全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 5期，2009年 5月 449
收稿 2009-01-09 修定 　2009-02-03
资助 新疆维吾尔自治区科技重大专项(200731138-3)和教育
部科学技术研究重点项目(2 0 51 7 8 )。
* 通讯作者(E-mail: zfcxju@xju.edu.cn; Tel: 0991-8583517)。
灰绿藜液泡膜焦磷酸酶基因(CgVP1)过表达提高拟南芥的耐盐性
胡有贞, 王瑜, 张富春 *
新疆大学生命科学与技术学院, 新疆生物资源基因工程重点实验室, 乌鲁木齐 830046
提要: 克隆获得包含完整开放阅读框(ORF)的灰绿藜液泡膜焦磷酸酶基因(CgVP1) cDNA序列, 构建成基因表达载体
pCAMBIA1301.1-CgVP1后, 利用根癌农杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥, 再以抗性筛选方法获得了T3代纯合的转基因
植株, 经检测外源目的基因已经整合到拟南芥基因组中并能正常表达。分析结果表明, 在拟南芥中过表达CgVP1基因后提
高了植株抗盐胁迫的能力。
关键词: 灰绿藜; 液泡膜焦磷酸酶基因; 过表达; 耐盐性
Overexpression of Chenopodium glaucum Tonoplast Pyrophosphatase (CgVP1)
Improves Salt Tolerance in Arabidopsis thaliana
HU You-Zhen, WANG Yu, ZHANG Fu-Chun*
Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering, College of Life Science and Technology, Xinjiang
University, Urumqi 830046, China
Abstract: The open reading frame (ORF) of halophyte Chenopodium glaucum tonoplast pyrophosphatase gene
(CgVP1) was successfully cloned and inserted into plant expression vector pCAMBIA1301.1, then the recom-
binant (pCAMBIA1301.1-CgVP1) was transformed into Arabidopsis thaliana through floral dipping method,
which was mediated by Agrobacterium tumefaciens. Homozygous T3 transgenic plants that were resistant to
hygromycin were obtained. The results indicated that CgVP1 gene was integrated into Arabidopsis thaliana
genome and expressed normally. Various salt tolerance analysis showed that that overexpression of tonoplast
pyrophosphatase gene from Chenopodium glaucum could improve the salt tolerance in transgenic Arabidopsis
thaliana.
Key words: Chenopodium glaucum; tonoplast pyrophosphatase; overexpression; salt tolerance
一般来说, 高盐条件下, 盐生植物主要依靠液
泡膜Na+/H+逆向转运蛋白将细胞质中过多的Na+区
隔到液泡中(Blumwald和 Poole等 1985; Gaxiola等
1999), 它不仅降低胞质中的钠离子浓度, 还可以促
使植物利用NaCl作为渗透剂, 来保持渗透势以驱动
水分进入细胞(Niemietz 和Willenbtink等 1985;
Blumwald等 2000)。因此, 离子区隔化机制对植物
细胞适应盐生境十分重要, 而液泡膜上Na+/H+逆向
运输是靠跨液泡膜的H+梯度驱动的, H+梯度的形成
又依赖于液泡膜上的两种质子泵: H+-ATPase和H+-
PPase分别以ATP和PPi为动力, 将H+泵到液泡中,
从而形成H+梯度(Glenn等 1999)。
植物液泡膜H+-PPase (VP1)是一种广泛存在于
很多生物体内的H+转运酶。它只由一条受单基因
编码的多肽组成(Maeshima 2000), 结构非常简单;
其底物为简单的低价焦磷酸(PPi), 含有一个高能磷
酸键。在植物对水分胁迫和盐分胁迫的响应中,
H+-PPase作为一种有效的质子泵调节细胞的酸度,
驱动各种离子在液泡内的区隔化( Peer b ol te 等
1986)。在盐分或水分胁迫下, H+-PPase超表达能
够增强H+跨液泡膜电化学梯度, 提高液泡膜上有
H+参与的各种次级运输载体的运输效率, 促进包括
Na+在内的各种运输和积累, 从而维持细胞中离子
的平衡和细胞的膨压, 离子向液泡内运输的同时也
可削弱过多Na+对细胞造成的伤害, 进而增强植物
的耐旱性和耐盐性。
新疆的盐生植物资源非常丰富, 其中以藜科植
物最多。灰绿藜属藜科一年生草本盐生植物, 能在
干旱贫瘠的土地上生长, 在较高盐浓度的胁迫下正
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常完成其生活史。迄今为止, 抗逆植物的研究中有
关灰绿藜的报道极少, 对其抗逆相关基因的研究更
是未见。所以开展灰绿藜液泡膜 H + - P P a s e
(CgVP1)耐盐性的研究, 将有助于阐明干旱区盐生
植物的耐盐性特征与分子机制。
材料与方法
野生型拟南芥(Arabidopsisi thaliana L., Colum-
bia ecotype)种子、植物表达载体 pCAMBIA1301.1、
大肠杆菌DH5α、根癌农杆菌 EHA105为本室保
存。Taq酶、抗生素购自上海生物工程技术有限
公司。Trizol RNA 提取试剂盒、AMV逆转录酶、
限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自 Takara公司。
基因测序由上海生物工程技术有限公司完成。其
它试剂均为分析纯产品。
总 RNA分离用 Trizol试剂, 总 cDNA合成用
TaKaRa RNA LA PCRTM Kit (AMV) Ver 1.1反转录试
剂盒, 根据液泡膜焦磷酸酶基因的保守同源序列设
计核心片段引物, P1: 5 ATGGTGGCGCCTGC-
TTTGTT 3; P2: 5 GCCATAAGCTTGATCAGGA-
TGTT 3。灰绿藜液泡膜焦磷酸酶基因(CgVP1)完
整编码区cDNA的获得采用cDNA末端快速扩增法
(rapid amplification of cDNA ends, RACE)。5 RACE
引物为5 P1: 5 ATGGGTGTTCTTCTTCC 3, 5 P2:
5 AGGATGTCGACGATTTACAATTTTGCCATT
3。3 RACE引物为3 P1: 5 GACCATCACTCAAC-
ATCCTG 3, 3 P2: 5 GGATACATCTGGACCATCAC
3。
分别设计带KpnI酶切位点和带SalI酶切位点
的上下游引物(1301p1: 5 GCAGGTACCATGG-
GTGTTGTTCTTCTTCCAG 3, 1301p2: 5 ACT-
GTCGACTTAGAAGATCTTGAAGAGCAAGCC 3)
进行 PCR扩增, 获得 CgVP1开放阅读框。PCR程
序为: 94 ℃预变性 5 min; 94 ℃变性 30 s, 57.5 ℃退
火 30 s, 72 ℃延伸 2 min, 35个循环; 72 ℃延伸 7
mi n。
按照Guo等(2006)所述的方法筛选转化后具
潮霉素抗性的拟南芥种子。收取 T3代种子保存待
用。
用 CTAB法(Jia等 2002)提取生长 6周的拟南
芥转化植株和野生型拟南芥植株基因组DNA作为
PCR反应模板, 以 CgVP1特异性引物 1301p1和
1301p2进行 PCR扩增检测。RT-PCR分析采用
Trizol 试剂盒分别提取拟南芥转化植株和野生型拟
南芥植株叶片中总RNA, 用TaKaRa 公司反转录试
剂盒将 RNA 反转录为 cDNA, 用 CgVP1的特异上
游引物 1301p1和下游引物LJY36W1P (5 TGCTT-
GGTGCTATCACCTCTTTGGC 3)进行 PCR扩增。
选取野生型与转基因 T3代各株系(纯合子)种
子分别播于含有 0、50、100、l50和 175 mmol.
L-1 NaCl的 1/2MS固体培养基上生长 18 d后, 观察
种子萌发情况(每个盐浓度重复4次), 测量根长(每
个盐浓度重复 4次)并拍照。
将野生型与转基因 T3代各株系(纯合子)种子
播于 1/2MS培养基上生长2周, 移栽至蛭石和珍珠
岩(3:1)基质中培养 4 周, 分别用 0、50、100、
150、200 mmol.L-1 NaCl处理 15 d。从中选取野
生型和转基因型幼苗采用原子吸收光谱测定 K+、
Na+离子含量。采用双组份分光光度计法分析丙
二醛(malondialdehyde, MDA)含量。依照 Seong等
(2007)文中的方法测定叶绿素含量。
结果与讨论
1 灰绿藜液泡膜焦磷酸酶基因(CgVP1)的克隆及序
列分析
PCR扩增获得的 CgVP1开放阅读框(ORF)经
测序确定全长为 2 292 bp, 编码 763个氨基酸(图
1)。CgVP1与模式植物拟南芥液泡膜焦磷酸酶基
因(AVP1)的核酸同源性达到 69.73%。CgVP1与已
发表的同属红叶藜液泡膜焦磷酸酶(CrVP1)的同源
性最高, 分别为 95%和 98%; 推测其氨基酸序列中
含有植物液泡膜焦磷酸酶3个保守的功能区(CS1、
CS2和 CS3) (Maeshima 2000), 此基因序列已在
GenBank上注册(登录号DQ443731)。
2 纯合转基因植株的获得
将CgVP1基因克隆到载体pCAMBIA1301.1中,
获得 pCAMBIA1301.1-CgVP1基因表达载体(图2),
然后导入根癌农杆菌菌株EHA105中, 用农杆菌介
导的花序浸染法转入拟南芥。将转化植株收获的
T0代种子在含 30 mg.L-1 潮霉素固体培养基上筛选
培养, 连续筛选 3代, 获得 T2代纯合植株。
3 分子生物学检测
用CgVP1基因特异引物(1301p1和1301p2)对
T2代转基因拟南芥进行基因组 PCR 检测, 结果均
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图 2 pCAMBIA1301.1-CgVP1载体的 T-DNA区域示意图
Fig.2 Sketch map of pCAMBIA1301.1-CgVP1
扩增出预期大小(2 300 bp)的片段, 野生型拟南芥
没有扩增出该片段(图 3), 初步证明 CgVP1基因已
成功地转入拟南芥。
挑选4个阳性T2代转基因拟南芥, 用CgVP1 的
特异引物(1301p1和 LJY36W1P)进行 RT-PCR 分
析。CgVP1基因在转基因拟南芥中都有一定量的
表达, 而在野生型拟南芥中没有表达(图 4)。表明
CgVP1基因已整合到转基因拟南芥基因组中并正
常转录。
4 转基因植株耐盐性检测
4.1 幼苗耐盐表型 在 50 mmol.L-1 NaCl胁迫下, 野
生型植株和转基因植株的生长开始受到抑制, 随着
盐浓度上升, 野生型植株的种子萌发率明显下降(图
5)。当 NaCl浓度为 100 、150 和 175 mmol.L-1
时, 转基因植株的种子萌发率分别为91.7%、89.2%
和 84.2%, 野生型萌发率为67.5%、53.3%和 35.8%
图 3 转化拟南芥基因组 PCR检测
Fig.3 Genome PCR of transformed plant of Arabidopsis
M: DL 15000+2000 Marker; C-: 阴性对照; WT: 野生型拟
南芥; 1~4: 不同的转基因株系; C+: 阳性质粒。
图 1 灰绿藜液泡膜焦磷酸酶基因(CgVP1)的氨基酸序列
Fig.1 The deduced amino acid sequence of CgVP1 gene
方框中分别是液泡膜焦磷酸酶的保守功能区 CS1、CS2 和 CS3。
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图 5 盐胁迫下的转基因和野生型拟南芥幼苗
Fig.5 Transgenic and wild seedlings of Arabidopsis under salt stress
播种后 18 d测定。WT: 野生型幼苗; C3: 32 号株系转基因幼苗。下图同此
(图 6), 两者萌发率差异极显著(P<0.01)。植株在
0、 50 、100、150和 175 mmol.L-1 NaCl的 1/2MS
培养基中培养 18 d测量植株根长。图 7表明, 正
常生长条件下野生型植株和转基因植株之间的根长
无明显差异, 随着盐浓度上升, 野生型植株与转基
因植株根长差异显著(P<0.05)。前人研究显示在
种子萌发过程中液胞膜质子泵主要由H+-PPase承
担, 这可能是转基因植株的萌发率保持较高水平的
原因。另外, 转基因植株比野生型植株具有更发达
的根系(Li等2005), 在NaCl胁迫下, 转基因植株的
根长都长于野生型植株的。这说明转基因植株比
野生型植株具有更好的保水潜能, 以减少盐分对植
物带来的渗透损伤, 因而更耐盐。
4.2 K+、Na+ 含量 K+涉及植物许多生理过程, 如
酶活性调节、蛋白质合成及渗透调节, 因此维持细
胞胞质中较高的K+/Na+对于植物的生长及耐盐性
十分必要(Gaxiola等 2002)。图 8显示, 盐胁迫下
的野生型和转基因植株Na+含量随盐浓度的提高迅
速增加, 而K+含量则随盐浓度的提高而下降。但
过表达液泡膜H+-PPase的拟南芥, 无论在叶中还是
在根中都能减缓K+的下降趋势, 从而保持植株体内
相对较高的K+浓度。另外, 转基因拟南芥叶中的
Na+含量低于野生型植株的, 而根中的却相反, 这可
能是由于在长期盐胁迫下, 转基因植物优先将Na+
区隔到根部的细胞中, 减少Na+向地上部的运输, 减
轻了对地上部的伤害, 从而提高了植物的耐盐能
力。
4.3 丙二醛(MDA)和叶绿素含量 MDA作为脂质过
氧化作用的产物, 其含量的多少可以代表膜损伤程
度的大小(王建明等 2001)。但在盐胁迫初期, 机体
有一个保护应答过程, MDA含量呈轻微的下降趋
势; 随着胁迫的加剧, MDA含量则迅速增加。本
实验结果(图9)表明, 野生型拟南芥和转基因拟南芥
图 4 转基因拟南芥RT-PCR检测
Fig.4 RT-PCR of transformed plant of Arabidopsis
M: DL2000 Marker; C-: 阴性对照; WT: 野生型拟南芥;
1~ 4：不同的转基因株系; C+ : 阳性质粒。
图 6 盐胁迫下转基因和野生型拟南芥的萌发
Fig.6 Germination of transgenic and wild
Arabidopsis under salt stress
图 7 盐胁迫下转基因和野生型拟南芥的根长
Fig.7 Root length of transgenic and wild Arabidopsis
under salt stress
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图 8 转基因和野生型拟南芥的不同组织中K+和Na+含量
Fig.8 K+ and Na+ contents of different tissues in transgenic and wild Arabidopsis
图 9 转基因与野生型拟南芥的MDA和叶绿素含量
Fig.9 MDA and chlorophyll contents of transgenic and wild Arabidopsis
的MDA浓度都是随着盐浓度的增加先下降后上升,
但野生型拟南芥体内的MDA含量始终比转基因的
拟南芥高, 说明野生型拟南芥植物体内受到的伤害
更严重。叶中叶绿素总含量的测定结果也显示, 盐
胁迫对野生型拟南芥的伤害较大, 其莲座叶绿素含
量下降较多, 与转基因拟南芥差异极显著(P<0.01)。
总之, 质子泵在甜土植物和盐土植物中的作用
机制不完全相同(Dietz等2001): 耐盐性植物将大量
钠离子区隔在液泡中, 而盐敏感性植物主要将Na+
外排至非原生质体空间以避免盐毒害(Blumwald等
2000)。因此盐生植物的液泡膜H+-PPase可能具有
更强大的功能, 而作为少数形态结构没有特化的耐
盐植物灰绿藜, 其耐盐机理则更有研究价值。本实
验通过农杆菌浸染拟南芥花序的方法将灰绿藜液泡
膜焦磷酸酶基因(CgVP1)导入拟南芥能显著提高其
耐盐能力, 进一步证明盐生植物液泡膜质子泵的基
因调控对植物的耐盐性有至关重要的作用, 也为利
用盐生植物基因资源改良农作物抗盐性提供了新的
思路。
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