全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (4): 429~435　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0489 429
收稿 2014-11-10　　修定 2015-03-23
资助 中国热带农业科学院橡胶研究所基本科研业务费专项资
金(1630022014002)、国家自然科学基金项目(31300504)。
* 通讯作者(E-mail: wmtian@163.com; Tel: 0898-23300309)。
巴西橡胶树HbMKK6基因的克隆及表达分析
吴绍华1, 陈月异1, 王建霄1,2, 田维敏1,*
1中国热带农业科学院橡胶研究所, 农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室, 省部共建国家重点实验室培育基地-
海南省热带作物栽培生理学重点实验室, 海南儋州571737; 2海南大学农学院, 海口570228
摘要: 促分裂原活化蛋白激酶的激酶(MAPKKs/MKKs)在植物应对逆境胁迫中发挥重要作用。本研究采用RACE和RT-PCR
方法, 从巴西橡胶树无性系‘热研7-33-97’的胶乳中克隆了一个MAPKK基因家族成员, 命名为HbMKK6。该基因的全长
cDNA包含65 bp的5非编码区, 316 bp的3非编码区和1 065 bp的开放阅读框, 编码一个由354个氨基酸残基组成的蛋白质。
该蛋白质分子量为39.91 kDa, 理论等电点为5.96, 含有保守的SMGQRDT (S/TxxxxxS/T)基序。实时荧光定量PCR结果表明,
HbMKK6在橡胶树的根、皮、胶乳及叶片中均有表达, 其中在叶片中的表达量最高。HbMKK6基因在橡胶树抗寒无性系
‘93-114’叶片中的表达丰度显著高于不抗寒无性系‘热垦501’, 而且在4 ℃低温下显著上调。高丰度表达HbMKK6可能与增
强橡胶树的抗寒性有关。
关键词: 巴西橡胶树; 促分裂原活化蛋白激酶的激酶; 抗寒; HbMKK6; 基因表达
Cloning and Expression Analysis of a HbMKK6 Gene in Rubber Tree (Hevea
brasiliensis)
WU Shao-Hua1, CHEN Yue-Yi1, WANG Jian-Xiao1,2, TIAN Wei-Min1,*
1Rubber Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Key Laboratory of Biology and Genetic Resources
of Rubber Tree, Ministry of Agriculture, State Key Laboratory Incubation Base for Cultivation & Physiology of Tropical Crops,
Danzhou, Hainan 571737, China; 2College of Agronomy, Hainan University, Haikou 570228, China
Abstract: Mitogen-activated protein kinase kinases (MAPKKs/MKKs) play an important role in tolerance of
plants to abiotic and biotic stresses. In the present study, a full length cDNA sequence of HbMKK6 was ob-
tained from latex of rubber tree (Hevea brasiliensis) clone ‘Reyan 7-33-97’ by rapid-amplification of cDNA
ends (RACE) and RT-PCR. The HbMKK6 contained 65 bp 5 untranslation region (UTR), 316 bp 3 UTR and a
1 065 bp open reading frame (ORF). The HbMKK6 contained 354 amino acid residues with a predicted molec-
ular mass of 39.91 kDa and theoretical isoelectric points (pI) of 5.96. It has the consensus sequence SMGQRDT
(S/TxxxxxS/T). Real-time RT-PCR analysis showed that HbMKK6 was expressed in root, bark, latex and espe-
cially in leaves. The transcripts of HbMKK6 were more abundance in cold-resistant rubber tree clone ‘93-114’
than that in cold-sensitive rubber tree clone ‘Reken 501’. Moreover, the expression of HbMKK6 in the leaves of
rubber tree clone ‘93-114’ was significantly up-regulated while it remained hardly changed in the leaves of rub-
ber tree clone ‘Reken 501’ under 4 ℃ treatment. The differential expression of HbMKK6 between the two
clones may be associated with their different tolerance to cold stress.
Key words: Hevea brasiliensis; mitogen-activated protein kinase kinase; cold-resistant; HbMKK6; gene ex-
pression
促分裂原活化蛋白激酶的激酶(mitogen-activated
protein kinase kinases, MAPKKs/MKKs)是MAPK级
联途径的组分之一 , 在真核生物中普遍存在。
MAPK级联途径由促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-
activated protein kinase, MAPK)、MAPKK、促分裂
原活化蛋白激酶的激酶之激酶(MAPK kinase kinase,
MAPKKK)三个组分组成(MAPK Group 2002), 由
MAPKKK-MAPKK-MAPK依次磷酸化传递信号
(Gustin等1998; Chang和Karin 2001)。植物中
MAPK信号转导广泛参与多种生物与非生物胁迫,
如病害、低温、干旱、盐害和紫外线等引起的信
植物生理学报430
号转导过程(Meng和Zhang 2013; Samajova等2013;
Danquah等2014)。研究表明 , 拟南芥AtMEK1
(Matsuoka等2002)、AtMKK2 (Teige等2004), 水稻
OsMEK1 (Wen等2002)、OsMKK6 (Xie等2012), 玉
米ZmMKK1 (Cai等2014)等MAPKK组分与低温胁
迫相关。Matsuoka等(2002)研究发现, 拟南芥At-
MEK1的活性受到低温刺激后升高, 并可能通过双
重磷酸化TEY基序激活其下游的ATMPK4。而AT-
MPK4和ATMPK6的蛋白激酶活性能在冷胁迫2
min中后被激活, 其中ATMPK4活性在60 min后达
到最高; ATMPK6更快, 10 min内活性达到最高
(Ichimura等2000; Teige等2004; Smekalova等
2014)。Teige等(2004)研究发现, 拟南芥MKK2可
能通过其上游的MEKK1被低温激活。更进一步的
研究发现, 拟南芥以MEKK1-MKK2-MPK4/MPK6
途径在低温胁迫响应的过程中起作用(Teige等
2004; Pitzschke等2009a)。水稻花药及幼苗中Os-
MEK1转录本的表达水平受12 ℃低温诱导上调, 幼
苗OsMEK1对4 ℃低温处理无响应。OsMAP1表现
出与OsMEK1相同的表达模式, 且酵母双杂交实验
证实OsMEK1能与OsMAP1互作。因此, 推断包含
OsMEK1和OsMAP1组分在内的MAPK信号途径
可能在较高的低温范围响应中起作用 (Wen等
2002)。Xie等(2012)将OsMKK6的活性形式OsMK-
K6DD转化水稻, 提高了转化植株的抗低温能力。
玉米ZmMKK1的低温响应表现出与OsMEK1相似
的表达模式, 即受12 ℃低温诱导上调, 对4 ℃低温
胁迫无响应, 且在12 ℃低温处理12 h后, ZmMKK1
转录本大约是对照的17倍。而且ZmMKK1烟草转
基因植株也表现出抗低温的能力(Cai等2014)。因
此 , 植物在遭遇低温时 , 外界的低温信号通过
MAPK级联途径向下传递, 通过调控相关转录因子
或靶基因的表达, 使植物获得抵御低温的能力。
巴西橡胶树的原产地和传统植胶区均属于热
带静风地区, 没有寒潮和台风的影响(何康和黄宗
道1987)。我国的植胶区分布于北纬18~24°的热带
北缘地区(主要是海南、云南和广东), 橡胶树经常
面临寒潮的影响。选育抗寒高产无性系能从根本
上减轻寒潮对橡胶树的危害。目前, 抗寒种质的
鉴定主要采用抗寒前哨梯度苗圃系比鉴定法, 即
在一般年份有寒流侵袭的地区或寒流通道上建立
前哨梯度苗圃系比区。通过抗寒苗圃鉴定, 选育
出一批抗辐射或抗平流低温能力强(或较强)的无
性系(黄华孙2005)。但是, 这种方法需要耗费大量
的人力、物力。因此, 橡胶树抗寒分子标记的研
发就显得尤为重要。本研究从橡胶树中鉴定了一
个MAPKK基因家族成员基因HbMKK6, 并分析其
在抗寒无性系‘93-114’与不抗寒无性系‘热垦501’
低温胁迫下的基因表达模式, 旨在为开发抗寒性
分子标记辅助橡胶树育种奠定基础。
材料与方法
1 材料
实验材料为种植于中国热带农业科学院实验
场增殖圃的橡胶树(Hevea brasiliensis Muell. Arg.)
‘热研7-33-97’萌条、种子萌发的橡胶树实生苗‘热
研7-33-97’以及‘93-114’和‘热垦501’芽接苗。
RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂
盒、DNase I、DNA凝胶回收试剂盒购自天根公
司。cDNA末端快速扩增(rapid-amplification of
cDNA ends, RACE)试剂盒SMARTerTM RACE
cDNA Amplification Kit购自Clontech公司。反转录
试剂盒RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit
购自Ferments公司。PrimeSTAR Max DNA Poly-
merase、实时荧光定量PCR试剂SYBR Premix Ex
Taq II (Tli RNaseH Plus)购自大连宝生物公司。
pEASY-Blunt Simple Cloning Kit购自北京全式金
公司。其他生化试剂均为进口或国产分析纯试
剂。引物合成和DNA测序由Invitrogen公司完成。
2 材料处理
橡胶树‘热研7-33-97’萌条和实生苗用于分析
基因表达的组织特异性, 其中选取3株生长状态相
近的实生苗根以及萌条第一伸长单位中间部位的
茎皮、胶乳和顶蓬叶片, 液氮冻存, 用于RNA提
取。选取处于稳定期‘93-114’和‘热垦501’一蓬叶
芽接苗进行4 ℃低温胁迫处理, 在处理0、2、4、
8、12、24、48 h后, 取中间叶片经液氮速冻, 用于
RNA提取。每个处理时间点取3株混合。
3 总RNA提取与cDNA合成
橡胶树RNA的提取参照RNAprep Pure多糖多
酚植物总RNA提取试剂盒的操作说明进行 , 用
DNase I柱消化RNA样品中残留的微量DNA。
cDNA第一链的合成参照Ferments公司试剂盒的说
明书进行。
吴绍华等: 巴西橡胶树HbMKK6基因的克隆及表达分析 431
4 HbMKK6基因的RACE扩增和全长cDNA扩增
从巴西橡胶树转录组深度测序数据中得到一
段注释为MKK的Unigene序列, 开放阅读框(open
reading frame, ORF)分析显示该Unigene序列缺乏5
端序列。因此, 以转录组中获得MKK序列设计5
RACE引物(表1), 采用SMARTerTM RACE cDNA
Amplification Kit进行5端序列的克隆。将获得的5
端序列与Unigene序列进行拼接, 并设计全长cDNA
扩增引物(表1), 进行PCR扩增验证。取1 μg胶乳
RNA, 在20 μL反应体系中逆转录合成第一链
cDNA。全长cDNA的扩增体系含PrimeSTAR Max
Premix (2×) 25 μL、FL-CDNA-MKK6-F (10 μmol·L-1)
2.5 μL、FL-CDNA-MKK6-R (10 μmol·L-1) 2.5 μL、
cDNA模板0.5 μL, 灭菌水补足到50 μL。扩增程序
为: 95 ℃预变性3 min; 94 ℃变性30 s, 60 ℃退火30
s, 72 ℃延伸2 min, 共30个循环; 72 ℃延伸10 min。
0.8%的琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物, 回收
纯化目的条带, 克隆至pEASY-Blunt Simple Clon-
ing Vector载体上测序。利用BLAST检索GenBank
数据库, 进行同源性分析。
dk/services/TMHMM/)进行跨膜结构域分析; ProtS-
cale在线软件(http://web.expasy.org/protscale/)预测
该氨基酸序列的疏水性/亲水性; PSORT在线软件
(http://psort.hgc.jp/form.html)对该蛋白进行亚细胞
定位预测; SOPMA在线软件(http://npsa-pbil.ibcp.
fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sop-
ma.html)预测蛋白的二级结构。从NCBI数据库下
载其他植物的MKK蛋白序列, 首先用Clustal W进
行序列多重比对, 再利用MEGA 4.0软件, 选择
neighbour-joining (NJ)模型, 并进行1 000次boot-
strap统计学检验, 构建包括HbMKK6蛋白序列在
内的植物MKK蛋白的系统进化树。
6 实时荧光定量PCR分析
采用Bio-Rad公司的CFX实时荧光定量PCR系
统 , 实验操作按仪器使用说明书进行。取1 μg
RNA, 逆转录合成第一链cDNA, 稀释10倍后作为
实时定量PCR分析的模板。20 μL反应体系中, 包
含1 μL模板、10 μL 2×SYBR Premix、10 μmol·L-1
QPCR-MKK6-F和QPCR-MKK6-R引物(表1)各0.6
μL、灭菌水。PCR反应程序为: 95 ℃预变性30 s;
95 ℃变性10 s, 60 ℃退火20 s, 72 ℃延伸20 s, 共40
个循环; 循环完后进行产物溶解曲线分析。利用
CFX manager 3.0软件自动进行基线和Cq值分析,
以HbActin作为内参基因(表1), 2-ΔΔCq算法进行基因
的相对定量表达分析。
采用t检验对‘93-114’和‘热垦501’同一处理的
相对表达量进行统计分析, P<0.05时即达显著性,
用符号*表示; P<0.01时即达极显著性, 用符号**
表示。
实验结果
1 HbMKK6基因全长cDNA的克隆及编码蛋白的
结构特性
通过5 RACE、RT-PCR扩增及测序, 获得Hb-
MKK6基因(GenBank登录号: KP262502)的全长
cDNA序列1 446 bp, 其中5非编码区65 bp, 3非编
码区316 bp, ORF预测显示该基因含有1 065 bp的
编码框, 编码354个氨基酸(图1)。该基因编码的蛋
白质分子量为39.91 kDa, 理论等电点为5.96, 不稳
定系数为47.94, 属于不稳定类蛋白。通过NCBI的
CDD分析发现, 该蛋白与其他植物MKK蛋白一样,
表1 本研究所用引物序列
Table1 Primer sequences used in this study
引物名称 序列
5RACE-MKK6-P 5-AATGCAAATAATGTCCCAACCCATTT-3
5RACE-MKK6-NP 5-TGATTCAAAAGCAAATCTCCATCGT-3
FL-CDNA-MKK6-F 5-TGTTGCAGAGAAATTTAAAACCCT-3
FL-CDNA-MKK6-R 5-ACTTGAAAGACTAAACAAACCCAGA-3
QPCR-MKK6-F 5-TGGATCTTGCCTTCATATTCAAAGA-3
QPCR-MKK6-R 5-TGCCTACTTCCAAAACCAATGT-3
QPCR-Actin-F 5-GATTCCGTTGCCCAGAAGTC-3
QPCR-Actin-R 5-CACCACTCAGCACAATGTTACC-3
5 生物信息学分析
采用NCBI网站ORF Finder软件(http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)进行ORF预测, 同
时翻译成蛋白序列。DNAMAN软件对HbMKK6
蛋白的氨基酸序列进行比对分析。用NCBI网站
Conserved Domain Database (CDD, http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析蛋白
的保守结构域; ProtParam软件(http://web.expasy.
org/protparam/)分析该蛋白的分子量与等电点;
TMHMM Server v. 2.0在线软件(http://www.cbs.dtu.
植物生理学报432
具有进化上保守的蛋白激酶催化结构域S_TKc, 其
中在结构域中包含一个保守的磷酸化基序SMGQ-
RDT (S/TxxxxxS/T) (图2)。生物信息分析显示,
HbMKK6蛋白可能定位于细胞质中, 无跨膜结构
域, 属于亲水性蛋白, 其二级结构由33.05% α-螺
旋、21.19%延伸链、10.73% β-转角和35.03%无规
则卷曲组成。
2 HbMKK6推导的氨基酸序列比对及进化树构建
采用DNAMAN软件对HbMKK6推导的氨基
酸序列与其他植物MKK蛋白序列进行比对, 结果
显示, HbMKK6蛋白序列与麻疯树(Jatropha cur-
cas)假定蛋白JCGZ_07355 (KDP33784.1)、陆地棉
(Gossypium hirsutum) GhMKK6 (ADR31547.1)、白
桦(Betula platyphylla) BpMKK6 (AHX99577.1)、
葡萄(Vitis vinifera) VvMKK6 (XP_002283491.1)、拟
南芥(Arabidopsis thaliana) AtMKK6 (NP_200469.1)、
玉米(Zea mays) ZmMKK6 (ACG40591.1)、水稻
(Oryza sativa) OsMKK6 (ABG45894.1)氨基酸序列
相似性分别为96 .33%、94 .07%、92 .94%、
90.96%、87.08%、76.97%和76.97% (图2)。
选取NCBI数据库中7条与HbMKK6蛋白氨基
酸较相似序列以及4条低温响应的MKK蛋白序列,
利用软件MEGA 4.0构建系统进化树。聚类结果显
示 , 橡胶树HbMKK6与麻疯树假定蛋白JCGZ_
07355聚为一类, 亲缘关系最近(图3)。
3 HbMKK6基因表达分析
采用荧光定量RT-PCR技术对HbMKK6基因的
组织特异性和4 ℃低温胁迫处理条件下的基因表
达模式进行了分析。基因表达结果显示, HbMKK6
在橡胶树的根、茎皮、胶乳及叶片中均有表达,
其中胶乳中的表达量最低, 叶片中的最高, 不同时
期叶片中HbMKK6的表达量也不同(图4)。常温与
图1 HbMKK6的核苷酸序列和推导的氨基酸序列
Fig.1 The nucleotide and deduced amino acid sequences of HbMKK6
吴绍华等: 巴西橡胶树HbMKK6基因的克隆及表达分析 433
图2 HbMKK6推导的氨基酸序列与其他植物MKK蛋白序列比对
Fig.2 Amino acid alignment of the HbMKK6 with MKKs from other plant species
黑下划线表示S_TKc结构域; ▼显示的是SMGQRDT (S/TxxxxxS/T)基序。
图3 HbMKK6与其他同源蛋白的进化分析
Fig.3 Phylogenetic analysis of HbMKK6 and other homologs
植物生理学报434
图4 HbMKK6基因在橡胶树不同组织中的表达特性
Fig.4 Expression of HbMKK6 in different
tissues of H. brasiliensis
图5 低温(4 ℃)胁迫下HbMKK6基因在橡胶树抗寒无性系
‘93-114’和不抗寒无性系‘热垦501’中的差异表达
Fig.5 Differential expression of HbMKK6 in the leaves of
cold-resistant rubber tree clone ’93-114’ and cold-sensitive
rubber tree clone ‘Reken 501’ in response to
low-temperature (4 ℃)
采用t检验对同一处理‘93-114’和‘热垦501’的表达量进行统计
分析, *表示达显著性(P<0.05), **表示达极显著性(P<0.01)。
4 ℃低温处理条件下, HbMKK6在橡胶树抗寒无性
系‘93-114’叶片中表达丰度均显著高于不抗寒无性
系‘热垦501’, 其中4 ℃低温处理4 h后, ‘93-114’中
HbMKK6基因表达量更是达到了‘热垦501’表达量
的近10倍(图5)。而且, 4 ℃低温处理后, ‘93-114’叶
片中HbMKK6基因的表达量受低温诱导大幅上调,
与常温相比, ‘93-114’无性系叶片中HbMKK6基因
表达在4 ℃低温处理2 h后开始上调, 表达量是对照
的1.9倍; 在4 h达到最高, 表达量是对照的3.9倍; 8 h
后基因表达开始下调, 但整个低温处理过程中, ‘93-
114’中HbMKK6基因的表达丰度维持在一个较高的
水平。而‘热垦501’叶片中HbMKK6基因表达除在4
℃低温处理48 h有所上调外, 其他时间点的表达量
基本维持不变(图5)。结合2个无性系在生产上的表
现, 即‘93-114’比‘热垦501’更具有抗寒性, 推测高丰
度表达HbMKK6可能与增强橡胶树的抗寒性有关。
讨　　论
选育抗寒高产橡胶树品种是我国橡胶产业可
持续发展的迫切需求。目前, 橡胶树抗寒性种质的
鉴定主要采用传统的抗寒前哨梯度苗圃系比鉴定
法, 而橡胶树抗寒性的分子机理研究还处于起步阶
段, 主要集中在抗寒基因的筛选。已有的研究发现
HbCBF1 (程汉等2005)、HbCBF2 (蔡海滨等
2008)、HbMT2a (李言等2011)、HbSoloit (杜磊等
2013)、HbHsp70 (Zhang等2009)基因表达受低温胁
迫诱导。另外, 安泽伟等(2010)采用cDNA- AFLP技
术从11个橡胶树抗寒无性系和12个不抗寒无性系
中鉴定了12条表现一致的差异片段, 其中TDF7-8、
TDF5-15、TDF16-10片段分别与植物抗逆相关的
ABC转运蛋白、3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合
成酶(DAHPS)、WRKY基因有较高相似性。Silva
等(2014)从橡胶树低温诱导的文库中鉴定ATP合酶
CF0 C亚基(CF0)、NAD(P)H醌氧化还原酶H亚基
(NADH)、光系统II 10 kDa多肽(PsbR)及吲哚-3-乙
酸诱导蛋白ARG2-1和ARG2-2的表达受低温诱
导。MAPKK作为MAPK级联组分的成员之一, 在
植物的生长发育和抗逆响应中发挥着极为重要的
作用(Colcombet和Hirt 2008; Fiil等2009; Pitzschke等
2009b; Rodriguez等2010; Sinha等2011)。而有关
MAPKK基因介导的橡胶树抗寒分子机理的研究还
未见报道。本研究从橡胶树中鉴定了一个MAPKK
基因家族成员HbMKK6, 并采用抗寒无性系‘93-
114’与不抗寒无性系‘热垦501’作为材料, 分析Hb-
MKK6在低温胁迫下基因表达模式。基因表达结果
显示, 抗寒‘93-114’无性系叶片中HbMKK6基因的
表达受4 ℃低温诱导表达大幅上调, 4 h的表达量达
到最高, 此后维持在一个较高的水平, 这与水稻Os-
吴绍华等: 巴西橡胶树HbMKK6基因的克隆及表达分析 435
MEK1和玉米ZmMKK1低温响应的基因表达模式是
不同的, OsMEK1和ZmMKK1受12 ℃低温诱导上调,
对4 ℃低温胁迫无响应(Wen等2002; Cai等2014)。
另外, HbMKK6基因在橡胶树抗寒无性系‘93-114’
叶片中的表达丰度显著高于不抗寒无性系‘热垦
501’, 而且抗寒无性系‘93-114’叶片中HbMKK6基因
表达受4 ℃低温显著上调, 与BnMKK4和BnMKK2在
‘陇油6号’和‘天油2号’油菜中的诱导模式相似(张腾
国等2012a, b)。即‘陇油6号’中BnMKK4基因受低温
胁迫诱导的持续时间更长或BnMKK2基因在‘陇油6
号’油菜中受低温胁迫诱导的程度更强, 这种低温
胁迫响应与‘陇油6号’油菜比‘天油2号’更具有抗寒
性的品种特性是相一致(张腾国等2012a, b)。因此,
橡胶树HbMKK6可能与其他植物的MKK基因具有
相似的功能, 在橡胶树低温响应中发挥作用。在后
续的研究中, 将进一步扩大橡胶树抗寒无性系与不
抗寒无性系的群体, 着重分析HbMKK6低温响应的
基因表达差异模式是否也存在于其他抗寒与不抗
寒种质中, 以进一步评估HbMKK6是否可作为评价
橡胶树抗寒性的一种潜在标记。
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