全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2016, 52 (3): 250–258　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0584250
收稿 2015-10-28　　修定 2016-02-02
资助 国家自然科学基金(31371556)。
** 共同通讯作者(E-mail: hnzrz@aliyun.com; ylfri@126.com)。
橡胶树WRKY家族转录因子HbWRKY75基因的克隆及表达分析
陈晓丽1,2, 闫栋2,3, 孙丽娜2, 曾日中2,*, 杨礼富2,*
1山东大学生命科学学院, 济南250100; 2中国热带农业科学院橡胶研究所, 农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点开放实
验室, 省部共建国家重点实验室培育基地, 海南儋州571737; 3海南大学农学院, 海口570228
摘要: 从巴西橡胶树无性系PR107的叶片组织中克隆了1个新的WRKY家族转录因子基因, 命名为HbWRKY75, 其ORF序列
长为603 bp, 编码201个氨基酸。生物信息学分析表明, HbWRKY75在N端第110~160氨基酸之间含有1个典型的WRKY结构
域, 属II类WRKY转录因子家族成员, 与葡萄、大豆、油棕、陆地棉和拟南芥等同类基因序列的同源性分别为92%、
85%、71%、63%和57%。实时荧光定量RT-PCR分析表明, HbWRKY75基因在橡胶树叶片组织中的表达量最高, 而在叶柄
组织中的表达量最低; HbWRKY75基因在橡胶树衰老晚期叶片中的表达量高于其他叶片发育时期; 乙烯利、茉莉酸甲酯
(MeJA)、聚乙二醇 (PEG)、H2O2、NaCl、低温处理及机械损伤均可不同程度地诱导HbWRKY75基因的上调表达; 但ABA
处理则诱导HbWRKY75基因的下调表达。HbWRKY75可能是与橡胶树叶片衰老和响应乙烯等激素刺激相关的转录因子,
并在橡胶树响应NaCl和低温等逆境胁迫中可能发挥调控作用。
关键词: 巴西橡胶树; 转录因子HbWRKY75; 基因表达; 激素处理; 逆境胁迫
研究报告 Original Papers
天然橡胶具有很强的弹性、良好的绝缘性、
耐曲折的可塑性、隔水隔气的气密性、抗拉伸和
坚韧的耐磨性能等, 被广泛用于国防、交通和医
药卫生等领域, 是一种不可替代的重要工业原料
和战略资源(李建华等2013)。目前, 巴西橡胶树是
天然橡胶的主要来源(李希娟等2015), 主要在亚
洲、中美洲和非洲等热带地区种植(安锋等2012)。
我国是橡胶树的非传统植胶区, 天然橡胶生产受
到低温寒害、风害及干旱等逆境胁迫的严重影响,
对橡胶树品种抗逆性提出了更高的要求, 培育高
产多抗橡胶树新品种是我国天然橡胶生产中的重
要研究课题之一(吴春太等2012)。
转录因子在调控植物生长发育及逆境胁迫反
应中的研究得到越来越多的重视。WRKY家族转
录因子是近年来研究较多的一类植物特有的转录
因子, 在植物体生命活动中发挥重要作用, 其中包
括调控植物体的生长发育和衰老进程、参与响应
各种非生物胁迫和抗病防御反应等。WRKY转录
因子大多以家族形成存在, 它们含有1个或2个由
WRKYGQK氨基酸残基和C2H2 (或C2HC)锌指结
构组成的WRKY结构域, 可特异结合下游靶基因
启动子的TTGAC(C/T)序列(W盒), 从而调控逆境
胁迫等相关基因的表达(Wu等2005)。通过基因组
测序分析, 许多植物的WRKY家族转录因子基因
及其生物学功能得到鉴定。拟南芥的基因组至少
含有72个WRKY转录因子基因, 水稻基因组则含
有109个WRKY转录因子基因(Eulgem等2000), 并
且至少有67个转录因子被证明至少对一种非生物
胁迫差异表达(孙利军等2014)。研究表明, 拟南芥
WRKY家族转录因子基因AtWRKY4、AtWRKY11
和AtWRKY53与植物生长发育及衰老有关(Miao等
2004; Eulgem等2000); AtWRKY22和AtWRKY29也
已被确定参与信号通路转导(Asai等2002); At-
WRKY41参与病原菌诱导的防御反应(Higashi等
2008); 水稻WRKY家族转录因子基因OsWRKY30
和OsWRKY83参与了对水杨酸(salicylic acid, SA)和
茉莉酸(jasmonic acid, JA)等信号分子的响应(Ryu
等2006)。此外, WRKY家族转录因子在植物响应
盐害等非生物胁迫反应中也发挥重要作用(Ling等
2001; Fan等2015)。
迄今为止, 有关橡胶树WRKY家族转录因子
研究的报道相对较少。据预测, 橡胶树基因组含
有81个WRKY转录因子基因(Li等2014)。研究表
明, 橡胶树WRKY家族转录因子HbWRKY1是1个
橡胶生物合成相关小橡胶粒子蛋白(small rubber
particle protein, SRPP)的负调控因子(Wang等2013),
HbWRKY3和HbWRKY9可能参与橡胶树对逆境
胁迫的反应(谢黎黎等2013; 赵武帅等2015)。橡胶
陈晓丽等: 橡胶树WRKY家族转录因子HbWRKY75基因的克隆及表达分析 251
树WRKY家族转录因子的研究将有助于进一步探
明橡胶树产胶及抗逆的生理与分子机制。本研究
在转录组序列分析基础上, 从巴西橡胶树叶片组
织中克隆了1个与拟南芥AtWRKY75基因高度同源
的新WRKY转录因子基因(HbWRKY75), 并对其在
橡胶树不同组织和不同发育时期叶片以及外源生
长调节物质等处理下的表达特性进行了分析, 为
深入研究该基因在橡胶树中的生理功能与作用奠
定了一定基础。
材料与方法
1 实验材料与试剂
实验所用材料为巴西橡胶树(Hevea brasiliensis
Muell. Arg.)无性系PR107的成熟未开割实生树与
组培苗。橡胶树不同组织(根、树皮、木质部、
芽、叶柄、胶乳、叶片)和不同发育时期叶片(古
铜期、变色期、淡绿期、稳定期、衰老早期、衰
老中期、衰老晚期)采自种植于中国热带农业科学
院试验场三队的实生树。
反转录试剂盒(PrimerScript® RT Reagent Kit
With gDNA Eraser)、PCR试剂盒(PrimerSTAR HS
DNA Polymerase)、SYBR® Premix EX TaqTM II
(Perfect Real Time)购自大连宝生物公司; 其他试剂
均为国产分析纯。PCR引物合成和测序委托上海
英潍捷基生物技术有限公司完成。
2 实验方法
2.1 不同处理
实验处理材料叶片采自处于稳定成熟期的橡
胶树组培苗, 用形状和大小相似的离体叶片进行
处理, 处理方参照Sravan等(2009)的激素和胁迫处
理方法, 每个处理设3个生物学重复, 处理时间为0
(对照)、3、6、12和24 h, 每个处理样品取3片叶。
样品实验处理如下。
PEG、H2O2和NaCl胁迫处理: 将叶片分别置
于加入用15 mL的30% PEG6000、15 mL的0.05
mmol·L-1 H2O2和15 mL的250 mmol·L
-1 NaCl的培
养皿中离体处理。生长调节物质处理: 将叶片分
别置于加入15 mL的0.05 mmol·L-1 脱落酸(abscisic
acid, ABA)、15 mL的1 mmol·L-1水杨酸(SA)、15
mL的0.5 mmol·L-1乙烯利(ethrel, Eth)和15 mL的0.05
mmol·L-1茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)的培
养皿中离体处理。机械损伤处理: 用消毒过的剪
刀将叶片剪成大小相似的小块, 在培养皿中离体
处理。冷害处理: 将叶片放入培养皿, 于4°C培养
箱中离体处理。对照处理: 叶片在含15 mL蒸馏水
的培养皿中进行离体处理。
2.2 橡胶树不同组织的总RNA提取和cDNA第一
链的合成
橡胶树胶乳和其他部位总RNA提取参照曾日
中等(2003)的方法; cDNA第一链的合成参照试剂
盒Primer Script® RT Reagent Kit With gDNA Eraser
(Takara)说明书。
2.3 转录因子HbWRKY75基因克隆、序列及进化分析
设计HbWRKY75的开放阅读框(ORF)设计引
物HbWRKY75-F 和HbWRKY75-R (表1), 以反转
录的cDNA为模板进行PCR, 反应体系为: 4 μL
cDNA模板, 10 μL 5 mmol·L-1 5×PrimeSTAR Buffer
(Mg2+ plus), 4 μL 2.5 mmol·L-1 dNTP Mixture, 1 μL
20 μmol·L-1 HbWRKY75-HindIII, 1 μL 20 μmol·L-1
HbWRKY75-XmaI, 0.5 μL 2.5 U·μL-1 Prime STAR HS
DNA Polymerase, 加dd H2O至50 μL。PCR反应条件
为: 94°C预变性3 min; 94°C预变性30 s, 55°C退火30
s, 72°C延伸1.0 min, 35个循环; 72°C延伸5 min。
多序列比对和进化树的构建采用ClustalW2
(Thompson等1994; Tamura等2007)和MEGA 4.0
(Tamura等2007) (用Neighbor-Joing法, Bootstrap值
表1 实验所用引物
Table 1 Primers used in this experiment
引物名称 序列 注释
HbWRKY75-F 5 AAGCTTATGGAGAATAATTTTACATCAT 3 读码框PCR扩增
HbWRKY75-R 5 CCCGGG TTAAAAGGAAGTAGTGTAG 3
HbWRKY75-Fq 5 ATATGGTCAAAAGGCTGTCA 3 荧光定量PCR
HbWRKY75-Rq 5 ATGCTCAAAGTTATCGGTGGAC 3
Hb18SrRNA-F 5 GCTCGAAGACGATCAGATACC 3 内参基因
Hb18SrRNA-R 5 TTCAGCCTTGCGACCATAC 3 内参基因
植物生理学报252
设为1 000); 蛋白的一级结构分析采用ProtParam和
ProtScale (http://web.expasy.org/); 保守结构域分析
采用SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/); 基
因相似性比对采用Vector NTI11中的AlignX和
NCBI Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) ;
基因序列ORF的分析以及基因编码氨基酸序列的
推导采用Editseq V7.1和NCBI数据库中的ORF
finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html);
亚细胞定位分析采用Wolf Psort Prediction软件
(http://www.genscript.com/psort/wolf_psort.html)。
2.4 转录因子HbWRKY75基因的表达分析
根据测序结果, 设计特异引物HbWRKY75 Fq
和HbWRKY75 Rq (表1); 以18S rRNA作为参照基因,
分别对反转录后不同组织和不同叶片处理cDNA进
行荧光定量分析, 反应体系为: 2 μL cDNA模板、
12.5 μL Premix TaqTM、0.5 μL HbWRKY75 Fq (20
μmol·L-1)、0.5 μL HbWRKY75 Rq (20 μmol·L-1)、加
dd H2O至25 μL。18S和目的基因的PCR反应条件
均为: 94°C预变性3 min; 94°C预变性30 s, 55°C退火
30 s, 72°C延伸20 s; 72°C延伸5 min, 18S和Hb-
WRKY75循环数分别为20和30。每个材料做3独立
重复, 以Hb18SrRNA作为内参基因, 采用2-ΔΔCT方法分
析处理数据。用SAS V7.05软件进行显著性分析。
实验结果
1 橡胶树HbWRKY75基因的克隆及序列分析
在橡胶树叶片组织转录组测序基础上, 通过
RT-PCR扩增从橡胶树叶片组织中获得了1个WRKY
转录因子基因的cDNA序列, 命名为HbWRKY75,
该基因的ORF序列长度为603 bp, 编码由201个氨
基酸组成的蛋白质。生物信息学分析表明, Hb-
WRKY75蛋白的分子量为14.17 kDa, 等电点pI为
9.11, 在其C端的第121~178氨基酸之间存在1个
WRKY转录因子特有的WRKY保守结构域(图1),
具有核定位信号(EKKIRKPRYAFQTRSQVDILD-
DGYRWRKYGQ), 是在细胞核内表达的转录因
子。该基因序列已提交至GenBank数据库, 登录号
为KT906563。
2 HbWRKY75同源性及进化树分析
用Neighbor-jointing方法构建了橡胶树Hb-
WRKY75与其他植物的WRKY家族同类基因的蛋
白系统进化树, 这些WRKY转录因子分别来自于
蔷薇科、桑科、葡萄科、大戟科和棕榈科等植
物。进化树结果显示, HbWRKY75与葡萄、拟南
芥、大豆、陆地棉等植物的WRKY转录因子同源
性较高(图2)。运用DNAMAN V6.0对HbWRKY75
图1 橡胶树HbWRKY75基因的核苷酸序列及其氨基酸序列
Fig.1 Nucleotide and amino acid sequences of HbWRKY75 from H. brasiliensis
下划线部分为WRKY保守结构域; *为终止密码子。
陈晓丽等: 橡胶树WRKY家族转录因子HbWRKY75基因的克隆及表达分析 253
和与其在进化树上较近的葡萄WRKY75、大豆
WRLY45、油棕WRKY75、陆地棉WRKY60和拟
南芥WRKY75蛋白进行多序列比对, 结果表明, 用
于比对的WRKY转录因子均只含有一段保守的
WRKY结构域, 其锌指结构为C2H2型, 属于第二类
WRKY家族转录因子(图3)。
3 HbWRKY75基因的表达模式分析
3.1 HbWRKY75基因基因在橡胶树不同组织及不
同发育时期叶片中的表达分析
为更好地了解HbWRKY75基因的生理功能,
对HbWRKY75基因在成熟未开割橡胶树不同组织
(根、芽、叶柄、叶片、胶乳、木质部和树皮)及
不同发育时期叶片中的表达水平进行了分析。
HbWRKY75基因在橡胶树不同组织中的表达量存
在显著差异, 在叶片中表达量最高, 叶柄中表达量
最低, 叶片中HbWRKY75基因的表达量是叶柄的10
多倍(图4-A); 在橡胶树不同发育时期叶片中, 随着
叶片的衰老, HbWRKY75基因的表达量显著升高,
衰老晚期叶片中HbWRKY75基因的表达量最高(图
4-B)。
图2 橡胶树HbWRKY75与其他植物WRKY蛋白的系统进化树分析
Fig.2 Phylogenetic analysis of HbWRKY75 with other WRKY transcription factors from different plant species
框中标示为橡胶树HbWRKY75转录因子; 左边线上数字为Bootstrap value值; 括号内为各物种基因登录号。
图3 橡胶树HbWRKY75与其他植物WRKY蛋白的多序列比对分析
Fig.3 Multiple alignment of the deduced protein of HbWRKY75 with other WRKY proteins
划线部分表示WRKY结构域; *部分表示WRKYGQK氨基酸序列; ↓表示C2H2锌指结构基序。
植物生理学报254
3.2 外源生长调节物质处理对橡胶树叶片Hb-
WRKY75基因表达的影响
结果(图5)表明, 外源生长调节物质处理对橡胶
树离体叶片HbWRKY75基因的表达具有显著影响。
ABA处理显著抑制HbWRKY75基因的表达(图5-A)。
乙烯利处理叶片12 h后HbWRKY75基因极显著上调
表达, 表达量是对照的108倍, 随后又降低至对照水平
(图5-B)。 SA和MeJA刺激下, 叶片HbWRKY75基因均
展现出双峰模式, 并在3和12 h到达峰值(图5-C和D)。
3.3 H2O2等非生物胁迫对橡胶树叶片HbWRKY75
基因表达的影响
橡胶树离体叶片在H2O2、机械损伤、PEG、
NaCl和低温处理下, HbWRKY75基因几乎呈现出相
似的“双峰”表达模式, 但在不同处理的同一时间点
上, HbWRKY75基因的表达水平还是存在较大差异
(图6), 其中PEG、NaCl及低温处理均可大幅度提
高橡胶树离体叶片HbWRKY75基因的表达水平。
PEG和NaCl处理12 h叶片的HbWRKY75基因表达
量分别是对照样品的9倍和7倍以上。
讨　　论
本研究从巴西橡胶树无性系PR107的叶片组
织中克隆了1个WRKY家族转录因子基因Hb-
WRKY75, 其cDNA序列与目前已报道的橡胶树
WRKY家族转录因子基因序列无显著相似性, 而
与葡萄、大豆、油棕和拟南芥等植物的WRKY75
等基因具有较高的同源性。橡胶树HbWRKY75和
拟南芥AtWRKY75一样 , 含有一个高度保守的
图4 HbWRKY75基因在橡胶树不同组织及
不同发育时期叶片中的表达
Fig.4 Expression of HbWRKY75 in different tissues
and leaves of H. brasiliensis
图A中的叶片为图B中衰老晚期叶片。不同小写字母表示显
著性差异(P<0.05), 下图同此。
图5 外源生长调节物质处理下橡胶树叶片HbWRKY75基因的表达分析
Fig.5 Expression analysis of HbWRKY75 in leaves of H. brasiliensis under the exogenous growth regulating substance treatments
陈晓丽等: 橡胶树WRKY家族转录因子HbWRKY75基因的克隆及表达分析 255
WRKY结构域和一个C2H2锌指结构基序, 属第II类
WRKY转录因子(Eulgem等2000)。WRKY家族转
录因子具有多种多样的生理功能。拟南芥At-
WRKY75具有抗病原菌和调节磷酸盐饥饿反应的
作用, 并且与根的发育和植物衰老有密切关系(De-
vaiah等2007; Rishmawi等2014; Chen等2013; Li等
2012), 与AtWRKY75亲缘关系较近的JcWRKY48
则与非生物胁迫的应答反应有关(Xiong等2013)。
棉花的GarWRKY75和水稻的OsWRKY75可能分
别与植物耐盐性及对ABA信号的响应有关(Xie等
2005; Fan等2015)。因此, 橡胶树叶片的HbWRKY75
也可能具有拟南芥等植物的WRKY75转录因子相
似的生物学功能。
叶片衰老是叶片发育的最后一个阶段, 叶片
逐渐黄化, 并伴随着营养物质从老叶向新叶和种
子转移的过程(王建勇等2011), 其中WRKY家族转
录因子在植物叶片衰老的信号转导途径中发挥重
要作用(余迪求等2006)。拟南芥AtWRKY6基因在
衰老叶片中表达最强, 可能是与叶片衰老相关的
WRKY转录因子(Robatzek和Somssich 2001), 分子
遗传学研究结果证明AtWRKY75是叶片衰老正向
调节基因, 其RNAi植株和atwrky75突变体植株莲
座叶的衰老进程均显著延缓(Li等2012)。Hb-
WRKY75基因在橡胶树衰老晚期叶片中的高水平
表达 , 表明该转录因子可能与AtWRKY6和At-
WRKY75相似, 是橡胶树叶片衰老过程的正调控
因子。植物叶片发育与衰老的生理与分子机制相
当复杂, 涉及一系列相关基因在时空上的有序表
达, 激素信号及环境因子等通过调控这些基因的
表达调节叶片发育与衰老进程。研究表明, 乙稀、
图6 非生物胁迫下橡胶树叶片HbWRKY75基因的表达分析
Fig.6 Expression analysis of HbWRKY75 in H. brasiliensis leaves under abiotic stresses
植物生理学报256
茉莉酸甲酯(MeJA)等植物激素都具有促进叶片衰
老的作用(王建勇等2011; Zhang和Gan 2012)。
MeJA通过在转录水平激活SAGs的亚基促进叶片
衰老(葛云侠等2008); 乙烯通常被认为是一种与衰
老相关的植物激素, 外源乙烯处理可促进叶片和
切花衰老(Abeles等1988)。本研究采用乙烯利(一
种乙烯释放剂)和外源MeJA处理离体橡胶树叶片,
均可使橡胶树叶片很快呈现衰老状态。乙烯利和
MeJA处理的橡胶树叶片HbWRKY75基因均极显著
上调表达, 这些结果表明转录因子HbWRKY75在
乙烯和JA诱导橡胶树叶片衰老的信号转导中发挥
重要调控作用。
与乙烯利和MeJA处理一样, 外源ABA处理也
可使橡胶树叶片在24 h内出现黄化衰老的表型变
化, 这表明ABA对橡胶树叶片衰老也具有正向调
节作用; 但与本研究中的乙烯利和MeJA处理不同
的是, ABA处理显著抑制橡胶树叶片HbWRKY75的
基因表达, 这一结果与拟南芥AtWRKY75对ABA信
号的响应方式也不同(Li等2012)。植物体叶片
ABA水平的升高是叶片衰老的重要内因(Gepstein
和Thimann 1980; Choi和Hwang 2011), WRKY转录
因子是植物体内ABA信号转导途径中的关键组分
(Rushton等2012), 因此, 转录因子HbWRKY75在
ABA诱导橡胶树叶片衰老中的生理作用可能与乙
烯和JA不完全相似。
除对植物激素信号的响应外, 许多非生物胁迫
都可显著和快速地诱导WRKY家族转录因子基因
的表达, 因此, WRKY家族转录因子在植物逆境信
号转导中也具有重要作用(Ülker和Somssich 2004;
Fan等2015)。PEG 、NaCl、低温处理及机械损伤
等非生物环境胁迫均可不同程度地诱导橡胶树Hb-
WRKY75基因的上调表达, 这与拟南芥和水稻等模
式植物以及辣椒、大麦、马铃薯、棉花、遏蓝菜
等作物WRKY家族转录因子基因对非生物胁迫的
反应模式基本相同(Huang和Duman 2002; Hwang等
2005; Mare等2004; Wei等2008; Encinas-Villarejo等
2009; 杨淑巧等2014)。这些结果表明, HbWRKY75
转录因子也可能参与橡胶树对低温等多种非生物
胁迫的响应。
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Cloning and expression analysis of HbWRKY75 gene in leaf from Hevea brasiliensis
CHEN Xiao-Li1,2, YAN Dong2,3, SUN Li-Na2, ZENG Ri-Zhong2,*, YANG Li-Fu2,*
1College of Life Sciences, Shangdong University, Ji’nan 250100, China; 2Key Laboratory of Ministry of Agriculture for Rubber
Tree Biology and Genetic Resource Utilization, State Key Laboratory Incubation Base, Rubber Research Institute, Chinese Acad-
emy of Tropical Agricultural Sciences (CATAS), Danzhou, Hainan 571737, China; 3College of Agriculture, Hainan University,
Haikou 570228, China
Abstract: A novel WRKY gene was cloned by RT-PCR from the leaf tissue of Hevea brasiliensis (para rubber
tree) and designated as HbWRKY75. The open reading frame (ORF) of HbWRKY75 gene was 603 bp encoding
a protein with 201 amino acid residues. The HbWRKY75 had a typical WRKY domain from amino acid 110 to
160 and belonged to the class II protein of the WRKY transcription factor family. The homology analysis re-
vealed that HbWRKY75 shared amino acid sequence identities of 92%, 85%, 71%, 63% and 57% with the
WRKY75 protein from Vitis vinifera, Zea mays, Elaeis guineensis, Nelumbo nucifera, and Gossypium hirsutum.
The expression pattern of HbWRKY75 gene was investigated using real-time quantitative PCR, and the results
demonstrated that the transcript level of HbWRKY75 gene in leaves was significantly higher than those in other
parts of rubber trees. HbWRKY75 gene was differentially expressed in leaves with different developmental stag-
es, and mostly expressed in the leaf at the late stage of senescence. The expression level of HbWRKY75 gene in
the young leaves greatly increased compared with those of the control samples of rubber trees treated with
Ethephon, MeJA (methyl jasmonic acid), PEG (polyethylene glycol), H2O2, NaCl, low temperature and bark
tapping (mechanical damage); but ABA treatment down-regulated the expression of HbWRKY75. The presented
data suggested that HbWRKY75 may be a transcription factor involved in the leaf senescence and the responses
to phytohormones such as ethylene etc., and play a regulatory role in response to abiotic stresses such as NaCl
and low temperature of rubber trees.
Key words: Hevea brasiliensis; HbWRKY75; gene expression; phytohormone; abiotic stress
Received 2015-10-28 Accepted 2016-02-02
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31371556).
*Co-corresponding author (E-mail: hnzrz@aliyun.com; ylfri@126.com).