全 文 ：植物生理学通讯 第 41卷 第 2期，2005年 4月 219
灰绿藜和碱蒿NHX 基因 3-UTR 序列的差异性分析
李金耀 马纪 蔡伦 王艳 张富春*
新疆大学生命科学与技术学院分子生物学重点实验室，新疆生物资源基因工程重点实验室，乌鲁木齐830046
Analysis of the Sequence Differences of the NHX Gene 3-UTR in Chenopo-
dium glaucum and Artemisia anthifolia
LI Jin-Yao, MA Ji, CAI Lun, WANG Yan, ZHANG Fu-Chun*
Key Laboratory of Molecular Biology, College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Key Laboratory of Xinjiang
Biological Resources and Genetic Engineering , Urumqi 830046
提要 采用3末端快速扩增技术，分别从新疆野生盐生植物灰绿藜和碱蒿中克隆CgNHX 和AaNHX cDNA 3末端。测序结
果表明克隆获得的片段为CgNHX和AaNHX基因3末端，并且CgNHX和 AaNHX 3-UTR的不同拷贝之间存在很大的差异
性。序列同源性分析结果显示，AaNHX 基因3-UTR 与CgNHX 基因3-UTR 同源性高达52%，两者与SsNHX(碱蓬NHX)同
源性分别达到 60% 和 54%，表明 NHX 基因的加工方式可能相同，同时说明该基因在野生盐生植物中的功能是很重要的。
关键词 灰绿藜; 碱蒿; NHX 基因; 3-UTR; 植物耐盐
收稿 2004-04-14 修定 　 2004-10-28
资助 国家科技攻关西部科技行动项目(2001BA901A32)和国
家“863”项目(2004 AA227110 -2)。
*通讯作者(E-mail: zfc@xju.edu.cn, Tel: 0991-8583517)。
3-UTR(3-untranslated region)不仅调控mRNA
的体内稳定性及降解速率，控制其利用效率，协
助辨认特殊密码子，而且还决定 mRNA 的翻译位
点及控制其翻译效率。Birnstiel等[1]的研究表明，
Poly(A)位点的选择是通过其上游附近的几个具顺
式作用的多聚腺苷酸化信号调节的。W a h l e 和
Keller[2]采用缺失突变的实验表明，3末端存在两
个很重要的保守序列：一是位于切割位点上游
10~35 核苷酸处的AAUAAA 序列；另一是Poly(A)
位点下游的富含U或GU的序列，它们可以被pre-
mRNA 加工复合物中特异的 RNA 结合蛋白所识别
和结合。
液泡膜中的 Na +/ H + 反向运输载体(Na +/ H +
antiporter, NHX)可促进离子在液泡中的区隔化效
应，跨液泡膜的 pH 为其提供能量。通过功能上
恢复Na+/H+ 反向运输载体(ScNHX1)缺陷型酵母突
变体，人们已从拟南芥中分离获得了 AtNHX1 基
因，其与哺乳动物NHE(Na+/H+ exchanger)反向运
输载体在序列上具有相似性[3~5]。另据报道，在
转基因拟南芥和转基因番茄中 AtNHX1 过量表达，
常会在液泡膜中积累大量的运输体，从而极大地
提高它们的耐盐性[3,5,6]。这些结果显示，AtNHX
家族在钠离子的液泡区隔效应中起关键作用。
本文以新疆乌鲁木齐和五家渠地区盐碱地的
野生盐生植物灰绿藜(Chenopodium glaucum)和碱蒿
(Artemisia anthifolia)为实验材料，研究3-UTR在
不同盐生植物 NHX 基因表达调控中的作用，同时
采用3-RACE(3-rapid amplification of cDNA ends)
技术从灰绿藜和碱蒿总RNA中扩增出NHX 3 cDNA
末端，并对它们的序列做了分析比较。
材料与方法
灰绿藜(Chenopodium glaucum)和碱蒿
(Artemisia anthifolia)采自新疆乌鲁木齐和五家渠地
区干旱盐碱地区，pMD18-T 测序载体购自Takara
公司，大肠杆菌DH5a菌株为我们实验室保藏的菌
种。R N A 提取试剂盒、P C R 产物回收试剂盒、
DNA 标准分子量、限制性内切酶BamH I和Hind III、
exTaq酶以及3-Full RACE Core Set和PCR引物均
购自Takara公司，测序试剂盒购自美国PE公司，
其它试剂均为分析纯。
灰绿藜和碱蒿总RNA 的提取依据操作试剂盒
进 行 。
根据本实验室克隆获得的灰绿藜 NHX 基因核
心片段序列，设计 3 - R A C E 引物序列为：P1，
GAGCTCCATATTGCTTGG TTTACTCAT G；P 2，
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G A T C A C G A G C A C T A T A A C T A T T G T C C。依照
TaKaRa 3-Full RACE Core Set 操作指南进行，反
转录用oligo dT-3 sites Adaptor Primer作下游引
物，反应条件：42℃ 30 min，99℃ 5 min，5℃
5 min。第一次 PCR 反应用 NHX 基因序列设计的
特异性引物P1和3- Adaptor Primer，扩增参数：
94℃ 5 min；94℃ 30 s，52.5℃ 30 s，72℃ 2 min，
35 个循环；72℃ 10 min。反应产物进行琼脂糖
凝胶电泳进行检测。半巢式PCR 反应用 P2和 3-
Adaptor Primer，扩增参数同上，反应产物进行
琼脂糖凝胶电泳检测。
CgNHX(灰绿藜 NHX) 和 AaNHX(碱蒿 NHX)
基因 cDNA 3末端的克隆按Takara公司PCR 产物
回收试剂盒说明书进行 PCR 产物的回收。回收的
NHX cDNA 片段与 pMD18-T 载体在 T4 DNA 连接
酶的作用下 16℃过夜，使 NHX cDNA 3 末端连
接到pMD18-T 的载体上。连接产物转化感受态细
胞(感受态的制备及转化按文献7的方法)。
重组质粒的鉴定按文献 7 的方法，小量提取
质粒DNA，用 BamHI 和 HindIII 双酶切进行重组
质粒的鉴定，酶切反应结束后进行琼脂糖凝胶电
泳鉴定，正确的克隆进行质粒的大量提取。为鉴
定克隆的 cDNA 序列，对 pMD18-T/3NHX 重组质
粒进行纯化，并用 BcaBEST primer RV-M 和
BcaBEST primer M13-47 对 CgNHX 和 AaNHX
cDNA 3末端在PE377全自动测序仪进行双向DNA
序列测定，所得序列用PE公司SeqEd v1.0.3软件
进行分析。
实验结果
1 3-RACE产物鉴定
采用提取的灰绿藜和碱蒿总 R N A ，分别以
oligo dT-3 sites Adaptor Primer为引物进行反转录
得到单链 c D N A，再以设计的 P C R 引物进行扩
增，分别获得 CgNHX 和 AaNHX 基因 cDNA 的 3
末端片段。3-RACE产物经 1%琼脂糖凝胶电泳鉴
定，灰绿藜3-RACE产物有 850和 680 bp 2条扩
增条带(图1)，碱蒿3-RACE产物有820和670 bp
2 条扩增条带(图 2)，与我们预计的大小一致。
2 测序载体的构建及其鉴定
3-RACE 产物与克隆载体pMD18-T 连接，构
建了重组质粒 pMD18-T/3NHX，不同克隆的编号
分别为：pMD18-T/3CgNHX1-1、1-2、1-3、1-4
和 pMD18-T/3AaNHX1-1、1-2。重组质粒用
BamHI 和 HindIII 酶切，pMD18-T/3CgNHX1-1、
1-2、1-3、1-4 分别切出约 680、840、790 和
900 bp 的DNA片段(图 3)， pMD18-T/3AaNHX1-
1、1-2 分别切出约670 和 820 bp 的 DNA 片段(图
4)，与预计的连接片段大小相同。
图2 AaNHX cDNA 3末端扩增
1: DL2000 DNA 分子量标准; 2: AaNHX cDNA。
3 CgNHX和 AaNHX cDNA 3末端序列测定及序列
分析
对重组质粒pMD18-T/3CgNHX1-1、1-2、1-
3、1-4和 pMD18-T/3AaNHX1-1、1-2用 BcaBEST
图1 CgNHX cDNA 3末端扩增
1: DL2000 DNA 分子量标准; 2: CgNHX cDNA。
图 3 重组质粒pMD18-T/3CgNHX 酶切分析
1、2、4、5：BamHI 和 HindIII 酶切 pMD18-T/3CgNHX1-
1、1 - 2、1 - 3、1 - 4；3：D L 2 0 0 0 D N A 分子量标准。
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图4 重组质粒pMD18-T/3AaNHX 酶切分析
1、3: BamHI 和 HindIII 酶切 pMD18-T/3AaNHX1-1、1-
2；2：D L 2 0 0 0 D N A 分子量标准。
primer RV-M和BcaBEST primer M13-47进行双向
测序的结果如图 5 和图 6。
4 不同植物NHX 序列的同源性分析
用 DNAMAN 对 CgNHX、AaNHX 和 SsNHX
(碱蓬 NHX)基因的 3-UTR进行同源性分析的结果
表明，其3-UTR具有很高的同源性(图 7)，说明
不同盐生植物NHX 基因可能具有相同的转录后加
工方式。
图 5 CgNHX基因 cDNA 3-UTR序列
黑体字部分为推测的对 mR N A 腺苷酸化起重要作用的位点。
图 6 AaNHX基因cDNA 3-UTR序列
黑体字部分为推测的对 mRNA 腺苷酸化起重要作用的位点。
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图7 AaNHX1-2、CgNHX1-4和 SsNHX 基因 3-UTR 的同源性分析
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讨　　论
本文结果显示 AaNHX 基因 3-UTR 与 CgNHX
基因 3-UTR同源性高达52%，两者与碱蓬同源性
分别达到 60% 和 54%，表明 NHX 基因的加工方
式可能相同，同时说明NHX 基因在野生植物中的
功能很重要。
Wahle和Keller[2]的研究表明，动物体核基因
的 mRNA 3 末端存在 AAUAAA 及富含 U 或 GU 的
两个重要保守序列。对许多 m R N A 而言，激活
需要3-UTR 内存在的不连续的序列 (AAUAAA 或
U-rich)以指导Poly(A) -mRNA的腺苷酸化，从而
使翻译得以顺利进行。然而，大多数植物核基因
mRNA 的 3 末端并不具有动物 AAUAAA 那样的保
守序列，但其多聚腺苷酸化效率并不受到影响[8]。
而且，存在于少数植物中的 AAUAAA 也不能被很
好地识别，说明对此顺式作用元件的需求在植物
中并不像在动物中那样严格，其调控作用在动、
植物中有一定的差异[9]。本文的序列分析结果表
明，克隆获得的4个 CgNHX 和 2个AaNHX 3-UTR
中 3CgNHX1-1 和 3AaNHX1-1 没有 AAUAAA，其
余 4 个样品均含有该序列，其存在的位置并不像
动物中那样保守，但均能进行有效的腺苷酸化，
因此推测该序列对植物 mRNA 的腺苷酸化并不起
关键作用，这与前人的结论相同。我们推测可能
有另一些序列控制着 mRNA 的腺苷酸化并控制翻
译的顺利进行，如 A T T C T T T ，该序列非常保
守，在碱蓬、碱蒿和灰绿藜的3-UTR 中均存在。
据此，我们还认为，3-UTR 富含 T 的不连续的
序列(图 5、图 6划线部分)可能对mRNA 的腺苷酸
化也起作用。
灰绿藜为分布广的物种，生存于各种生境，
适应能力强，与其 mRNA 3-UTR 的差异性大呈
正相关；而碱蒿的分布区域有限，仅生存于特定
的环境中，与其 mRNA 3-UTR 的差异性小也呈
正相关。这类相关性尚需要进一步研究证实。此
外，植物mRNA 3-UTR 的差异性与其适应能力之
间也可能有相关性，因为植物需要适应不同的生
境，以致基因表达调控呈现多样性，这可能是造
成植物和动物3-UTR 对 mRNA 的调控有很大差别
的原因。
总之，NHX 基因在植物中是非常保守的，在
植物耐高盐水平中起作用。这为进一步利用
CgNHX 和 AaNHX 3-UTR 内部的调控元件提高
NHX 基因在植物体内的表达水平、研究植物 NHX
基因的功能以及为采用该基因提高植物耐盐水平以
改良农作物品种中具有一定参考价值。
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