全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
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基金项目$国家
1,%
(计划前期研究专项"
!"#!23,!!!"$
#
作者简介$杨
!
艺"
#1&1
#!女!在读硕士研究生!主要从事植物分子生物学研究)
4(56.7
$
)*%!!*"$1
!88
+9:5
"
通信作者$张富春!博士!教授!主要从事分子生物学与基因工程研究)
4(56.7
$
;<9=
-
>
!?
56.7+9:5
灰绿藜液泡膜焦磷酸酶基因的克隆及表达分析
杨
!
艺!徐
!
莉!张
!
霞!张富春"
"新疆大学 生命科学与技术学院!新疆生物资源基因工程重点实验室!乌鲁木齐
&%""$*
#
摘
!
要$采用同源克隆的方法!获得盐生植物灰绿藜的液泡膜焦磷酸酶基因"
!"#
#全长
9@AB
!命名为
#
$
!"#
)生
物信息学预测分析表明!
#
$
!"#
基因包含一个
!!1!C
D
的开放阅读框!编码
,*%
个氨基酸)
2
?
EF#
不仅具有与植
物液泡膜焦磷酸酶共有的氨基酸序列
@EGB@HEGIE4
!而且
2
?
EF#
与其它植物的
EF#
相似性达
&*J
)跨膜结
构域预测显示!
2
?
EF#
氨基酸序列含有
#!
个跨膜螺旋区!可能定位于细胞膜系统上)
KL(F2K
检测表明!
!""
55:7
%
HA627
条件下萌发生长的灰绿藜!再进行
&""55:7
%
HA627
胁迫处理
!$M
后!
#
$
!"#
基因表达显著增强)
不同浓度
I27
*
2627
!
*
N
?
27
!
分别处理
!$M
!
I27
和
N
?
27
!
浓度增高!
#
$
!"#
基因表达下降!
2627
!
则不影响
#
$
!"#
基因表达)研究结果表明!灰绿藜
#
$
!"#
基因表达对不同种类盐胁迫响应不同!
A627
胁迫可以上调
#
$
!"#
基因表达)该研究结果有助于阐明盐胁迫对盐生植物灰绿藜
#
$
!"#
基因表达的调控作用)
关键词$灰绿藜&液泡膜焦磷酸酶"
EF#
#&基因表达&盐处理
中图分类号$
O,&)
&
O,&*
文献标志码$
B
$%"&(&!)*
+
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D
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2627
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27
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$./,1,- & \69>:76X DW X: D M:/ D M6Y6/V " EF# #& ? V0VV= D XV//.:0 & /67YYXV6Y5V0Y !! 中国盐渍土总面积占全国可利用土地面积的$+&&J
!盐渍化土壤能够严重影响农作物的产量+#,)
盐生植物受到盐胁迫!液泡膜上
A6
a
%
T
a逆向转运
蛋白能够将细胞质中过多的
A6
a区域化至液泡中!
降低细胞质中盐浓度!从而减轻对细胞器的毒害!提
高植物的耐盐性!因此!
A6
a的区域化分配是盐生植
物对盐渍环境适应的结果)而液泡膜上逆向转运蛋
白能够通过跨液泡膜的
T
a梯度来驱动转运+!(%,!并
且
T
a梯度的形成依赖于液泡膜上的
!
种质子泵$T a (BLF 酶和 T a ( 焦磷酸酶!它们分别以 BLF 和 焦磷酸为动力!将 T a泵到胞外和液泡中!从而形成 T a梯度+$,)研究表明植物细胞液泡膜焦磷酸酶
"
E69>:76X
DW
X:
D
M:/
D
M6Y6/V
!
EF#
#可利用焦磷酸为
动力将
T
a从细胞质转运至液泡内!从而产生电势
梯度+),)
随着分子生物学研究的不断深入!人们相继从
多种植物拟南芥*绿豆*陆地棉*盐地碱蓬*玉米*番
茄*盐穗木等克隆获得了
!"#
基因+*(#!,)
@>
D
:0Y
指出盐胁迫能够通过调节
!"#
基因表达和蛋白合
成促进
T
a 梯度形成+#%,)
6`0
?
等过量表达番茄
!"#
基因增加了番茄植株中离子向液泡膜的转运!
从而缓解盐胁迫对植株的伤害!增强番茄幼苗对盐
胁迫的耐性+#$,)由于不同环境条件或植物发育的 不同阶段中 !"# 基因表达水平主要是在转录水平 上进行调节的!从基因转录水平对 !"# 基因表达特 性进行探讨!有助于进一步阐明植物 !"# 基因的 功能) 藜科植物对盐碱*干旱和贫瘠等逆境的适应特 征!对改良盐渍化土壤有重要意义+#),)灰绿藜 " #%&( ) (*+,-$
./,1,-
#为藜科一年生草本植物!
广泛分布于世界各地!能在干旱贫瘠的土地上生长!
属典型的干旱区盐生植物!在较高浓度的盐胁迫下
能正常完成其生活史)本实验通过灰绿藜细胞液泡
膜焦磷酸酶 "
#
$!"# #基因克隆以及盐胁迫下 #$
!"#
基因表达变化的研究!探讨灰绿藜
#
$!"# 在抗逆生理中发挥的作用) # ! 材料和方法 <+< ! 植物材料 野生灰绿藜" #%&( ) (*+,-$
./,1,-
#的种子采
自新疆乌鲁木齐市地区!收集后保存待用)
<=>
!
灰绿藜的
?($% 胁迫处理 选择籽粒饱满的灰绿藜种子均匀撒在用 # % & N[ * # % &N[a!""55:7 % HA627 的营养液浸润的滤 纸上!使营养液刚刚没过种子!即种子在不同浓度 "* !""55:7 % H # A627 处理下萌发生长!待种子萌 发后 )Z !将其转移至蛭石中!并用 # % &N[ 和 # % & N[a!""55:7 % HA627 营养液隔 !Z 浇灌 # 次直 至成苗!再进行 &""55:7 % HA627 胁迫处理 !$M
!
分别检测灰绿藜对照组*经
&""55:7
%
HA627
胁迫
处理
!$M 和 !""55:7 % H 预处理再经 &""55:7 % H A627 盐胁迫处理 !$M
这
%
种处理组
#
$!"# 基因 的表达差异) <=@ ! 灰绿藜液泡膜焦磷酸酶基因的克隆 <=@=< ! 灰绿藜 1 6 78< 基因核心片段的获得 ! 根据 植物总 KAB 提取试剂盒"北京天根公司#操作说明 进行灰绿藜根的总 KAB 提取)依照 L6I6K6KAB F2KI.Y " L6I6K6 #操作指南进行!以 _7. ? : " ZL #作 为引物进行反转录合成 9@AB )根据已经报道的拟 南芥液泡膜焦磷酸酶基因的核苷酸序列" GV0360b 登录号 N&#&1!+# #!设计液泡膜焦磷酸酶基因的简 并上游引物" )c(BLGGLGG2G22LG2LLLGLL( %c #和下游引物" )c(G22BLBBG2LL GBL2BG GBLGLL(%c #!以 KAB 反转录产物 9@AB 为模板! 进行 KL(F2K 反应) F2K 反应扩增参数为 1$d
预
变性
!5.0
&
1$d 变性$)/
!
),+)d
退火
$)/ & ,!d 延伸 !5.0 ! %) 个循环& ,!d 延伸 #"5.0 !反应产物 进行琼脂糖凝胶电泳检测) <=@=> ! @A 末端快速克隆 ! 根照 %c(U>7KB242:XV [VY " L6I6K6 #操作指南!以灰绿藜根的总 KAB 为 模板!用 %c(KB24 接头引物进行反转录合成 9@( AB )根据已获得的核心片段设计 %c 上游特异性外 侧引 物 " G[F# #" )c(GGBLB2BL2LGGB22BL( 2B2(%c #和 %c 上游特异性内侧引物" G[F! #" )c( GB22BL2B2L2BB2BL22LG(%c #) F2K 反应首 先以 KAB 反转录产物 9@AB 为模板!使用 G[F# 和 %c(KB24 下游外侧引物进行 F2K 扩增!扩增参 数为 1$d
预变性
%5.0
&
1$d 变性 %"/ ! ))d 退火 %"/ & ,! d 延伸 #5.0 ! !" 个循环& ,! d 延伸 #" 5.0 )而后以该产物为模板!使用 G[F! 和 %c( KB24 下游内侧引物进行 F2K 扩增!扩增参数为 1$d
预变性
)5.0
&
1$d 变性 %"/ ! ))d 退火 %"/ ! ,!d 延伸 #5.0 ! %" 个循环& ,!d 延伸 #"5.0 ! F2K 反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测) <=@=@ ! 灰绿藜 1 6 78< 基因 4B?. 片段的克隆与测 序 ! 按 F2KUX6 ? 5V0YKV9:\VX W I.Y " L6I6K6 #说明 书进行 F2K 产物的回收)回收的片段与 D N@#&(L 载体在 L$@AB
连接酶的作用下
#*d
过夜连接!连
1%$% 期 !!!!!!!!!!!! 杨 ! 艺!等$灰绿藜液泡膜焦磷酸酶基因的克隆及表达分析
接产物转化
321(.+@T)
"
感受态细胞"北京全式金
公司#!酶切鉴定出阳性克隆后!送北京六合华大基
因科技股份有限公司测序)
<=C
!
灰绿藜
$D 36< 生物信息学分析 对灰绿藜 2 ? EF# 的氨基酸序列利用在线工具 376/Y " MYY D$%%
C76/Y+09C.+075+0.M+
?
:%
376/Y+9
?
.
#
和
@ABNBA
以及
N4GB$+" + #* ,软件!进行氨基酸 序列的序列比对和同源性分析)将 2 ? EF# 的氨基 酸序列输入 LNTNN[VX\VX\+!+" " MYY D$%%
]]]+
9C/+ZY>+Zb
%
/VX\.9V/
%
LNTNN
%#分析预测其蛋白
跨膜区域)将
2
?
EF#
的氨基酸序列输入
F/:XY
+
#,
,
软件"
MYY
D
$%% D /:XY+M ? 9+ -D % <:X5+MY57 #进行亚细胞 定位的分析预测) <=E ! 灰绿藜的 :$%
*
$($%
>
和
F
D
$% > 的胁迫处理 分别配制 #5:7 % H 的 I27 * 2627 ! * N ? 27 ! 母液! 加入 # % &N[ 营养液!使营养液终浓度分别是 I27 为 !"" *$""
和
*""55:7
%
H
!
2627
!
为
#""
和
!""
55:7
%
H
!
N
?
27
!
为
#""
和
!""55:7
%
H
)待灰绿藜
长至
$周龄时!用上述浓度盐溶液分别处理 !$M
!对
照为不加盐的
#
%
&N[
营养液处理
!$M 的灰绿藜) <=G ! 灰绿藜 1 6 78< 基因表达检测 以不同浓度 A627 和不同盐处理下的灰绿藜 #$
!"#9@AB
为模板!根据
9@AB
下游片段的特异
性!分别在
#
$!"# 基因 _KU 下游区和 %c(RLK 区 设计上游引物" )c(GB22BL2B2L2BB2BL22L( %c #和下游引物" )c(L2BG22LLG22LL2LBB2G( B2G(%c #!以 !&[ "上游引物 )c(G22GB222LGBL( 2LL2LGLGB(%c 和下游引物 )c(LB222BBGL( 2BGB2GBB2GBLL(%c #为参照基因) F2K 反应 条件为 1$d
预变性
!5.0
&
1$d 变性 !"/ ! )$d
退
火
!"/
&
,!d
延伸
!"/
!
%)
个循环&
,!d
延伸
#"
5.0
!反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测)
!
!
结果与分析
>=<
!
灰绿藜
1
6
78<
基因克隆及氨基酸同源性分析
利用
KB24
技术克隆获得了灰绿藜液泡膜焦
磷酸酶基因"
#
$!"# ! @O$$%,%#+#
#!包含一个
!!1!
C
D
的开放阅读框!编码
,*%
个氨基酸残基)用
@ABNBA
软件对灰绿藜
2
?
EF#
的氨基酸序列和
其它植物
EF#
部分氨基酸序列进行比对"图
#
#!发
图
#
!
植物
EF#
氨基酸序列比对
红色方框部分为
EF#
与催化相关的保守序列
U.
?
+#
!
B
D
6XY.6767.
?
05V0Y:8
>V09V/:D
XVZ.9YVZEF#
LMVXVZC7:9bZ.6
?
X65./YMV9:0/VX\VZ/V
?
5V0Y60Z
D
>Y6Y.\V96Y67
W
Y.9/.YV:"$$
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图
!
!
不同植物基于
EF#
氨基酸序列的系统进化树
分支上的数字表示
3::Y/YX6
D
验证中基于
#"""
次重复该节点的可信度&标尺表示演化距离
U.
?
+!
!
FM
W
7:
?
V0VY.9YXVV:D
760Y/C6/VZ:065.0:69.Z/V
8
>V09V/:LMV0>5CVX/:0YMVCX609MV/XV
D
XV/V0YYMVXV7.6C.7.Y
WD
VX9V0Y:D
/\67>V/C6/VZ:0#"""XV
D
7.96Y.:0/
&
[967V
D
76YVXV
D
XV/V0Y/YMVV\:7>Y.:0Z./Y609V:D
760Y/
现灰绿藜
2
?
EF#
的氨基酸序列也具有植物作为
EF#
的催化位点并且共有保守的氨基酸片段
@E(
GB@HEGIE4
)灰绿藜
2
?
EF#
氨基酸序列同源
性分析表明!其与拟南芥*盐角草*盐爪爪*盐穗木*
烟草*陆地棉*玉米*水稻的
EF#
氨基酸序列相似性
分别为
&,J
*
1%J
*
1%J
*
1"J
*
1"J
*
&1J
*
&*J
和
&*J
)运用
N4GB$+" 软件对 #! 种植物的 EF# 氨 基酸序列构建系统进化树"图 ! #!结果表明 2 ? EF# 与红叶藜 EF# 关系最近并在同一分支上) >=> ! 灰绿藜$
D
36<
蛋白的跨膜结构域预测和分析
跨膜结构域是膜内在蛋白与膜脂相结合的主要
部位!它固着于细胞膜上起锚定作用)通过
LN(
TNN[VX\VX\+!+"
工具"
MYY
D
$%% ]]]+9C/+ZY>+ Zb % /VX\.9V/ % LNTNN %#预测 2 ? EF# 的跨膜螺旋 区)预测结果显示! 2 ? EF# 氨基酸序列中存在 #! 个跨膜螺旋区!可推测 2 ? EF# 蛋白定位于细胞膜系 统!属于跨膜转运蛋白) >=@ ! 灰绿藜$
D
36<
蛋白的亚细胞定位
应用
F/:XY
工具"
MYY
D
$%% D /:XY+M ? 9+ -D % <:X5+ MY57 #预测 2 ? EF# 的亚细胞定位"表 # #!结果表明 其可能定位于细胞膜系统*内质网"膜#*高尔基体和 内质网"腔#)表 # 显示 2 ? EF# 定位于内质网"膜# 的概率最高!为 "+&!" !定位于细胞质膜其次!为 "+*&) !定位于高尔基体和内质网"腔#的概率较小) 表明 2 ? EF# 可能定位于细胞膜系统上!作为跨膜转 运蛋白在离子的调控运输中发挥重要作用) >=C ! 不同浓度盐处理下 1 6 78< 基因的表达 对在不同 A627 浓度"* !""55:7 % H #下萌发生 长的灰绿藜!再进行 &""55:7 % HA627 不同方式的 胁 迫处理 !$M
!检测
#
$!"# 基因表达情况)结果 表 < !$
D
36<
蛋白亚细胞定位
L6C7V#
!
[>C9V7>76X7:96Y.:0:<
D
X:9M
W
5:/.0:<2
?
EF#
亚细胞定位
[>C9V7>76X7:96Y.:0
概率
FX:C6C.7.Y
W
膜系统
NV5CX60V/
W
/YV5 "+&!"
内质网"膜#
40Z:
D
76/5.9XVY.9>7>5
"
5V5CX60V
#
"+*&)
高尔基体
G:7
?
.C:Z
W
"+$*" 内质网"腔# 40Z: D 76/5.9XVY.9>7>5 " 7>5V0 # "+#"" 图 % ! 不同 A627 胁迫处理下灰绿藜 #$
!"#
基因的表达
U.
?
+%
!
LMVV=
D
XV//.:0:<#
$
!"#>0ZVX
Z.<表明!与对照组相比较!未经
!""55:7
%
HA627
预处
理!直接受到
&""55:7
%
HA627
胁迫的灰绿藜!
#
$!"# 基因表达受到明显抑制!而 !""55:7 % H A627 预处理后!再进行 &""55:7 % HA627 胁迫的 灰绿藜! #$
!"#
基因的表达明显增强"图
%
#)
用不同浓度
I27
处理灰绿藜
!$M 后!检测灰绿 藜 #$
!"#
基因的表达!结果表明!较低浓度"
!""
55:7
%
H
#
I27
不影响灰绿藜
#
$!"# 基因的表达! 而较高浓度 "$""
和
*"" 55:7
%
H
#
I27
则抑制
#
$!"# 基因的表达"图$
!
B
#)
用不同浓度
2627
!
处理灰绿藜
!$M !检测灰绿 藜 #$
!"#
基因表达情况!结果表明!灰绿藜
#
$!"# 基因的表达基本不受 2627 ! 影响!不同浓度 2627 ! 处理后 #$
!"#
基因的表达没有变化"图
$! 3 #) #$$% 期 !!!!!!!!!!!! 杨 ! 艺!等$灰绿藜液泡膜焦磷酸酶基因的克隆及表达分析
图
$! 不同浓度 I27 " B #! 2627 ! " 3 #和 N ? 27 ! " 2 #处理 !$M
后灰绿藜
#
$!"# 基因的表达 U. ? +$
!
LMVV=
D
XV//.:09M60
?
V/:<#
$
!"#>0ZVXZ.<"
B
#!
2627
!
"
3
#
60ZN
?
27
!
"
2
#
9:09V0YX6Y.:0/
!!
用不同浓度
N
?
27
!
处理灰绿藜
!$M !检测灰绿 藜 #$
!"#
基因表达情况!结果表明!灰绿藜
#
$!"# 基因表达受 N ? 27 ! 的影响很大!随着 N ? 27 ! 浓度增 大! #$
!"#
基因的表达逐渐减弱"图
$! 2 #) % ! 讨 ! 论 灰绿藜是广布的盐生植物!对环境的适应能力 强!能够耐受盐的胁迫)对克隆的 #$
!"#
基因通
过生物信息学分析!明确了所获得的
2
?
EF#
蛋白不
仅具有植物液泡膜焦磷酸酶共有氨基酸序列
@E(
GB@HEGIE4
!而且
2
?
EF#
与其它植物的
EF#
相
似性达
&*J
!是跨膜蛋白)已有的研究表明
EF#
在植物生长发育过程通过调节激素运输对植物的生
理功能起调控作用!并且与植物的耐盐性密切相
关+#,(#1,)
G6=.:76
等+!",在盐敏感的
&/#
酵母突变
体中过量表达拟南芥液泡
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和根中积累了更多的
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本研究将灰绿藜种子在对照培养液"
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过盐胁迫处理的幼苗!继续用高浓度的
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#
$!"# 基因的表 达明显增强!而不经盐胁迫预处理的灰绿藜幼苗在 高盐胁迫 !$M
后
#
$!"# 基因的表达则明显受到抑 制!可以表明不经盐预处理的灰绿藜幼苗!在直接受 到 &""55:7 % HA627 胁迫时!所引起的伤害致使 #$
!"#
基因表达下降!幼苗的生长也受到了抑制!
从后续的植物生长状况弱小可直观看出来)而经过
盐预处理的灰绿藜幼苗即盐驯化后的幼苗在受到同
样的处理时!表现出
#
$!"# 基因表达明显增加!说 明灰绿藜幼苗能够耐受盐胁迫而不影响其生长!同 时增加 #$
!"#
基因的表达减缓盐胁迫造成的伤
害!从而体现了
#
$!"# 基因的双重作用!不仅与灰 绿藜的生长相关!也与灰绿藜耐盐性提高有关!这表 明盐的驯化能够提高植物的耐盐性) 不同的盐类具有不同的金属离子!对不同盐离 子胁迫表现的 !"# 基因表达活性的研究!表明各种 金属离子在 !"# 基因发挥作用的信号通路中分别 起到不同的调控作用+!%(!$,)
26
!a在植物各种信号
通路中都起到了重要的作用!
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等+!),研究表明
"+#55:7
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的
26
!a能显著抑制
!"#
的活性)但
#
$!"# 基因表达对 2627 ! 并不敏感!说明其表达调 控可能是非 26 !a依赖性的)有研究表明 !"# 活性 尤其是 T a转运活性的形成表现出对 I a的绝对需 要+!*,! HVV 等+!,,研究表明 )"55:7 % H 的 I a可以使 !"# 的活性提高 * 倍)但较高浓度的 I27 会抑制 !"# 的表达活性!推测这种抑制可能是由较高浓度 27 胁迫造成的& M`.YV 等+!&,的研究表明 N ? !a可以 增强 !"# 的活性!这与本研究结果 #$
!"#
的表达
下降不一致!外加
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!a浓度
#
$!"# 表达活性均受 到抑制!表现出 #$
!"#
表达对
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!a 的敏感性比
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!a和
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!"#
表达受盐离子调控因植物
种类不同尤其是盐生植物种类而表现出明显差异!
!"#
基因表达对不同盐离子的敏感性不同!也许会
影响不同的信号传导通路)研究灰绿藜
#
$!"# 在 不同盐胁迫下的表达调控!有助于今后从离子转运 基因功能角度阐明灰绿藜耐盐的分子机理) 参考文献! + # , ! PBAGe[ "杨劲松# +LMVZV\V7: D 5V0Y60Z D X:/ D V9Y:<2M.06/67.0V/:.7XV/V6X9M + e , +416/"&*(.($
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