全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (4): 566~572　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0551566
收稿 2014-11-28　　修定 2015-03-10
资助 科技部“973”项目(2012CB113906)、国家自然科学基金
(31171970和31401875)、国家科技支撑计划(2012BAD-
02B01)和大宗蔬菜产业技术体系(CARS-25-A-11)。
* 通讯作者(E-mail: nauliulw@njau.edu.cn; Tel: 025-84395563)。
大白菜钙运输基因ECA和钙响应基因CAS在缺钙胁迫下的表达分析
程涣1,2, 苏同兵2, 于拴仓2, 张凤兰2, 余阳俊2, 张德双2, 赵岫云2, 汪维红2, 卢桂香2, 龚义勤1, 柳
李旺1,*
1南京农业大学园艺学院, 南京210095; 2北京市农林科学院蔬菜研究中心, 北京100097
摘要: 以干烧心抗性显著不同的两个大白菜自交系为材料, 研究了Ca2+运输基因ECA和Ca2+响应基因CAS在缺钙处理过程的
表达变化。同源序列比对发现大白菜共有7个ECA基因和4个CAS基因; 缺钙处理后, 2个材料中的ECA基因都上调表达, 但
在抗病材料中的上调更为显著; CAS基因在缺钙处理后的表达也有显著改变, 但各个CAS基因的表达模式表现较大差异。
表明大白菜ECA和CAS基因的表达受钙胁迫影响, 并可能与大白菜苗期干烧心病的发生相关。
关键词: 大白菜; 干烧心; Ca2+; 钙信号; 基因表达
Expression Analysis of Ca2+ Transport and Response Genes, ECA and CAS, in
Cabbage under Calcium Deficiency Condition
CHENG Huan1,2, SU Tong-Bing2, YU Shuan-Cang2, ZHANG Feng-Lan2, YU Yang-Jun2, ZHANG De-Shuang2, ZHAO Xiu-Yun2,
WANG Wei-Hong2, LU Gui-Xiang2, GONG Yi-Qin1, LIU Li-Wang1,*
1College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2Beijing Vegetable Research Center, Beijing
Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing 100097, China
Abstract: In this study, a total of 7 ECA and 4 CAS genes were identified in Chinese cabbage by protein se-
quence alignment. Phylogenetic analysis of ECA and CAS genes revealed that there were great differences be-
tween genes in the each gene family, which suggested that different genes might execute different functions.
The expression of ECA and CAS genes was detected in tipburn-susceptive and resistant lines after Ca2+ deficien-
cy treatment. The results showed that ECA genes were up-regulated in both lines, and expressed at a higher lev-
el in resistant plant than in sensitive plant. However, the expression pattern of different CAS genes was not con-
sistent, which might be caused by  functional division of different CAS genes. Our study suggested the
expression of ECA and CAS was affected by calcium deficiency, and associated with  tipburn occurrence  in 
seedling of Chinese cabbage, which provided helpful information for further study the molecular mechanism of 
tipburn resistance in Chinese cabbage.  
Key words: Chinese cabbage; tipburn; calcium; calcium signal; gene expression
大白菜(Brassica pekinensis)属十字花科芸薹
属作物, 原产中国, 栽培历史悠久。近年来, 大白
菜干烧心(tipburn)病发生极为普遍, 严重影响了大
白菜的产量和品质(张鹤等2009)。大白菜干烧心
病多在莲座期和包心期开始发病, 但环境不适合
或品种抗性弱时, 在苗期也经常发生。发病初期,
叶缘出现水渍、透明等症状, 随着病情发展, 最终
表现为干枯; 干烧心病在贮藏期间仍有一定的发
展, 并易与其他腐生菌并发侵染, 诱发叶球内部发
生“干叶”、“夹叶烂”现象, 最终导致整个植株腐
烂。早期研究认为大白菜干烧心病是由于环境缺
钙引起的生理性病害; 后来研究认为引发大白菜
干烧心病的真正原因是植株对钙的吸收与利用受
阻、生长环境异常和生长不协调等因素综合作用
的结果(Aloni等1986; 石姜超等2012; 缪颖等1998;
Ho和Adams 1989; Francois等1991)。目前对干烧
心病的研究多集中在诱病因素、发病机理和田间
防控上, 但对发病的分子机理及遗传规律的研究
报道较少(孙秀峰等2008)。
钙(Ca2+)不但是植物生长发育所必需的一种
大量营养元素, 而且也是一种转导多种生理过程
程涣等: 大白菜钙运输基因ECA和钙响应基因CAS在缺钙胁迫下的表达分析 567
的胞内胞外信号分子(Gilroy和Trewavas 2001)。研
究表明, 环境缺钙和钙利用效率低是导致大白菜
干烧心病发生的重要原因之一, 是影响大白菜的
产量和品质的重要因子。钙对植物细胞的结构和
生理功能有重要作用, 能维持细胞壁、细胞膜及
膜结合蛋白的稳定性, 参与胞内稳态和生长发育的
调节过程(王瑞云和王玉国2001; Lecourieux等2006;
Ma和Berkowitz 2007); Ca2+还是植物细胞信号转导
中最重要的第二信使: 多种外界刺激都能引起胞质
Ca2+浓度的变化, 从而将外界刺激转化成植物可感
知的内部信号, 介导植物完成对环境刺激和发育信
息的感知和响应(Sanders等1999; McAinsh和Pitt-
man 2009; Dodd等2010; Kudla等2010)。
胞质Ca2+浓度的变化需要胞外的Ca2+进入细
胞质或者胞内Ca2+库的释放, 这个过程需要Ca2+泵
(Ca2+ pumps)的参与。最近研究显示, 在缺钙环境
下, 拟南芥P2A型Ca
2+泵ECA1和ECA3的敲除可导致
植物发育迟缓、叶尖死亡和叶片黄化(Wu等2002;
Mills等2008); P2B型Ca
2+泵ACA4和ACA11的敲除可
导致植物新叶生长缓慢、干边, 严重时萎蔫死亡
的典型超敏性反应(Boursiac等2010; Baxter等2003)。
上述表型与大白菜干烧心病苗期发病症状类似,
这暗示此类基因可能与干烧心发病进程相关。而
细胞内感受胞质Ca2+浓度变化的原件被称为Ca2+感
受器CAS (calcium sensor), 如CaM (钙调素)、CBL
(钙调磷酸酶B类蛋白)和CDPK (钙依赖性蛋白激
酶) (Defalco等2010)。感受器可将钙信号传递下
去, 进而实现调控基因表达以提高植物抗逆性。
不同品种的大白菜材料对干烧心病抗性存在
着较大差异。干烧心病的发生受环境影响很大, 在
田间进行大量筛选抗性比较困难, 且耗时较长。因
此在室内一般采用改良的Hoagland营养液对不同
大白菜进行苗期抗干烧心鉴定, 鉴定结果与田间
基本吻合(余阳俊等2001)。本文以干烧心病抗性
显著不同的两个大白菜高代自交系为材料, 利用
缺钙处理, 通过RT-qPCR检测, 发现Ca2+运输基因
ECA和Ca2+响应基因CAS的表达受钙胁迫影响; 并
且在抗/感两种材料中, ECA和CAS的表达模式存在
明显不同。这暗示ECA和CAS可能与大白菜苗期
干烧心病的发生相关, 为今后通过分子手段解析
干烧心发病机理提供一定的理论基础。
材料与方法
1 材料
选用对干烧心病抗性明显差异的大白菜
[Brassica pekinensis (Lour.) Rupr.]高代自交系43#
和80#为供试材料。43#为较抗干烧心自交系, 来
源于一代杂交种(F1)品种‘秦二小’ (陕西); 80#为感
干烧心自交系, 来源于一代杂交种(F1)品种‘早大
橘’ (日本); 二者均由北京市农林科学院蔬菜研究
中心白菜课题组提供。
2 材料的缺钙处理
大白菜苗期抗干烧心鉴定主要参考余阳俊等
(2001)方法。
苗期缺钙处理实验在人工气候室中进行: 首
先在铺有湿润滤纸的培养皿中催芽, 待种子露白
时播入穴盘。当幼苗长到二叶一心时, 将幼苗移
至Hoagland完全营养液中进行培养。一周后更换
Ca2+浓度不同的Hoagland营养液进行缺钙处理, 诱
导大白菜干烧心病的发生。Ca2+浓度分别为5.7、
1.71、1.14和0.57 mmol·L-1。
缺钙营养液采用不含钙的改良Hoagland营养
液配方, 即除去原配方中的Ca(NO3)2·4H2O, 同时使
总N量和原营养液基本持平: NH4NO3 2 mmol·L
-1,
KNO3 10 mmol·L
-1, NH4H2PO4 2 mmol·L
-1, 其他成
分同Hoagland营养液。
3 取样及RNA提取
缺钙处理培养2周后, 易感材料表现明显症状;
收取生长点附近的3片真叶 , 利用液氮速冻 , 置
于–80 ℃冰箱中备用。
总RNA提取使用Plant Total RNA Purification
Kit试剂盒(GeneMark), 按说明书操作。利用Nano
Drop测定RNA浓度与质量, 使用1%甲醛变性琼脂
糖凝胶电泳检测RNA的完整性。
反转录使用FastQuant RT Kit (with gDNase)试
剂盒(TIANGEN), 将RNA反转录成cDNA, 并稀释
至250 ng·μL-1备用。
4 DNA引物设计及荧光定量PCR
利用TAIR (http://www.arabidopsis.org/)获得模
式植物拟南芥Ca2+运输基因ECA1~ECA4和Ca2+响
应基因CAS, 并获得氨基酸序列; 利用BRAD (http:// 
brassicadb.org/brad/index.php)的Blastp工具获得大
白菜中相应的同源基因及其序列; 利用T-A克隆,
植物生理学报568
分别将来源于43#和80#自交系材料的ECA和CAS
基因进行全长ORF (开放阅读框)克隆和测序。利
用Primer5软件在目的基因和内参基因的保守序列
区域设计引物(表1)。
荧光定量PCR使用Roche Light Cycler® 480,
采用罗氏SYBR Green I Master试剂盒, 参照基因选
用三磷酸甘油醛脱氢酶基因 (GAPDH ) (Qi等
2010)。PCR反应体系10 μL, 包含: Master Mix (2×)
5 μL, 上游引物(10 μmol·L-1) 0.5 μL, 下游引物(10
μmol·L-1) 0.5 μL, Water PCR-grade 2 μL, cDNA 2 
μL, 每个样品设置3个重复。Real-Time PCR扩增
程序: 95 ℃预变性5 min; 95 ℃变性10 s, 60 ℃退火
12 s, 72 ℃延伸15 s, 40个循环; 在延伸步骤收集荧
光信号; 温度从65 ℃缓慢递增到95 ℃时测定熔解
曲线。数据处理利用Light Cycler 480SW软件分
析, 以GADPH作为内参对2个材料中Ca2+运输和响
应相关基因进行相对定量分析。根据2-∆∆CT法计算
各基因在2个材料中的表达差异。
实验结果
1 Ca2+缺乏可导致大白菜苗期干烧心病发生
大白菜干烧心病是植株缺钙和营养吸收障碍
的综合性病症。为进一步验证缺钙和干烧心发病
的关系, 本研究利用不同Ca2+浓度梯度的Hoagland
营养液处理苗期植株, 感病株系80#干烧心症状明
显。正常Hoagland营养液(Ca2+浓度5.7 mmol·L-1)
培养2周时, 植株能够生长正常, 无明显症状; 而不
同程度缺钙的Hoagland营养液(Ca2+浓度分别为
1.71、1.14和0.57 mmol·L-1)则会导致大白菜苗期
干烧心病的发生, 具体表现为植株叶片皱缩, 幼叶
边缘干枯失水(图1), 发病程度随着Ca2+浓度的降低
而逐渐升高, 这种负相关性表明Ca2+缺乏是导致苗
期干烧心病发病的重要原因(图1)。
2 大白菜ECA和CAS基因的获得及系统发育树分析
拟南芥ECA蛋白是Ca2+运输的关键因子, 其敲
除可导致植物新叶生长缓慢、叶片萎蔫黄化(Mills
等2008), 这与大白菜苗期干烧心病发病症状类
表1 RT-qPCR目的基因及内参基因的引物序列
Table 1  Primer sequences of target genes used in real-time PCR
基因名称 拟南芥基因编号 大白菜基因编号 引物序列(5′→3′)
GAPDH AF536826 F: CAGGTTTGGAATTGTCGAGG
R: GAGCTGTGGAAGCACCTTTC
ECA1 AT1G07810 Bra018690 F: GATTTGTTCATGCCTCCTATTTTC
R: TATGTAGTTTTTGCGTTGCATTTT
ECA2 AT4G00900 Bra037404 F: AAGGCATAAGCAAGAGATCGTTAG
R: ATCATCTGCAAGAACCATATCTGA
ECA3 AT1G10130 Bra031701 F: GGTCTTTCTGATTCTCAGGTTGAT
R: AGAAATGCTGTTAAGCCAGTCTCT
Bra019960 F: GACTGCTGGGATTCGTGTTATAG
R: CCATATCTGAAGCACTCTTTGCT
ECA4 AT1G07670 Bra031593 F: AGTCATGGTCATAACTGGAGACAA
R: TCTAGAGAACAAGATCCCTCCACT
Bra031583 F: GATGGTGATGTCTTACGTTGTTGT
R: GCGTACTCCTTTCCAATACATTCT
Bra029645 F: TCTGGCTCATCAATGTGAAATACT
R: AGAGCCAAACATGTCGTAATAACA
CAS AT5G23060 Bra037620 F: CTGTCTGGTCTGCGATATCTTTTAA
R: TACTGTTCTTAGCATTTGAAGGGAG
Bra013013 F: ACTCTTCCTCCTTCTTCTTCGTCTT
R: CTTGGTTGATTGTCTTCTCCACTTC
Bra010161 F: TGATGGATACGGAGAATATGGACAC
R: GATGGTAACAGCACGGAACGAAAT
Bra003389 F: CCAAAACCTGAGACAACACTTACCA
R: CGTCTTGTTTGAAATCTTCCGAGTC
程涣等: 大白菜钙运输基因ECA和钙响应基因CAS在缺钙胁迫下的表达分析 569
似。利用拟南芥ECA1 (AT1G07810)、ECA2 (AT4G-
00900)、ECA3 (AT1G10130)和ECA4 (AT1G07670)
基因的氨基酸序列, 通过BRAD (http://brassicadb.
org/brad/index.php)同源序列比对, 获得7个大白菜
ECA基因: ECA1同源基因Bra018690, ECA2同源基
因Bra037404, ECA3同源基因Bra031701和Bra-
019960, ECA4同源基因Bra031593、Bra029645和
Bra031583。通过DNAMAN对上述基因的氨基酸
序列进行分析, 并利用Observed Divergency方法构
建了上述基因的系统发育树(图2-A)。结果显示,
大白菜ECA基因共分成4支, 其中ECA2、ECA3和
ECA4均与相应的拟南芥同源基因聚类成小支; 支
内基因间序列相似度达到95%, 这些大白菜ECA基
因和其同源拟南芥ACA基因可能具有类似功能。
利用同样的方法, 构建了与拟南芥Ca2+响应基
因CAS (AT5G23060)同源的大白菜CAS基因系统发
育树(图2-B)。结果显示, 大白菜基因组共有4个
CAS基因, 分别是Bra013013、Bra037620、Bra-
003389和Bra010161。其中Bra013013和Bra037620
之间的同源性高达96%, 而二者与其拟南芥同源基
因AT5G2306同源性达90%, 这两个大白菜CAS基
因的功能可能与拟南芥AT5G2306基因类似。
3 Ca2+运输基因ECA在缺钙时的表达特征分析
环境缺钙和Ca2+运输、利用效率低是造成植
物缺钙的两个主要原因。本研究检测了大白菜
ECA基因在缺钙时的表达变化情况。如图3所示,
无论在抗性植株(43#)还是感病植株(80#)中, 在缺
钙处理后, 除Bra018690外, 所有ECA基因都上调表
图2 大白菜Ca2+运输基因ECA (A)和响应基因CAS (B)的系统进化树
Fig.2 Phylogenetic tree of B. pekinensis ECA (A) and CAS (B)
图1 不同程度的Ca2+缺乏导致的大白菜干烧心病发病程度
Fig.1 Different levels of Ca2+ deficiency cause tipburn disease in Chinese cabbage
植物生理学报570
达; 但抗/感材料又有明显不同, ECA基因在抗病植
株中的上调幅度要高于感病植株, 其中Bra037404、
Bra031701和Bra031583在缺钙处理后, 抗病植株的
上调表达趋势尤为明显。值得注意的是, Bra018690
和Bra037404在感病植株中几乎不表达, 而在抗病
植株正常表达。
4 Ca2+响应基因CAS在缺钙时的表达特征分析
Ca2+既是植物生长所必需的营养元素, 又是细
胞内信号转导关键的第二信使。为探讨钙信号系
统是否参与苗期干烧心病发生过程, 本研究利用
实时定量PCR分析了缺钙处理前后, 抗/感干烧心
病材料中Ca2+响应基因CAS的表达变化情况。如
图4所示, 在缺钙处理后, Bra013013、Bra037620、Bra-
003389和Bra010161的表达变化模式显著不同。在
正常培养时, Bra037620在抗性材料中的表达量远
低于感病材料; 但在缺钙处理后Bra037620在抗性
材料(43#)中的表达量几乎没有变化, 而在感病材
料(80#)中的表达则显著下调。Bra013013在缺钙
处理后, 在两种材料中都表现出明显的上调表达
模式, 但在抗性材料中的表达量低于感病材料。
Bra010161对缺钙处理不敏感, 表达量无明显变
化。Bra003389在抗性材料中对缺钙处理敏感, 但
在感病材料中处理前后表达量无明显变化。这些
结果显示Bra013013和Bra037620可能是大白菜缺
Ca2+响应的关键基因, 但其功能可能有所差异。
讨　　论
大白菜干烧心病近年来在北京、山东、河
南、河北等地频繁发生且病情严重, 在有些产区甚
至完全绝收, 严重影响了大白菜产量和质量。目前
不同大白菜主栽品种间表现出程度不同的症状, 并
且多数品种干烧心抗病能力较差, 因此抗干烧心成
为重要的育种目标之一。但目前抗干烧心抗原缺
乏, 遗传机制不清楚, 这一直是制约抗干烧心育种
的关键原因。因此探明病害发生原因、阐明发病
机理对于品种改良具有重要意义。
近年来国内外学者对于大白菜干烧心病做了
较深入的研究, 但在发病原因与机理等方面仍然有
很多争论。通常认为大白菜和甘蓝干烧心发病症
状基本类似, 都是缺钙引起的生理性病害, 也有报
道认为是由于缺锰造成的(吕佩珂等1998); 张纯胄
等(2000)通过叶面喷施微量元素方法, 发现喷施锰
肥和硼肥比钙肥防治干烧心的效果要好, 因此认为
图4 Ca2+缺乏导致大白菜抗/感干烧心病材料中Ca2+响应基
因差异表达
Fig.4 Ca2+ response genes were differently regulated in 
different materials after Ca2+ deficiency treatment
图3 Ca2+缺乏诱导大白菜抗/感干烧心病材料中钙运输基因差异表达
Fig.3 Ca2+ transport genes were differentially regulated in different materials after Ca2+ deficiency treatment
CK: 正常培养; Ca-Def: 缺钙培养; 同一序列基因各柱形上不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图4同。
程涣等: 大白菜钙运输基因ECA和钙响应基因CAS在缺钙胁迫下的表达分析 571
干烧心与缺锰有一定关系, 但缺锰并不是主导病
因, 缺水和营养吸收障碍导致代谢失调是干烧心的
主要病因; Saure (1998)认为大白菜干烧心病是由
于逆境胁迫造成的生理失调; 也有研究人员认为该
病可能是由病原菌侵染引起的, 但并未得到证实。
综上可见, 目前对干烧心的发病病因仍然存在很大
争论, 这大大限制了对干烧心发病机理的研究。本
文通过梯度缺钙处理显示, 随着培养液中Ca2+浓度
的逐渐降低, 大白菜苗期干烧心病症渐发严重, 进
一步证实缺钙是干烧心的重要原因之一。
植物组织在缺钙初期或钙供应不足时, 首先
会引起细胞膜上Ca2+-ATPase活性的迅速增加, 而
后随着缺钙程度增大, Ca2+-ATPase活性逐渐下
降。缪颖等(1999)研究了大白菜干烧心病发生过
程中酶活性的变化情况, 发现在缺钙诱导大白菜
干烧心病发生过程中, 膜Ca2+-ATPase活性发生了
一系列变化。拟南芥Ca2+-ATPase基因ECA的敲除
可导致类似大白菜干烧心发病的表型。这些结果
暗示ECA可能参与了大白菜干烧心发病进程, 而进
一步的real-time PCR检测结果证实大白菜ECA和
CAS基因的表达受钙胁迫影响, 因此这2个基因可
能与大白菜干烧心病的发生有密切关系。
大白菜与模式植物拟南芥亲缘关系较近, 极
大方便了利用拟南芥信息进行大白菜功能基因研
究。但与拟南芥相比, 大白菜基因组属复杂二倍
体, 每个基因存在着多个拷贝或同源基因, 在进化
过程中功能可能产生了分化, 这为目标基因的选
择增加了难度(Wang等2011)。在本研究中共获得7
个大白菜ECA基因和4个CAS基因, 通过比较这些
ECA和CAS基因在缺钙环境下的表达不同变化情
况, 从而推测上述基因可能参与大白菜苗期干烧
心病发病进程, 为从分子水平上深入解析大白菜
干烧心病的发病机理提供一定的理论依据。
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