全 文 ：植物生理学通讯 第 40 卷 第 4期，2004 年 8 月 437
目前，欧美杂种山杨无性繁殖研究主要是围
绕腋芽增殖途径的扩繁技术进行的，但繁殖系数
低，不能满足遗传转化细胞再生的需要。就其组
培研究来说，Ahuja[1]用其芽、茎、叶和根作外
植体，在修改的 W P M 培养基上得到组培苗。
Chalupa[2]用其枝条作外植体，以加入细胞分裂素
和生长素的 W P M 和 M S 培养基进行培养，在 G D
培养基上生根成功。Krein和 Ahuja[3]用不同外植
体进行体外培养的结果表明，如果形成愈伤组
织，其结构常常是异源的。用不同浓度 2,4-D 和
K T 对叶、茎和胚轴等外植体进行诱导，在大多
数情况下均能产生根，而用子叶诱导，能产生不
定芽。国内仅徐妙珍等[4]对中国山杨进行过腋芽
增殖途径的扩繁技术研究，分化频率最高达
6 0 %。迄今还未见通过愈伤组织途径再生的报
道。
欧美杂种山杨以传统的无性扦插繁殖技术生
根极其困难，采用组织培养方法是否可行，值得
研究。通过建立愈伤组织再生途径，可在短期内
得到大量的再生植株，是原生质体分离和采用农
杆菌进行遗传转化的基础[5~7]。我们于2001年春从
芬兰引进该树种，以其为材料，对愈伤组织再生
途径进行了研究，解决了其成年树种快速繁殖的
问题。
材料与方法
材料为欧美杂种山杨(Populus tremula×P.
tremuloides)，取自从芬兰引进的20个约四十年生
的成年优良无性系。
2001年 2月将约四十年生的成年欧美杂种山
杨的枝条采回。经过水培后，取新枝接种。将
嫩枝上的叶片去除后，用消毒水冲洗3~4次，75%
酒精浸泡 30 s，边泡边摇，然后用 0.1% 升汞灭
菌 2 min，再用灭菌的蒸馏水洗净残液，切成 1
cm 长的茎段接种在 WPM+6-BA1.0 mg·L-1+KT 0.5
mg ·L-1+2% 蔗糖培养基上，启动侧芽分化形成无
菌试管苗。再从试管苗上取叶片、茎段、叶柄
进行愈伤组织诱导。
培养基以 WPM[8]、MS[9]、IS[10]、NT[9]为基
收稿 2003-09-02 修定 2004-04-08
资助 国家林业局“948”项目(2000-04-10)。
* E - m a i l : y a g u a n g z h a n @ 1 2 6 . c o m , T e l : 0 4 5 1 -
82191754
欧美杂种山杨愈伤组织再生系统的建立
詹亚光* 齐凤慧 杨传平
东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040
提要 为解决欧美杂种山杨成年树种快速繁殖的问题，并为研究原生质体分离、遗传转化和体细胞变异打下基础，我们
建立了愈伤组织再生系统。其愈伤组织诱导最适培养基为WPM+6-BA 1.0 mg·L-1 +NAA 0.1 mg·L-1、WPM+6-BA 1.0 mg·L-1，
分化培养基为 WPM+6-BA 0.3~1.0 mg·L-1，愈伤组织诱导率和分化率分别为 90.67% 和 92%。
关键词 欧美杂种山杨；愈伤组织；分化
Establishment of Callus Regeneration System of Populus tremula ×P. tremuloides
ZHAN Ya-Guang*, QI Feng-Hui, YANG Chuan-Ping
College of Life Science, Northeast Forestry University, Harbin 150040
Abstract In order to develop a simple and feasible approach to achieve high frequency plant regeneration for
Populus tremula ×P. tremuloides, and to make a base for protoplast isolation, transformation, and somaclonal
variation study, the callus regeneration system was established. The most suitable medium for callus induction
of Populus tremula ×P. tremuloides was WPM supplemented with 1.0 mg·L-1 6-BA and 0.1 mg·L-1 NAA,WPM
supplemented with 1.0 mg·L-1 6-BA, and for differentiation was WPM supplemented with 0.3~1.0 mg·L-1 6-BA.
The rate of callus induction and differentiation were 90.67% and 92% respectively.
Key words Populus tremula ×P. tremuloides; callus; differentiation
植物生理学通讯 第 40 卷 第 4期，2004 年 8 月438
础，补加0.5~5 mg·L-1 6-BA、 0.25~0.5 mg·L-1 KT、
1~9 mg·L-1 2,4-D、0.1~0.2 mg·L-1 NAA、2%蔗糖、
5.2 g·L-1琼脂，pH 5.8~6.0，高压灭菌(1.1 kg·cm-2) 20
min。培养温度为25~28℃，光照16 h·d-1，光照
度为 0.053~0.088 mmol·m-2·s-1，相对湿度为
40 % ~ 5 0 %。
诱导愈伤组织及分化培养时， 选择10个无性
系，各取叶片、茎段、叶柄，分别接种于不同
激素水平和配比的愈伤组织诱导培养基(具体成分
见“结果与讨论”部分)中。设 2 次重复实验，
每20 d继代 1次；将继代2次后的愈伤组织转入
分化培养基，1~2 月后分化出芽。从愈伤组织分
化出的小苗转至生根培养基中，一般情况下，刚
分化出的苗长势较弱，应先将其连同基部的小块
愈伤组织一并转入 WPM+NAA 0.4 mg·L-1+2% 蔗
糖的培养基中，通过生根培养即可达到壮苗和生
根的双重目的。当试管苗长到 2 cm 以上时，将
其切下，再进行单株生根培养，10 d 左右生根。
打开瓶塞，在室温下进行炼苗，3 d 后洗去根上
培养基，转入盛有沙与泥炭混合(2∶1)基质的营
养杯中，在25℃、相对湿度90% 的条件下，15 d
即成活。
结果与讨论
1 愈伤组织的诱导
1.1 不同生长调节物质组合的诱导 基本培养基为
W P M ，培养后出现两类愈伤组织。第一类为粉
绿色或红绿色愈伤组织。这类愈伤组织在茎段两
端首先开始膨大，并形成哑铃型，15 d后形成较
好的愈伤组织；叶片培养中愈伤组织出现不一，
有的沿着叶片边缘伤口处，有的沿叶脉形成紧密
愈伤组织。这类愈伤组织再生能力较强，可以继
代培养。第二类为黄绿色或粉黄色，表面带有白
色绒毛，多在愈伤组织上部形成，细胞松软，不
易继代和分化。叶片和茎段上容易形成愈伤组
织，而在叶柄培养中形成愈伤组织及随后的不定
芽分化率较低。
从表 1 可以看出，将叶片、茎段、叶柄接
种在WPM+1.0~9.0 mg·L-1 2,4-D+0.5 mg·L-1 KT的
培养基上时，愈伤组织的发生随 2,4-D 浓度的提
高，生长速率逐渐增，3 mg·L-1 后，形成愈伤组
织频率最高达98.11%，而后又逐渐降低，愈伤组
织的质地由松散到致密再到松散。培养基
WPM+1.0 mg·L-1 6-BA+0.5~1.0 mg·L-1 NAA 有利于
愈伤组织的发生和良好愈伤组织块的形成，愈伤
组织生长得到促进。在 WPM+1.0 mg·L-1 6-BA+
0.1 mg·L-1 NAA 培养基中，形成愈伤组织频率为
90.67%，虽然分化频率不如加入2,4-D 的高，但
其愈伤组织为绿色，而且上面有许多瘤壮突起，
进一步继代培养易分化出芽。在WPM+0.5 mg·L-1
KT+2.0 mg·L-1 NAA 培养基中，虽然形成的愈伤
组织百分率较高，但愈伤组织上面长有白色的绒
毛，继续培养时可形成不定根，不易分化出芽。
1.2 不同培养基的诱导 选用WPM、MS、IS、NT
表1 不同生长调节物质组合对愈伤组织的诱导
Table 1 Calli induced by combinations of different growth regulators
生长调节物质组
叶片 茎段 叶柄
合(浓度/mg·L-1)
总数/个
形成时 质地 颜色 诱导 形成时 质地 颜色 诱导 形成时 质地 颜色 诱导
平均诱
间/d 率/% 间/d 率/% 间/d 率/%
导率/%
2,4-D 1.0+KT 0.5 50 7松散 粉绿 91.95 7 松散 粉绿 92.47 7 松散 粉绿 80.46 88.96
2,4-D 2.0+KT 0.5 50 10 致密 红绿 96.10 10 致密 红绿 93.56 10 致密 红绿 81.12 90.26
2,4-D 3.0+KT 0.5 50 10 致密 粉绿 98.84 10 致密 粉绿 99.35 10 致密 粉绿 96.11 98.11
2,4-D 5.0+KT 0.5 50 7松散 黄绿 96.67 7 松散 黄绿 99.58 7 松散 黄绿 83.14 93.13
2,4-D 7.0+KT 0.5 50 7松散 粉黄 93.63 7 松散 粉黄 94.21 7 松散 粉黄 89.09 92.31
2,4-D 8.0+KT 0.5 50 5松散 粉黄 83.86 5 松散 粉黄 85.43 5 松散 粉黄 71.43 80.24
2,4-D 9.0+KT 0.5 50 9松散 粉黄 77.65 9 松散 粉黄 80.43 9 松散 粉黄 70.28 76.12
2,4-D 3.0+6-BA 0.5 50 10 致密 红绿 34.46 10 致密 红绿 56.00 10 致密 红绿 31.55 40.67
2,4-D 3.0+6-BA 1.0 50 10 致密 红绿 67.99 10 致密 红绿 70.00 10 致密 红绿 50.12 62.67
6-BA 1.0+NAA 0.1 50 7致密 浅绿 95.64 7 致密 浅绿 94.52 7 致密 浅绿 81.85 90.67
6-BA 1.0+NAA 0.5 50 10 致密 红绿 86.56 10 致密 红绿 89.65 10 致密 红绿 69.79 82.00
KT 0.5+NAA 2.0 50 15 致密 红绿 94.57 15 致密 红绿 94.69 15 致密 红绿 90.43 93.23
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4 种不同培养基，附加 2,4-D、KT、6-BA、NAA
组成的 3 种组合进行愈伤组织的培养。结果表
明，4 种不同培养基中以 W P M 的效果最好，I S
培养基最差，在加有 6-BA+NAA 的所有培养基中
培养20 d后均长出不定芽(表2)。
2 愈伤组织不定芽分化
2.1 愈伤组织不定芽分化 一般来说，2,4-D诱导的愈
伤组织不能分化出芽，需将其转入含有细胞分裂
素的分化培养基中，继代培养2~3次(每20 d继代
1 次)，方可以分化出不定芽。随着 6-BA 浓度的
增加，出芽率降低，出芽时间增加。0.5 mg·L-1
6-BA的出芽率最高为93%， 6-BA浓度增加到5.0
mg·L-1 时，愈伤组织不形成不定芽(表 3)。
2.2 6-BA对不定芽的直接诱导 以叶片为外植体，
WPM 为基本培养基，只附加不同浓度 6-BA，诱
导不定芽的直接分化。 培养10 d后在叶基部有的
出现 0.4 mm3 愈伤组织，有的仅基部膨大而无愈
伤组织，12 d后不定芽开始出现，20 d后长出丛
芽。产生丛芽的诱导率和数量随着6-BA浓度的升
高而升高，而后逐渐降低，长势也随之减弱(表
4)。
总之，6-BA能有效地促进欧美杂种山杨愈伤
组织不定芽的发生。6-BA 与 NAA 配合时，低浓
度(6-BA1.0 mg·L-1+NAA 0.1~0.5 mg·L-1)可诱导愈
表2 不同培养基对愈伤组织的诱导
Table 2 Calli induced on different media
生长调节物质(浓度/ mg·L-1) 培养基类型 外植体数/个 出愈率/% 出芽率/% 颜色
2,4-D 3.0+KT 0.25 W P M 150 98.11 0 红绿色
M S 150 48.67 0 黄绿色
N T 150 40.00 0 浅黄绿色
IS 150 36.00 0 浅黄色
6-BA 1.0+NAA 0.1 W P M 150 90.67 98.33 浅绿色
M S 150 60.00 50.00 浅黄绿色
N T 150 56.67 31.50 浅黄色
IS 150 49.33 26.67 浅黄绿色
6-BA l.0+2,4-D 3.0 W P M 150 78.64 0 红绿色
M S 150 73.33 0 黄绿色
N T 150 73.33 0 浅绿色
IS 150 50.00 0 浅黄绿色
除培养基WPM+6-BA 1.0+NAA 0.1 上愈伤组织开始发生的时间为7 d，其它均为 10 d。
表4 6-BA对诱导外植体直接分化不定芽的影响
Table 4 Effect of 6-BA on the differentiation of adventitious buds originated directly from explants
6-BA/mg·L-1 外植体数/个 生成芽时间/d 颜色 出芽率/% 愈伤组织大小/cm3
0.3 75 12 绿 80.24 0.5
0.6 75 13 浅绿 78.24 0.5
0.9 75 12 绿 76.56 0.5
1.0 150 10 绿 92.00 0.5
1.2 75 15 浅绿 62.10 0.5
1.5 75 15 绿 54.23 0.5
2.0 150 15 绿 54.00 0.5
3.0 150 20 浅绿 30.67 0.5
4.0 150 30 浅绿 14.00 0.5
5.0 150 60 0 0
表3 6-BA对愈伤组织分化不定芽的影响
Table 3 Effect of 6-BA on the differentiation of
adventitious buds from calli
6-BA/ mg·L-1 愈伤组织数/个 生成芽时间/d 出芽率/%
0.5 150 45 93
1.0 150 60 88
2.0 150 60 82
3.0 150 60 30
4.0 150 120 23.3
5.0 150 >120 0
植物生理学通讯 第 40 卷 第 4期，2004 年 8 月440
伤组织，并可分化形成丛状芽，比 2,4-D 的时间
短，分化率也高；若单用 6-BA 培养也能达到直
接出芽的效果，分化率达92.00%(表 4)，而且分
化时间最短，丛生芽多。因此可认为，WPM+1.0
mg·L-1 6-BA+2%蔗糖是诱导欧美杂种山杨不定芽快
繁的最适培养基，能快速成苗，形成的不定芽量
大，可以解决老龄欧美杂种山杨不易诱导分化的
问题，同时可满足遗传转化研究中外植体不定芽
高频率发生的要求。
3 再生植株的壮苗生根
不定丛芽转入 WPM+0.5 mg·L-1 NAA+2% 蔗糖
的生根培养基中，7~10 d 长出不定根，茎也伸
长，叶片展开，茎丛健壮。在不定芽长到3~5 cm
时，再将其切成单株转入相同的培养基中，生根
率达 90%~100%，不定根数平均 4 条以上。此时,
可移到室温中炼苗和移栽。5~6 月份移栽成活率
为 70%~90%，15 d 成活，并长出新叶。
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