全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 5期，2008年 10月882
甘薯叶绿体 rbcL基因的克隆与序列分析
王玉华 1, 吴忠义 2, 贾敬芬 1, 张秀海 2, 黄丛林 2,*
1西北大学生命科学学院, 西安 710069; 2北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心, 北京 100097
提要: 根据烟草、水稻和菠菜叶绿体的全基因组序列设计引物, 以甘薯的叶绿体基因组DNA为模板, PCR扩增包含甘薯叶
绿体 rbcL完整基因(GenBank登录号为AY942199)在内的一段序列。序列分析表明: 此片段的全长为 1 627 bp, 包括 1 443
bp的编码区序列在内, 推测编码 480个氨基酸, 同时构建了此片段的限制性酶切图谱。相似性比较显示, 此基因编码区序
列与烟草、菠菜、小麦、水稻、玉米、矮牵牛、紫花苜蓿、拟南芥、莨菪、葡萄以及甜菜的 rbcL基因核苷酸的同源性为
85%~98%, 氨基酸的同源性为92%~95%。
关键词: 甘薯; 叶绿体基因; rbcL基因; 序列分析
Cloning and Sequence Analyses of the rbcL Gene from Chloroplast of Sweet
Potato [Ipomoea batatas (L.) Lam.]
WANG Yu-Hua1, WU Zhong-Yi2, JIA Jing-Fen1, ZHANG Xiu-Hai2, HUANG Cong-Lin2,*
1College of Life Sciences, Northwest University, Xi’an 710069, China; 2Beijing Agro-Biotechnology Research Center, Beijing
Academy of Agricultural and Forestry Sciences, Beijing 100097, China
Abstract: A pair of primers used in amplifying chloroplast fragment of sweet potato was designed according to
the corresponding sequences in tobacco, rice and spinach chloroplast genomes. The fragment containing rbcL
gene was cloned from sweet potato chloroplast genome. Sequencing analysis indicated that this fragment was
1 627 base pairs (bp) in size. The complete open reading frame of Ipomoea batatas rbcL gene is 1 443 bp
encoding a polypeptide of 480 amino acids. The restriction map of this cloned fragment was also established.
The BLAST results showed that the homologies of this gene with tobacco, spinach, wheat, rice, maize, petunia,
alfalfa, Arabidopsis thaliana, belladonna, grape and sugar beet were from 85% to 98%, and the homologous
amino acid sequences were from 92% to 95%.
Key words: sweet potato [Ipomoea batatas (L.) Lam.]; chloroplast gene; rbcL gene; sequence analyses
收稿 2008-05-26 修定 2008-07-21
资助 北京市自然科学基金(5062012)、陕西省教育厅自然科
学专项基金(06JK175)和西北大学校内基金(05NW43)。
　 * 通讯作者(E-mail: conglinh@126.com; Tel: 010-51503801)。
叶绿体基因工程作为一项转基因技术, 具有核
转化不具备的独特优点: 高效表达目的基因, 环境
安全性好, 消除位置效应, 无基因沉默现象, 原核基
因表达方式等。但是到目前为止, 几乎所有的叶绿
体转化成功的报道都集中于衣藻和烟草等模式植
物。最近, 在油菜(Hou等 2003)、拟南芥(Sikdar
等 1998)、水稻(Khan和Maliga 1999)、马铃薯
(Sidorov等 1999)、番茄(Maliga 2003; Wurbs等
2007)、胡萝卜(Kumar等 2004a)、矮牵牛(Zubko
等 2004)、大豆(Dufourmantel等 2004, 2005)、莴
苣(Lelivelt等2005; Kanamoto等2006)、棉花(Kumar
等 2004b)和甘蓝(Liu等 2007)等植物中获得成功。
限制叶绿体转化技术扩展受体范围的主要因素之一
是大多数植物的叶绿体基因组序列尚不清楚, 因此
无法确定用于载体构建的同源重组片段和外源基因
的插入位点。有研究表明, 在高等植物的叶绿体基
因组中编码核酮糖 1 ,5 - 二磷酸羧化酶 / 加氧酶
(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase,
Rubisco, E.C. 4.1.1.39)大亚基的rbcL基因高度保守
(Hasebe等 1992; Andersson和 Backlund 2008)。本
文报道克隆得到甘薯叶绿体rbcL基因的完整序列,
为在甘薯中开展叶绿体基因工程建立了基础。
材料与方法
甘薯[Ipomoea batatas (L.) Lam]品种 ‘京 3’无
菌苗由北京市农林科学院小麦中心提供。以不含
生长调节物的MS固体培养基培养, 每隔 4周切取
茎段继代一次。
植物生理学通讯 第 44卷 第 5期，2008年 10月 883
取 30 g左右继代培养 3周左右的组培苗叶片,
先在4 ℃下黑暗饥饿过夜, 之后用于叶绿体基因组
DNA (chloroplast DNA, cpDNA)提取。提取参考
高盐低pH法(龚小松和阎隆飞1991), 结合2次差速
离心技术, 先分离纯化叶绿体, 后用常规 CTAB法
提取叶绿体DNA, 各取2 µL cpDNA, 分别用BamHI
和 PstI进行酶切, 检测 cpDNA的质量。纯化的叶
绿体DNA稀释到一定浓度后用于 PCR扩增。
根据烟草、水稻和菠菜叶绿体全基因组全序
列资料, 用软件Oligo 6设计引物, 引物序列分别为
S-rbcL19U: 5-GGGAGGGATTTATGTCACC-3, S-
rbcL21L: 5-ATCTTTGTTGTATTCGGCTCA-3。
以甘薯叶绿体基因组 DNA为模板, 用高保真的
DNA聚合酶扩增包括rbcL基因在内的一段叶绿体
片段。PCR反应在 PTC-100 Peltier基因扩增仪上
进行, 反应程序为: 94 ℃预变性3 min; 94 ℃变性1
min, 57 ℃退火 1 min, 72 ℃延伸 1 min, 共 30个循
环; 最后于 72 ℃下延伸 10 min。PCR产物以琼脂
糖凝胶电泳分离, 目的产物用锋利的刀片割下, 用
胶回收试剂盒回收纯化, 之后克隆进pGEM-T载体,
转化大肠杆菌DH5α菌株, 选取阳性克隆提取质粒
DNA, 酶切鉴定后测序, 并用生物信息学软件分析
核苷酸序列、氨基酸序列以及同源性与亲缘的关
系。
结果与讨论
1 甘薯叶绿体DNA的提取
由图 1可以看出, 提取的甘薯 cpDNA质量完
好, 基本上无降解, 再经限制性酶切后电泳, 可以见
到一系列大小不同的条带, 不像基因组总DNA酶切
后呈完全弥散状。由于cpDNA酶切图的背景稍强,
所以提取的 cpDNA还存在核基因组DNA的污染。
但总的来说, 提取的cpDNA质量基本上可以满足后
续试验中 PCR扩增的要求。
2 甘薯 rbcL基因的克隆与序列分析
以S-rbcL19U和S-rbcL21L为引物, 在TaKaRa
的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶作用下, 以甘薯
cpDNA为模板, PCR扩增获得甘薯叶绿体 rbcL基
因片段。电泳结果显示, PCR产物约为 1.6 kb (图
2), 与预计的大小相符。所得 PCR产物回收后, 将
该片段连接到 pGEM-T载体上, 得到重组质粒, 由
上海生物工程公司测序 , 测序结果已经登陆
GenBank, 登陆号为AY942199。序列分析表明, 重
组质粒中插入片段全长 1 627 bp, 其中包含一个
1 443 bp的rbcL基因编码区(图3), 推测编码480个
氨基酸(图 4), 比烟草叶绿体 rbcL基因多 9个碱基
3 个氨基酸。
图 1 甘薯 cpDNA及其限制性酶切电泳图谱
Fig.1 Sweet potato cpDNA and its electropherogram of
restriction enzyme digestion
M: DL2000+DL15000标记; 1: 甘薯 cpDNA; 2: 经 BamHI
消化后的甘薯 cpDNA; 3: 经 PstI 消化后的甘薯 cpDNA。
图 2 甘薯 rbcL基因片段的扩增
Fig.2 Amplification of sweet potato rbcL gene fragment
M: DL2000+DL15000标记; 1: 甘薯叶绿体 rbcL基因扩增片段。
3 甘薯叶绿体 rbcL基因片段的酶切图谱
利用DNAMAN软件对甘薯叶绿体rbcL基因片
段进行限制性酶切分析, 限制性酶切的图谱(图5)显
示, 在筛选的 24个常见的限制性内切酶中, 有 9个
酶切位点位于该片段中。
4 不同植物的 rbcL基因之间的相似性比较和进化
分析
将克隆到的甘薯叶绿体rbcL基因与其他物种
的 rbcL基因进行同源性比较的结果(表 1)显示, 该
植物生理学通讯 第 44卷 第 5期，2008年 10月884
图 3 甘薯叶绿体 rbcL基因序列
Fig.3 Nucleotide sequence of sweet potato chloroplast gene rbcL
方框内为 r b c L 基因的起始密码子和终止密码子。
图 4 甘薯叶绿体基因 rbcL的氨基酸序列
Fig.4 Amino acid sequence of rbcL gene from sweet potato chloroplast genome
植物生理学通讯 第 44卷 第 5期，2008年 10月 885
基因编码区序列与烟草、菠菜、小麦、水稻、
玉米、矮牵牛、紫花苜蓿、拟南芥、莨菪、葡
萄和甜菜的 rbcL基因核苷酸的同源性为 85%~
98%, 而氨基酸的同源性为 92%~95%, 据此可以确
定所克隆的基因为甘薯叶绿体 rbcL基因。氨基酸
序列的同源程度大于核苷酸序列的同源程度, 说明
在某些物种中, Rubisco酶大亚基要实现其功能, 在
氨基酸水平上必须具有相当的保守性。
此外, 用DNASTAR软件, 以 rbcL基因序列为
指标, 分析了甘薯、烟草、菠菜、小麦、水稻、
玉米、矮牵牛、紫花苜蓿、拟南芥、莨菪、葡
萄及甜菜之间的亲缘关系, 建立的进化树(图 6)显
示: 参与分析的 12个物种在进化树上呈现两大分
支, A支包括茄科的烟草、莨菪、矮牵牛, 旋花科
的甘薯, 藜科的甜菜和菠菜, 葡萄科的葡萄和十字
花科的拟南芥, B支包括豆科的苜蓿和禾本科的水
图 5 甘薯叶绿体 rbcL基因的限制性酶切图谱
Fig.5 The restriction map of sweet potato chloroplast gene rbcL
表 1 不同物种 rbcL基因间的相似性比较
Table 1 Comparison of rbcL gene from sweet potato with those from other plants
种名 rbcL基因核苷酸相似性 /% rbcL基因氨基酸相似性 /%
甘薯(Ipomoea batatas) 100 100
烟草(Nicotiana tabacum) 9 8 9 5
莨菪(Atropa belladonna) 9 8 9 5
菠菜(Spinacia oleracea) 9 0 9 3
玉米(Zea mays) 8 6 9 2
水稻(Oryza sativa) 8 5 9 2
紫花苜蓿(Medicago sativa) 8 9 9 2
矮牵牛(petunia hybrida) 9 3 9 4
小麦(Triticum aestivum) 8 5 9 2
拟南芥(Arabidopsis thaliana) 8 9 9 3
葡萄(Vitis vinifera) 9 1 9 4
甜菜(Beta vulgaris) 9 0 9 2
图 6 基于 rbcL编码区构建的进化树
Fig.6 The dendrogram of sweet potato based on rbcL ORF
植物生理学通讯 第 44卷 第 5期，2008年 10月886
稻、小麦和玉米; A支全部由双子叶植物构成, B
支中除苜蓿外, 其余均为单子叶植物。除葡萄科的
葡萄和十字花科的拟南芥划分为一个子分支与植物
学分类结果不符外, 其余均与植物学分类的结果一
致, 这可能与该基因中遗传密码子的变异有关, 暗
示仅以 rbcL基因核苷酸序列为指标研究植物系统
关系的结果并不确切, 应该结合氨基酸序列分析的
结果, 并与植物学分类的结果相对应。
参考文献
龚小松, 阎隆飞(1991). 高等植物叶绿体 DNA提纯方法改进. 科
学通报, 36 (6): 467~469
Andersson I, Backlund A (2008). Structure and function of Rubisco.
Plant Physiol Biochem, 46: 275~291
Dufourmantel N, Pelissier B, Garcon F, Peltier G, Ferullo JM,
Tissot G (2004). Generation of fertile transplastomic
soybean. Plant Mol Biol, 55: 479~489
Dufourmantel N, Tissot G, Goutorbe F, Garçon F, Muhr C, Jansens
S, Pelissier B, Peltier G, Dubald M (2005). Generation and
analysis of soybean plastid transformants expressing Bacil-
lus thuringiensts cry1Ab protoxin. Plant Mol Biol, 58:
659~668
Hasebe M, Ito M, Kofuji R, Iwatsuki K, Ueda K (1992). Phyloge-
netic relationships in gnetophyta deduced from rbcL gene
sequences. J Plant Res, 105: 385~391
Hou BK, Zhou YH, Wan LH, Zhang ZL, Shen GF, Chen ZH, Hu
ZM (2003). Chloroplast transformation in oilseed rape.
Transgenic Res, 12: 111~114
Kanamoto H, Yamashita A, Asao H, Okumura S, Takase H, Hattori
M, Yokota A, Tomizawa K(2006). Efficient and stable trans-
formation of Lactuca sativa L. cv. Cisco (lettuce) plastids.
Transgenic Res, 15 (2): 205~217
Khan MS, Maliga P (1999). Fluorescent antibiotic resistance
marker for tracking plastid transformation in higher plants.
Nat Biotechnol, 17: 910~915
Kumar S, Dhingra A, Daniell H (2004a). Plastid-expressed be-
taine aldehyde dehydrogenase gene in carrot cultured cells,
roots, and leaves confers enhanced salt tolerance. Plant
Physiol, 136: 2843~2854
Kumar S, Dhingra A, Daniell H (2004b). Stable transformtion of
the cotton plastid genome and maternal inheritance of
transgenes. Plant Mol Biol, 56: 203~216
Lelivelt CL, McCabe MS, Newell CA, Desnoo CB, van Dun KM,
Birch-Machin I, Gray JC, Mills KH, Nugent JM. Lelivelt CL
et al (2005). Stable plastid transformation in lettuce (Lactuca
sativa L.). Plant Mol Biol, 53: 763~774
Liu CW, Lin CC, Chen JJW, Tseng MJ (2007). Stable chloroplast
transformation in cabbage (Brassica oleracea L. var. capitata
L.) by particle bombardment. Plant Cell Rep, 26 (10):
1733~1744
Maliga P (2003). Progress towards commercialization of plastid
transformation technology. Trends Biotechnol, 21 (1):
20~28
Sidorov VA, Kasten D, Pang SZ, Hajdukiewicz PT, Staub JM,
Nehra NS (1999). Stable chloroplast transformation in
potato: use of green fluorescent protein as a plastid marker.
Plant J, 19: 209~216
Sikdar SR, Serino G, Chaudhuri S, Maliga P (1998). Plastid trans-
formation in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Rep, 18: 20~24
Wurbs D, Ruf S, Bock R (2007). Contained metabolic engineering
in tomatoes by expression of carotenoid biosynthesis genes
from the plastid genome. Plant J, 49: 276~288
Zubko MK, Zubko EI, van Zuilen K, Meyer P, Day A (2004).
Stable transformation of petunia plastids. Transgenic Res,
13: 523~530