文献
步怀宇, 贾敬芬, 郝建国(2000a). 骆驼刺高效离体植株再生体系
图 3 纸电泳图谱
Fig.3 Paper electrophoretic pattern
0: 未经根癌农杆菌转化的骆驼刺愈伤组织; 1 : 发根农杆菌
转化系形成的愈伤组织; 2 : 经发根农杆菌转化愈伤组织制备的
原生质体再生的愈伤组织; M: 甘露碱。
的建立. 西北大学学报(自然科学版), 30 (6): 505~508
步怀宇, 景建洲, 郝建国, 贾敬芬(2000b). 不同理化因子对发根农
杆菌 Ri质粒转化骆驼刺的影响. 西北植物学报, 20 (4): 577~
584
董志国(2000). 干旱荒漠区骆驼刺的经济价值及其利用. 塔里木
农垦大学学报, 12 (3): 58~60
谷文英, 维纳汗, 周建民, 哈地夏, 萨利娜(1997). 骆驼刺下胚轴
组织培养和植株再生研究. 草业科学, 14 (3): 32~33
张改娜, 王瑛华, 王学仁, 何涛, 郝建国, 贾敬芬(2006). 鹰嘴紫云
英甲硫氨酸抗性系原生质体培养及植株再生. 分子细胞生物
学报, 39 (3): 191~197
Durand J, Potrykus I, Donn G (1973). Plants from protoplasts of
petunia. Z Pflanzenphysiol, 69: 26~34
Gambory OL, Miller RA, Ojima K (1968). Nutrient requirements
of suspension cultures of soybean root cells. Exp Cell Res,
50: 151~158
Ohara A, Akasaka Y, Daimon H, Mii M (2000). Plant regenera-
t io n f ro m h a i r y r oo t s in d u c e d b y in fec t io n w i t h
Agrobacterium rhizogenes in Crotalaria juncea L.. Plant Cell
Rep, 19: 563~568
Widholm JM (1972). The use of fluorescein diaceta te and
phenosafranine for determining the viability of cultured cells.
Stain Technol, 47: 189~194
Wang YM, Wang JB, Luo D, Jia JF (2001). Regeneration of plants
from callus tissues of hairy roots induced by Agrobacterium
rhizogenes on Alhagi pseudoalhagi. Cell Res, 11: 279~284