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组织培养导致的草莓DNA 甲基化变异



全 文 :植物生理学通讯 第 46 卷 第 8 期, 2010 年 8 月 797
收稿 2010-04-23 修定  2010-05-27
资助 国家自然科学基金(30671432)和辽宁省优秀人才支持计
划项目(RC-04-07 )。
* 通讯作者(E-mail: zhang_sau@163.com; Tel: 024-88487143)。
组织培养导致的草莓DNA甲基化变异
韩柏明, 赵恺, 李贺, 高秀岩, 张志宏 *
沈阳农业大学园艺学院, 沈阳 110866
提要: 以草莓品种 ‘丰香 ’和 ‘全明星 ’为材料, 用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术研究组织培养对草莓DNA甲基化的
影响。结果表明, 与普通苗相比, 组织培养导致草莓试管苗的DNA甲基化水平下降, 甲基化模式的变异以去甲基化为主。
组织培养导致的DNA甲基化变异不稳定, 在田间无性繁殖过程中, 试管苗的无性繁殖后代DNA甲基化水平逐渐升高, 仅
部分变异的甲基化模式能够在试管苗的无性繁殖后代中稳定传递。两个品种之间, 组织培养对DNA甲基化变异程度的影
响不同。
关键词: 草莓; 组织培养; 甲基化; MSAP
DNA Methylation Variation Induced by Tissue Culture in Fragaria ananassa
Duch.
HAN Bai-Ming, ZHAO Kai, LI He, GAO Xiu-Yan, ZHANG Zhi-Hong*
College of Horticulture, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China
Abstract: Methylation sensitive amplified polymorphism (MSAP) was used to assess the DNA methylation
variation in Fragaria ananassa cvs. ‘Toyonoka’ and ‘Allstar’ during the process of tissue culture. The results
showed that the methylation levels were lower in micropropagated plants than in conventionally propagated
runner plants (control), and that demethylation was the main DNA methylation alteration pattern. However, the
variation induced by tissue culture was not constant. The methylation levels in the asexual descendants of the
micropropagated plants increased gradually in the field. In the asexual reproduction descendants, only part of
the variation in the methylation pattern which was induced by tissue culture could be inherited from micropropagated
plants. The effect of tissue culture on the variation level of methylation was different between the two straw-
berry cultivars. There might be correlation between the phenotypic characteristics of strawberry plants derived
from in vitro and the DNA methylation variation.
Key words: Fragaria ananassa; tissue culture; methylation; MSAP
DNA甲基化作为一种主要的表观遗传修饰, 在
高等植物基因组中普遍存在。它在调控基因表
达、基因组印记、抑制转座子活性和保持基因组
稳定等方面起着重要的作用(Finnegan 等 1998)。
近年来的研究表明, 生物和非生物逆境能导致高等
植物 DNA甲基化发生变异(潘雅姣等 2009; Sha 等
2005)。组织培养打破了植物正常的生长环境和发
育途径, 因此可视为一种逆境条件。在一些植物上
的研究已经表明, 组织培养可诱导DNA甲基化的变
异(Kaeppler 和 Phillips 1993)。
近年来, 随着植物组织培养技术的发展, 草莓
组织培养苗在生产中开始大量应用。关于草莓组
织培养苗及其后代在田间的表现已有一些报道, 研
究发现, 与普通苗相比, 在生长势、花果特性、产
量、匍匐茎抽生数量以及抗病性等方面草莓组织
培养苗及其后代都存在一定程度的变异(Swartz等
1981; Kinet 和 Parmentier 1989; 张馨宇等 2006)。
但关于组织培养过程诱导的草莓组织培养苗DNA
甲基化变异的研究还鲜有报道(Chang 等 2009), 而
DNA甲基化变异很可能是导致草莓组织培养苗表
型性状变异的一种原因, 因此本文选用来源于日本
系品种和美洲系品种的两个草莓主栽品种 ‘ 丰香 ’
和 ‘ 全明星 ’ 为材料, 应用甲基化敏感扩增多态性
(methylation sensitive amplified polymorphism,
植物生理学通讯 第 46 卷 第 8 期, 2010 年 8 月798
MSAP)技术比较了组织培养苗及其后代与普通苗在
甲基化水平和模式上的差异, 揭示了组织培养导致
的草莓基因组DNA甲基化变异的模式, 为草莓组织
培养苗在生产中的应用提供理论依据。
材料与方法
以草莓(Fragaria ananassa Duch.)主栽品种
‘ 丰香 ’ (‘Toyonoka’)和 ‘ 全明星 ’ (‘Allstar’)作为试
材。把未经组织培养的草莓植株定义为普通苗, 作
为对照。2006 年 6 月,每个品种选 9 株生长健壮
的普通苗剥取匍匐茎, 采用常规方法进行清洗和消
毒。从匍匐茎上剥取 0.3~0.5 mm 大小的生长点,
然后接种在草莓茎尖培养基(MS+0.5 mg·L-1 6-BA+
0.2 mg·L-1 GA3)上, 茎尖分化成苗后在MS+0.5 mg·L-1
6-BA+0.2 mg·L-1 GA3+0.02 mg·L-1 IBA 培养基上进
行增殖继代培养, 分别建立 9个组织培养微繁殖无
性系。茎尖分化成苗后定义为组织培养试管苗(试
管苗), 进行常规继代保存和扩繁。2007年 3月, 每
个无性系生根的试管苗一部分移栽到日光温室进行
驯化, 同时取另一部分试管苗幼嫩叶片保存到超低
温冰箱用作DNA提取的材料。由生根的试管苗在
温室内经过2个月的驯化移栽成活后定义为组织培
养原种苗(原种苗), 此时取原种苗叶片保存到超低
温冰箱用作DNA提取的材料。由原种苗在田间一
个生长季里,通过匍匐茎繁殖出的子苗定义为组
织培养一代苗(一代苗); 同理, 由一代苗繁殖出的
匍匐茎子苗定义为组织培养二代苗(二代苗)。一
代苗和二代苗分别于 2007年 9月和 2008年 9月定
植于白色塑料花盆内, 花盆内径 18 cm, 高 20 cm,
栽培基质为人工混合基质, 在日光温室内进行半促
成栽培。分别于 2008 年 3 月初和 2009 年 3 月初
草莓开花期, 取生长良好的一代苗和二代苗幼嫩叶
片保存到超低温冰箱用作DNA提取的材料。作为
对照的普通苗, 其繁殖、栽培管理和取样采用与一
代苗和二代苗相同的方式。每个品种随机选取 2
个无性系, 提取试管苗及其相对应的原种苗、一代
苗、二代苗和普通苗叶片的总DNA用于MSAP分
析用。
DNA 提取采用新型植物基因组提取试剂盒
(TIANGEN)完成。
MSAP 分析参照 Xiong 等(1999)的方法, 并做
适当修改。用对DNA甲基化敏感的HpaII和MspI
同裂酶分别与EcoRI组合对样本DNA进行双酶切,
然后在酶切片段的两端, 分别加上与 Ec oRI 和
HpaII-MspI酶切位点互补的人工接头(表1)。DNA
酶切和连接反应一步完成。酶切和连接产物按
表 1 所示引物进行预扩增和选择性扩增。选择性
扩增产物变性后采用 4% 聚丙烯酰胺凝胶电泳, 银
染法显色。
在2009年2~5月间, 参照赵密珍(2006)和邓明
琴(1990)的方法, 对栽培在日光温室的草莓组织培
养苗的生长势和开花结果性状进行调查。
实验结果
1 草莓组织培养苗DNA甲基化水平的变异
同裂酶 HpaII 和 MspI 识别并切割位点均为
CCGG, 但二者随该位点胞嘧啶甲基化状态不同而
敏感程度有所不同。HpaII 和 MspI 都能识别并切
表 1 接头和引物序列
Table 1 Adapter and primer sequences
接头和引物 EcoRI (E) HpaII/MspI (HM)
接头 1 5-CTCGTAGACTGCGTACC-3 5-GACGATGAGTCCTGAG-3
接头 2 5-AATTGGTACGCAGTC-3 5-CGCTCAGGACTCAT-3
预扩引物 5-GACTGCGTACCAATTC-3 (E00) 5-GATGAGTCCTGAGCGG-3 (HM00)
选扩引物 E00+AAC (E31); E00+AAG (E32); HM00+CAA (HM01); HM00+CAC (HM02);
E00+ACC (E33); E00+ACG (E34) HM00+CAG (HM03); HM00+TAA (HM04);
HM00+TCC (HM05); HM00+CAT (HM06);
HM00+CTA (HM07); HM00+CTG (HM08);
HM00+CTC (HM09); HM00+TTC (HM10);
HM00+CAA (HM11)
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割非甲基化位点; HpaII 能识别并切割半甲基化即
仅单链发生甲基化的位点; MspI 能识别并切割内
侧胞嘧啶甲基化(CmCGG)的位点, 而对外侧胞嘧啶
甲基化(mCCGG)的位点无活性。当 HpaII 和 MspI
与EcoRI分别组合进行酶切, 经PCR反应所扩增出
的多态性片段就能反映出该位点的甲基化水平和状
态。如表 2 所示, 将酶切产物的扩增条带划分为 4
种类型: 类型I, 两条泳道均有带, 无甲基化发生; 类
型 II, HpaII有带而MspI无带, 单链DNA外部甲基
化; 类型 III, HpaII 无带而 MspI 有带, 双链 DNA内
部甲基化; 类型 IV, 两条泳道均无带, 双链DNA的
外部甲基化。通过比较 H/M 双泳道的带型, 可得
出不同样本 DNA 甲基化状态的变化情况。
共选用 30对引物进行MSAP扩增。在草莓品
种 ‘ 丰香 ’ 中扩增总条带数为 915 条, 在 ‘ 全明星 ’
中扩增总条带数为 939 条。如表 3 所示,在两个
品种中, 甲基化条带数、甲基化条带比率以及全甲
基化条带数、全甲基化条带比率均以普通苗最高,
试管苗最低; 由试管苗在温室中驯化的原种苗中, 以
及在原种苗通过匍匐茎繁殖的后代苗即一代苗和二
代苗中, 甲基化条带数、甲基化条带比率以及全甲
基化条带数、全甲基化条带比率又逐渐增高。说
明通过组织培养, 试管苗的甲基化水平有所下降, 而
在随后的田间无性繁殖后代中甲基化水平又逐渐
增高。
2 草莓组织培养苗DNA甲基化模式的变异
为比较未经过组织培养的普通苗和经过组织
培养的试管苗、原种苗、一代苗、二代苗的甲
基化状态变化情况, 将所扩增出的条带归为三大类
10种带型(表4): A类(图1)为去甲基化带型, 即通过
表 2 不同类型条带所对应的甲基化状态和同裂酶活性
Table 2 The different bands and the correspondent methylation status and digestibility of isoschizomers
同裂酶活性和带型模式
带型 胞嘧啶甲基化状态
HpaII MspI H M
类型 I CCGG; GGCC 有活性 有活性 + +
类型 II CCGG; GGCC; CCGG; GGCC 有活性 无活性 + -
类型 III CCGG; GGCC 无活性 有活性 - +
类型 IV CCGG; GGCC 无活性 无活性 - -
  C 指甲基化; H 和 M 分别指内切酶组合 EcoRI/HpaII 和 EcoRI/MspI; - : 无带; +: 有带。
表 3 不同类别草莓苗的甲基化水平
Table 3 Methylation levels of different kinds of strawberry plants
带型 总扩增 甲基化 甲基化带 全甲基化 全甲基化带
品种和类别
条带数 条带数 比率 /% 条带数 比率 /% I II III IV
‘ 丰香 ’ 普通苗 839 1 9 4 4 1 4 915 7 7 8.4 5 8 6.3
试管苗 849 2 1 4 4 1 915 6 6 7.2 4 5 4.9
原种苗 847 1 9 4 4 5 915 6 8 7.4 4 9 5.4
一代苗 843 1 9 4 4 9 915 7 2 7.9 5 3 5.8
二代苗 841 1 9 4 4 1 1 915 7 4 8.1 5 5 6.0
‘ 全明星 ’ 普通苗 815 1 6 4 6 6 2 939 124 13.2 108 11.5
试管苗 873 1 9 4 5 2 939 6 6 7.0 4 7 5.0
原种苗 846 1 6 4 6 3 1 939 9 3 9.9 7 7 8.2
一代苗 830 1 6 4 6 4 7 939 109 11.6 9 3 9.9
二代苗 826 1 6 4 6 5 1 939 113 12.0 9 7 10.3
  总甲基化条带数 =II+III+IV; 全甲基化条带数 =III+IV, 表示双链 DNA 发生甲基化。
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组织培养, 在试管苗及其衍生的原种苗、一代苗和
二代苗发生不同程度的去甲基化作用, 包括 A1、
A2、A3、A4、A5 和 A6 等 6 种类型; B 类为甲基
化类型, 与普通苗相比, 试管苗发生重新甲基化作
用; C类为普通苗与试管苗、原种苗以及一代苗和
二代苗的甲基化模式完全相同的类型。‘ 丰香 ’ 和
‘ 全明星 ’ 两个品种所扩增的各种类型条带总数分
别为 915 和 939。其中 A 类和 B 类是多态性条带,
是组织培养导致的甲基化模式发生变异的条带, 两
个品种多态性条带数分别为 15和65,多态性条带
比例分别为 1.6% 和 6.9%。说明在组织培养过程
中绝大多数 CCGG 位点甲基化模式保持稳定。两
个品种的多态性条带中, A类条带占多态性条带的
比例分别为 93.3% 和 97.0%, 而B类条带所占多态
性条带的比例分别为 6.7% 和 3.1%, 说明组织培养
导致的甲基化模式变异主要以去甲基化为主。分
析 6种A类型条带发现, 组织培养过程导致的试管
苗去甲基化作用不稳定, 随着其在田间驯化和田间
表 4 不同类别草莓苗的甲基化模式变异
Table 4 Variation of methylation pattern in different kinds of strawberry plants
  带型 扩增条带数
类型 普通苗 试管苗 原种苗 一代苗 二代苗
‘ 丰香 ’ ‘ 全明星 ’
H M H M H M H M H M
A1 - - + + - - - - - - 3 2 8
A2 - - + + + + - - - - 4 1 6
A3 - - + + + + + + - - 2 4
A4 - - + + + + + + + + 3 1 1
A5 - - + - - - - - - - 2 3
A6 - + + + - + - + - + 0 1
B1 + + - - + + + + + + 1 2
C1 + + + + + + + + + + 837 813
C2 + - + - + - + - + - 1 9 1 6
C3 - + - + - + - + - + 4 4 4 5
  +: 有带; - : 无带; H 和 M 分别表示 EcoRI/HpaII 和 EcoRI/MspI 酶切组合。
图 1 ‘ 全明星 ’ 草莓不同类别苗的甲基化模式变异
Fig.1 Variation of methylation pattern in different kinds of ‘Allstar’ strawberry plants
A、B、C、D 分别由引物组合 E 3 2 / H M 0 9 、E 3 3 / H M 0 5 、E 3 2 / H M 0 、E 3 4 / H M 0 1 扩增得到的图谱。A 1 、A 2 、A 3 、
A4 表示 4 种 A 类带型。M: 分子量标准; H1、H2: 普通苗 EcoRI/HpaII 酶切; H3、H4: 试管苗 EcoRI/HpaII 酶切; H5、H6: 原种
苗 EcoRI/HpaII 酶切; H7、H8: 一代苗 EcoRI/HpaII 酶切; H9、H10: 二代苗 EcoRI/HpaII 酶切; M1、M2: 普通苗 EcoRI/MspI 酶切;
M3、M4: 试管苗 EcoRI/Msp I 酶切; M5、M6: 原种苗 EcoRI/Msp I 酶切; M7、M8: 一代苗 EcoRI/MspI 酶切; M9、M10: 二代苗
EcoRI/Msp I 酶切。
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无性繁殖, 大部分发生去甲基化作用的位点又被重
新甲基化, 仅少数发生甲基化模式变异的位点能够
稳定地在无性繁殖过程中传递下去。另外, 在组织
培养过程中发生的少数重新甲基化变异即 B 型带
中, 发生变异的甲基化模式在试管苗的田间驯化过
程中很快消失。
3 草莓组织培养苗的生长势变化
对草莓组织培养苗的生长势的调查结果表明,
‘丰香’二代苗的生长势略强于普通苗, 而一代苗的
生长势并未表现出强于普通苗; ‘ 全明星 ’ 一代苗和
二代苗的生长势均略强于普通苗(表 5)。
4 草莓组织培养苗的花和果实性状变异
组织培养对草莓植株的开花结果有显著的影
响(表 6)。两个草莓品种组织培养苗的单株花序
数、单株花数、单株结果数均高于普通苗, 差异
显著。与普通苗相比, 除 ‘ 丰香 ’ 一代苗外, 组织
培养苗的单株产量均表现出显著的增产。‘ 全明星 ’
组织培养苗平均单果重和一级果重均与普通苗的
差异不大; 而 ‘ 丰香 ’ 二代苗的平均单果重和一级
果重均高于普通苗, 一级果重与普通苗的差异显著,
一代苗平均单果重和一级果重均低于普通苗, 其中
平均单果重与普通苗的差异显著。
表 6 不同类别草莓苗的花和果实性状差异
Table 6 Differences of the flower and fruit characters in different kinds of strawberry plants
品种和类别 单株花序数 单株花数 单株结果数 平均单果重 /g 一级果重 /g 单株产量 /g
‘ 丰香 ’ 普通苗 1.44b 9.56b 7.73b 13.64a 25.70b 107.55b
一代苗 1.75a 11.95a 9.12a 12.26b 25.11b 110.31b
二代苗 1.85a 14.29a 9.62a 13.81a 28.22a 132.41a
‘ 全明星 ’ 普通苗 1.35b 10.41b 8.89b 13.48a 25.67a 120.14b
一代苗 2.08a 19.51a 12.49a 13.17a 25.59a 164.47a
二代苗 1.92a 18.21a 13.51a 13.04a 26.10a 175.56a
  表中同列数据后不同小写字母表示差异达 0 .0 5 显著水平。
表 5 不同类别草莓苗的生长势差异
Table 5 The growth vigor differences of different kinds of strawberry plants
现蕾期 始花期 果实转白期 果实成熟期

品种和类别 叶面积 / 叶柄长 / 株高 / 叶面积 / 叶柄长 / 株高 / 叶面积 / 叶柄长 / 株高 / 叶面积 / 叶柄长 / 株高 /
cm2 cm cm cm2 cm cm cm2 cm cm cm2 cm cm
‘ 丰香 ’ 普通苗 14.22a 4.10a 6.91ab 48.87a 14.22a 20.39a 50.02a 15.89ab 22.43ab 41.21a 14.23a 23.26b
一代苗 13.67a 3.66a 6.67b 47.91a 13.56a 18.89a 48.68a 14.77b 21.22b 40.14a 14.11a 22.87b
二代苗 14.36a 4.01a 7.81a 50.92a 14.89a 21.85a 52.33a 16.97a 24.65a 44.48a 14.79a 25.62a
‘ 全明星 ’ 普通苗 6.62a 2.22a 5.56ab 30.12a 7.76a 12.33a 43.88a 10.98ab 16.25b 34.32a 10.82a 14.66b
一代苗 7.21a 2.31a 5.89b 32.41a 7.81a 12.96a 46.98a 13.18a 17.64ab 36.99a 12.95a 16.64a
二代苗 7.45a 2.54a 5.99a 33.83a 8.09a 13.51a 48.85a 13.95a 18.11a 38.11a 13.55a 16.93a
  表中同列数据后不同小写字母表示差异达 0 .0 5 显著水平。
讨  论
本文应用 MSAP 技术对草莓品种 ‘ 丰香 ’ 和
‘ 全明星 ’ 组织培养苗的甲基化变异情况进行了检
测。与普通苗相比, 组织培养苗及其后代 CCGG/
GGCC 位点甲基化修饰比例均低于普通苗。我们
的结果还表明, 随着组织培养苗在田间的驯化和无
性繁殖, 其甲基化水平又逐渐升高。这说明在组织
培养过程中发生的 DNA 甲基化变异是不稳定的。
这种变异很可能是一种对组织培养环境的适应性变
异, 当环境条件恢复后, 变异又可能会消失。在我
们的试验范围内, 经过2年对组织培养苗在田间条
植物生理学通讯 第 46 卷 第 8 期, 2010 年 8 月802
件下进行无性繁殖, 虽然大部分在组织培养过程中
发生变异的条带消失, 但小部分发生变异的甲基化
模式在田间条件下稳定地保持了 2 年。
我们在草莓上的试验结果表明, 组织培养会导
致 DNA 甲基化水平下降。关于组织培养诱导的
DNA甲基化水平的变化, 国内外的一些报道不尽
一致: 在香蕉(Peraza-Echeverria 等 2001)和豌豆
(Smykal 等 2007)上的研究表明, 组织培养导致了
DNA甲基化水平的上升; 而在大麦(Li等2007)和大
豆(Quemada等1987)上的研究结果却表明组织培养
导致了DNA甲基化水平的下降。这可能与不同的
研究者所采用的试验材料、培养基组成、外植体
类型以及外植体的培养过程有关。LoSchiavo 等
(1989)的研究表明, 不同的激素浓度和组成对培养
物DNA甲基化水平有影响。本文所使用的两个草
莓品种, 在组织培养过程中甲基化水平变异的程度
有差异, ‘全明星 ’比 ‘丰香 ’具有更高的变异率, 其
原因还有待研究。
田间对草莓组织培养苗性状表型的调查结果
表明, 草莓组织培养苗的花序数、花数和结果数显
著高于普通苗。这些表型性状的变异与草莓组织
培养苗DNA甲基化水平和模式的变异之间可能具
有一定的相关性。
DNA甲基化在调控基因表达和抑制转座子活
性上起重要作用(Finnegan 等 1998)。DNA 甲基化
水平的下降是否会导致基因表达的改变和转座子活
性的激活, 对组织培养诱导的差异片段的回收、序
列测定和功能分析等都有待进一步研究。
参考文献
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