全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 5期，2007年 10月902
富含绿原酸的植物中类黄酮测定方法探讨
周春华 1,2,*，孙崇德 2，李鲜 2
1扬州大学园艺与植物保护学院，江苏扬州 225009；2浙江大学果实分子生理与生物技术实验室，农业部园艺植物生
长发育与生物技术开放实验室，杭州 310029
Study on Method for Flavonoids Determining of Plant Rich in Chlorogenic
Acid
ZHOU Chun-Hua1,2,*, SUN Chong-De2, Li Xian2
1College of Horticulture and Plant Protection, Yangzhou University, Yangzhou, Jiangsu 225009, China; 2Laboratory of Fruit
Molecular Physiology and Biotechnology, The Ministry of Agriculture’s Laboratory of Horticultural Plant Growth, Development
and Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China
提要：以枇杷花、枇杷叶和金银花为材料，研究绿原酸干扰类黄酮测定的结果表明，差示分析法基本上不受绿原酸的干
扰，可用于富含绿原酸植物中类黄酮的测定；而NaNO2-Al(NO3)3比色法和二甘醇比色法均受绿原酸的严重干扰，测得的
类黄酮含量明显偏高，NaNO2-Al(NO3)3比色法测得的结果甚至超过总酚含量。
关键词：类黄酮；测定方法；绿原酸；芦丁
收稿 2007-06-28 修定 　2007-09-05
资助 浙江省科技厅重点科研国际合作项目(20 06C2 4005 )。
* E - m a i l：n o n g z c h @ y a h o o . c o m . c n；T e l：0 5 1 4 -
87696816
类黄酮是酚类物质中的一种，广泛存在于植
物体内，是重要的膳食抗氧化剂，其对预防人们
日常生活中的氧化破坏有作用(Wolfe等 2003；
Hassimotto等 2005)。由于类黄酮可以减轻与老年
相关的疾病，因此富含类黄酮的植物性食物日益
受到人们的关注(Peer和Murphy 2006)。类黄酮测
定的方法有分光光度法和高效液相色谱法
(HPLC)，前者由于操作简便、快速且费用少而得
到广泛应用，其中常用的是NaNO2-Al(NO3)3比色
法。我们在测定枇杷花类黄酮的过程中发现该法
测得的类黄酮含量高于总酚含量。由于枇杷叶和
果实中都含有较多的绿原酸(Jung等 1999；Ding
等2001)，因此推测绿原酸等其他酚类物质可能会
干扰类黄酮的测定。本文比较了绿原酸对 3种类
黄酮测定方法的干扰，以期能为准确测定枇杷花
等富含绿原酸植物中的类黄酮含量提供正确的分析
方法。
材料与方法
1 材料
枇杷(Eriobotrya japonica Lindl.)花为整花序
(50% 左右小花完全盛开)，枇杷叶为成熟叶片，
两者均于 2005年 11月 25日采自浙江余杭枇杷园
区，于微波炉中干燥至恒重；金银花(Lonicera
japonica Thunb.)干燥品购自超市，由杭州福海堂
茶叶有限公司出品，产地为河南息县。所有材料
均用粉碎机粉碎，过 40目筛，收集粉末置于−20 ℃
下贮藏备用。
2 类黄酮和总酚的提取
取 0.2 g上述备用的植物粉末，加入 8 mL
60%乙醇，以 TBT/C-YCL 500Tt/3P (D) 超声波
仪(山东济宁，金百特电子有限公司生产)破碎 80
min，其频率和功率为47 kHz/500 W，温度为30 ℃。
超声结束后以 5 600×g离心 10 min，上清液用60%
乙醇定容至 10 mL后测定类黄酮和总酚的含量。
3 类黄酮的测定
(1) NaNO2-Al(NO3)3比色法：参照Jia等(1999)
的方法并作适当修改。吸取 0.5 mL待测液置于 10
mL试管中，按顺序分别加入 0.3 mL 8% NaNO2，
混匀反应 6 min后，加 0.3 mL 10% Al (NO3)3，
技术与方法 Techniques and Methods
植物生理学通讯 第 43卷 第 5期，2007年 10月 903
混匀反应 6 min后，加 2.0 mL NaOH (2 mol·L-1)和
4.9 mL 无水乙醇，混匀静置 10 min后，以 5 600 ×g
离心 10 min后以分光光度计测定波长510 nm处的
光密度(OD)值，以芦丁作标准曲线计算类黄酮含
量，重复 3 次。
(2)二甘醇比色法：参照元晓梅等(1996)的方
法并作适当修改。先在 10 mL试管中加入 3.5 mL
无水乙醇和 0.5 mL待测液，再加入 4 mL 90%二
甘醇和 0.1 mL NaOH (4 mol·L-1)，摇匀后在 40 ℃
水浴中静置 10 min，然后以分光光度计测定波长
420 nm处OD值，以芦丁作标准曲线计算类黄酮
含量，重复 3 次。
(3)差示比色法：参照康旭珍(2005)的方法并
作适当修改。分别取待测液 1 mL两份，置于 10
mL试管中，一份加入 7 mL甲醇；另一份加入
2% 二氯氧锆(ZrOCl2·8H2O)的甲醇溶液 1 mL，再
加入 6 mL甲醇。混匀后于 30 ℃水浴静置 1 h，
然后在分光光度计 420 nm下测定溶液络合前后的
差示吸光值 ∆OD，以芦丁作标准曲线计算类黄酮
含量，重复 3 次。
4 总酚的测定
参照Maksimovic等(2005)文中的方法并作适
当修改。先在 10 mL试管中加入 4 mL水和 0.5 mL
植物提取液，混匀后加入 0.5 mL Folin-Ciocalteu
试剂，3 min后加入 1.0 mL饱和 Na2CO3，摇匀
后放在 30 ℃水浴中静置 1 h，然后以分光光度计
测定波长 760 nm处的OD值，以绿原酸作标准曲
线计算总酚含量，重复 3 次。
实验结果
1 标准曲线的制作
以芦丁为标准品，采用不同的浓度，建立测
定类黄酮的回归曲线，不同方法回归系数均在
0.99以上，符合定量分析要求(表 1)。但 3种方
法的线性范围浓度不同，其中NaNO2-Al(NO3)3比
色法线性范围更宽一些，而二甘醇比色法和差示
比色法浓度范围较小，且比较接近。
2 绿原酸的干扰
根据 3 种方法的线性范围浓度，选择 2 0 0
µg·mL-1芦丁测定相应的吸光值或差示吸光值，同
时同步测定 200 µg·mL-1绿原酸干扰后的数值(表
2)。比较混合样与芦丁样品的吸光值或差示吸光
值的结果表明，差示比色法在加入绿原酸后对芦
丁的测定结果几乎没有影响，而NaNO2-Al(NO3)3
比色法和二甘醇比色法在加入绿原酸后，其吸光
值或差示吸光值分别为芦丁样品的 2 .8 倍和 2.2
倍。由此可知，差示比色法用于测定富含绿原酸
植物材料中类黄酮的效果较好。
3 样品中类黄酮和总酚含量的测定
采用 3种不同方法测定枇杷花、枇杷叶和金
银花中类黄酮含量的结果(表 3)表明，NaNO 2-
Al (NO3)3比色法所测定的类黄酮含量明显超过总酚
含量，说明此法不适用。二甘醇比色法测得的类
黄酮含量虽然低于总酚含量，但仍然高于差示比
色法的结果。根据这些结果，说明绿原酸对类黄
酮的测定确实有干扰。差示比色法的结果相对来
表 1 不同测定类黄酮方法的标准曲线
方法 回归方程 r 线性范围
NaNO2-Al(NO3)3比色法 y=1464.18x+0.9902 0.9999 50~1000 µg·mL-1
二甘醇比色法 y=442.91x+6.5904 0.9992 25~400 µg·mL-1
差示比色法 y=449.54x+3.4384 0.9989 25~500 µg·mL-1
表 2 绿原酸对 3种测定类黄酮方法干扰的比较
加入的标准样品浓度 /µg·mL-1 NaNO2-Al(NO3)3比色法 /OD510 二甘醇比色法 /OD420 差示比色法 /∆OD420
芦丁 200 0.143±0.002 0.315±0.013 0.454±0.016
芦丁 200+绿原酸 200 0.401±0.006 0.704±0.016 0.459±0.018
混合样OD/芦丁OD*100% 280.4% 223.5% 101.1%
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说比较可靠，枇杷花、枇杷叶和金银花类黄酮的
含量分别为 7.69、5.48和 8.54 mg·g-1 (DW)，其
含量分别为总酚的 8.72%、6.25%和 12.79%。
讨 论
NaNO2-Al(NO3)3比色法中的试剂显色的反应
原理是发生在类黄酮成分B环3’,4’-邻位二酚羟基
位置上(周正华等 2006)，而绿原酸与芦丁一样，
也有邻位二酚羟基的结构，反应后也呈现出红
色，对芦丁等类黄酮的测定产生干扰，因而测定
结果偏高。在差示比色法中，当类黄酮化合物分
子中有游离的 3-OH或 5-OH时，3-OH、4-羰基
或 5-OH、4-羰基均可与溶液中的 ZrOCl2形成稳
定的黄色锆络合物，并在 420 nm波长处有吸收峰
(陈优生等2002)。而绿原酸不具有相邻的OH和羰
基空间结构，与ZrOCl2不能形成稳定络合物，因
此不会对类黄酮测定产生干扰。二甘醇比色法
中，芦丁与碱作用后，开环生成 2,6-二羟基 -4-
环氧基苯丙酮和对甲氧基苯甲醛，两者在二甘醇
环境中遇到碱时会缩合生成黄色橙皮素查耳酮，
其在波长 420 nm处有吸收峰(元晓梅等 1996)，绿
原酸对类黄酮测定之所以有干扰，可能是由于碱
性条件下分解产物与溶液中其它分子缩合后在420
nm处产生吸收峰所致，但具体原因尚不清楚，有
待进一步研究。总之，采用分光光度法测定类黄
酮含量时，应先对样品的成分有初步了解，如采
用薄层色谱(TLC)进行定性，而后再根据具体情
况采用不同的测定方法，这样可以在一定程度上
提高测定结果的准确性。对于富含绿原酸的植
物，其类黄酮的测定采用差示比色法会得到比较
准确的结果。
参考文献
陈优生, 冯锋, 尤启冬(2002). ZrOC12比色法测定藤黄中总藤黄
酸的含量. 中国药师, 5 (12): 731~732
康旭珍 (2005). 差示分光光度法测定桑叶总黄酮含量. 光谱实验
室, 22 (3): 506~508
元晓梅, 刘贵贤, 胡正芝(1996). 比色法测定柑桔饮料及桔皮制
剂中总黄酮含量. 食品与发酵工业, (3): 13~21
周正华, 杜安全, 王先荣(2006). 黄蜀葵花中总黄酮含量测定方
法的比较研究. 中药材, 26 (11): 1192~1194
Ding CK, Chachin K, Ueda Y, Imahori Y, Wang CY (2001).
Metabolism of phenolic compounds during loquat fruit
development. J Agric Food Chem, 49 (6): 2883~2888
Hassimotto NMA, Genovese MI, Lajolo FM (2005). Antioxidant
activity of dietary fruits, vegetables, and commercial frozen
fruit pulps. J Agric Food Chem, 53: 2928~2935
Jia ZS, Tang MC, Wu JM (1999). The determination of flavonoid
contents in mulberry and their scavenging effects on super-
oxide radicals. Food Chem, 64 (4): 555~559
Jung HA, Park JC, Chung HY, Kim J, Choi JS (1999). Antioxidant
flavonoids and chlorogenic acid from the leaves of Eriobotrya
japonica . Arch Pharm Res, 22 (2): 213~218
Maksimovic Z, Malencic D, Kovacevic N (2005). Polyphenol
contents and antioxidant activity of Maydis stigma extracts.
Bioresour Technol, 96: 873~877
Peer WA, Murphy AS (2006). Flavonoids as signal molecules. In:
Grotewold E (ed.). The Science of Flavonoids. USA: Springer,
239~268
Wolfe K, Wu XZ, Liu RH (2003). Antioxidant activity of apple
peels. J Agric Food Chem, 51: 609~614
表 3 不同植物样品中类黄酮和总酚含量
类黄酮含量 /mg·g-1 (DW) 总酚含量
样品
NaNO2-Al(NO3)3比色法 二甘醇比色法 差示比色法
/mg·g-1 (DW)
枇杷花 152.75±4.45 28.56±0.45 7.69±0.32 88.19±0.37
枇杷叶 146.83±4.58 25.39±0.76 5.48±0.11 87.60±1.61
金银花 98.13±3.84 39.32±4.56 8.54±1.08 66.76±7.73