全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 6期，2007年 12月 1031
采用酵母双杂交法筛选HbMyb1相互作用蛋白
邓治 1，张云霞 2，陈春柳 1，陈守才 1,*
1中国热带农业科学院橡胶研究所，农业部热带作物栽培生理学重点实验室，海南儋州 571737；2海南医学院生物化
学教研室，海口 571101
提要：HbMyb1是橡胶树死皮病相关基因，为了进一步研究HbMyb1的功能，采用酵母双杂交方法，从胶乳 cDNA文库
中筛选出10个与HbMyb1发生相互作用的蛋白，包括已知的橡胶延伸因子和橡胶小粒子蛋白等，其中4个分别与3-羟酰
基 -ACP-脱氢酶、NAD-依赖的山梨糖醇脱氢酶、氧化还原酶、假定的富含亮氨酸重复蛋白具有同源性的蛋白，其余4个
为未知蛋白。
关键词：巴西橡胶树；死皮病；HbMyb1；酵母双杂交
Screening of the Protein Interaction with HbMyb1 Using Yeast Two-hybrid
System
DENG Zhi1, ZHANG Yun-Xia2, CHEN Chun-Liu1, CHEN Shou-Cai1,*
1Rubber Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Key Laboratory of Cultivation Physiology for
Tropical Crops, Ministry of Agricultural, Danzhou, Hainan 571737, China; 2Staff Room of Biochemistry, Hainan Medical College,
Haikou 571101, China
Abstract: HbMyb1 was related to TPD (tapping panel dryness) of Hevea brasiliensis. To study the function of
HbMyb1 protein, we used yeast two-hybrid assay to screen a latex cDNA library with full-length of HbMyb1.
Ten proteins interacted with HbMyb1 protein were obtained. Among them, 6 proteins with known functions
were obtained, including the rubber elongation factor, small rubber particle protein, 3-hydroxyacyl-acyl-carrier
protein dehydratase, NAD-dependent sorbitol dehydrogenase enzyme, oxidoreductase and putative leucine-rich
repeat protein. 4 proteins with unknown function were found. These work could help for the further study on
the function of HbMyb1 and the clarification of mechanism of the TPD.
Key words: Hevea brasiliensis; tapping panel dryness (TPD) ; HbMyb1; yeast two-hybrid system
收稿 2007-07-18 修定 　2007-11-13
资助 中国热带农业科学院科技基金(Rky0 50 103 )。
* 通讯作者(E-mail：scc07@163.com；Tel：0898-23301174)。
巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)是种重要的产
胶植物，也是天然橡胶的唯一商业来源。橡胶树
死皮病(tapping panel dryness，TPD)作为天然橡
胶单产提高的限制因子，在世界各橡胶种植园普
遍发生，对橡胶种植业危害很大。橡胶树死皮病
发生时，割线的局部或全部乳管堵塞，排胶量大
大减少甚至停排，严重时树皮产生褐色斑点、斑
纹或者出现树皮爆裂症状。据估计，全世界每年
因橡胶树死皮病损失的干胶产量为 5×105 t，价值
相当于 4亿美元(蒋菊生和周钟毓 1999)。因此，
橡胶树死皮病受到各植胶国的高度重视。人们为
了寻找死皮病的发病原因和探索死皮机制，从其
病理学(陈慕容等 1 9 9 1 )、解剖学( G o m e z 和
Ghandimathi 1990)、生理生化(Chrestin 1989；曾
日中等 1997)、遗传学(范思伟和杨少琼 1995)和气
候环境(Pushpades等 1975)等诸方面进行了研究，
并提出了各种假说。但对于死皮病发生的真正原
因，至今还没有得到令人满意的解释。为研究橡
胶树死皮病发生和发展的分子机制，C h e n 等
(2 00 2)采用 DD RT-P CR 技术从橡胶树无性系
RRIM600胶乳中克隆了 1个类Myb激活转录因子
HbMyb1，对该基因进行Northern Blot分析表明，
Hb Myb 1 在健康树中表达强，在死皮树中表达
弱；在抗死皮品种或种质中表达强，在对死皮敏
感品种或种质中表达弱；在树皮中表达强，在叶
中表达弱；在远离死皮树割线的树皮中表达强，
在割线附近表达弱，因此认为该基因是死皮抗性
相关基因。但迄今为止人们对HbMyb1的认识仍
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然有限。本文利用酵母双杂交技术，寻找与
HbMyb1相互作用的橡胶树胶乳相关蛋白分子，
为进一步查明HbMyb1的生物学功能和阐明其在橡
胶树体内的作用机制提供参考。
材料和方法
酵母双杂交系统试剂盒(pGBKT7、pGADT7-
Rec、pGBK7-53、pGBKT7-Lam、pGADT7-RecT
等穿梭质粒及所有的酵母培养基)和酵母工程菌株
(Saccharomyces cerevisiae) AH109、Y187购自
Clontech公司。其中 pGBKT7质粒含有 TRP基因、
Kan 基因和 GAL4 DNA 结合区(GAL4-BD)；
pGADT7-Rec质粒含有 LEU基因、Amp基因和
GAL4 DNA激活区(GAL4-AD)；pGBKT7-53和
pGADT7-RecT为系统阳性对照；pGBKT7-Lam为
系统阴性对照。大肠杆菌(Escherichia coli) JM109
为本室保存。3-AT、X-α-Gal购自 Sigma公司。
限制性内切酶和连接酶购自TaKaRa公司。巴西橡
胶树(Hevea brasiliensis Muell. Arg)无性系RRIM600
胶乳采自本院试验农场。
诱饵载体的构建根据文献报道的HbMyb1 基
因(GenBank 登录号为AF239956)序列，在编码区
两侧设计上游引物：5 CAGCCATGGATCGGG-
GAATTGAAATC 3 (含有 NcoI酶切位点)，下游
引物：5 ATTC TGC AGTTACTGGC GTTG-
CATCGG 3 (含 PstI酶切位点)，以胶乳 cDNA 为
模板，用高保真Pyrobest DNA聚合酶扩增诱饵蛋
白HbMyb1的片段。PCR扩增产物经NcoI和PstI酶
切和纯化处理后与经过同样酶切和纯化处理的
pGBKT7载体进行体外连接。将连接产物转化大
肠杆菌 JM109，并在 LB/Kan+ 板上筛选。选取菌
落提取质粒 DNA，进行 PCR及酶切鉴定，并将
阳性重组质粒递交北京三博生物技术有限公司进行
测序。确定 HbMyb1 读码框序列正确后，参考
Matchmaker Library Construction and Screening 说
明书采用 PEG-LiAc方法将该诱饵载体 pGBKT7-
HbMyb1 转化酵母菌株AH109和Y187，并检测其
自激活活性和毒性。在培养基中加入不同浓度的
3-AT，根据平板上菌落生长抑制情况，确定最佳
抑制浓度。
构建胶乳 c D N A 文库时，提取的胶乳总
RNA，用 Oligo (dT)引物合成第 1链，再以第 1
链为模板，用 LD-PCR 方法合成双链 cDNA，对
得到的cDNA进行纯化后和载体pGADT7-Rec对酵
母菌株AH109 进行共转化。在 SD/-Trp 平板上筛
选出转化成功的克隆。将收获得到的转化成功的
克隆悬浮在液体培养基中，用血球计数板计数，
测定文库滴度。此即胶乳酵母双杂交文库宿主菌
液。
pGBKT7-HbMyb1诱饵载体筛选胶乳cDNA文
库时，用酵母融合方法筛选，将诱饵载体
pGBKT7-HbMyb1 和文库宿主菌液放在同一长颈瓶
中融合 20 h，用显微镜观察有无融合子出现。酵
母融合后将菌液涂布在三缺平板SD/-His/-Leu/-Trp/
3-AT 和四缺SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/3-AT平板上，
于 30 ℃下培养 3~5 d。同时将菌液涂布在 SD/-
Leu、SD/-Trp和 SD/-Leu/-Trp平板上以检测酵母
融合效率及筛选文库克隆数。挑取直径大于2 mm
的白色克隆重复在四缺平板上划线生长。
鉴定与分析酵母阳性克隆时，将反复在四缺
SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/3-AT平板上划线仍能生长
的酵母克隆以格子点样形式转接到四缺SD/-Ade/-
His/-Leu/-Trp/3-AT/X-α-Gal平板上，进一步验证
ADE和HIS的表达，30 ℃下培养后出现蓝色克隆
为酵母阳性克隆。提取阳性克隆的酵母质粒，用
试剂盒中的5 LD Amplimer 和3 LD Amplimer 进行
酵母质粒 PCR 扩增，检测插入片段大小。将插
入片段大于 4 0 0 b p 的文库质粒转化大肠杆菌
JM109，再以 PCR验证插入的片段大小是否与其
在酵母克隆的 PCR扩增产物的大小相同。同时做
回转实验验证阳性克隆。最后对鉴定为阳性克隆
的插入片段进行测序，测序结果在GenBank上进
行同源性搜索和序列比对分析。
实验结果
1 诱饵载体的构建及其自激活活性和毒性检测
用特异引物以胶乳 cDNA 为模板扩增出全长
HbMyb1 阅读框。用 NcoI 和 PstI酶切消化后克隆
到 pGBKT7 载体上，转化大肠杆菌 JM109，经
双酶切、PCR鉴定为阳性的重组质粒进行DNA 测
序的结果表明，融合区域的阅读框序列完全正
确。该阳性重组质粒命名为诱饵载体 pGBKT7-
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HbMyb1。
采用 P EG / LiAc 法将诱饵载体 pG B K T7 -
HbMyb1分别转化酵母菌株AH109及Y187，检测
诱饵蛋白在酵母中的α-半乳糖苷酶活性的结果为
阴性，这表明HbMyb1本身没有明显的自激活活
性，毒性检测结果表明HbMyb1对酵母宿主菌无
毒性，因此认为，可以用作为诱饵蛋白进行酵母
双杂交筛选(图 1)。以浓度梯度法确定 3-AT抑制
HIS3 基因渗漏表达的最适浓度为 12.5 mmol·L-1。
生长的菌落以格子的形式重新验证阳性克隆(图3-
b)，结果其中显色反应呈强蓝色的杂交菌落有 85
个。提取的酵母质粒，以 pGADT7载体引物进行
PCR鉴定，得到的插入片段中大于 400 bp的克隆
23个，用之转化大肠杆菌，再次经 PCR及回转
实验反复鉴定后测序。在胶乳 cDNA文库中筛选
得到 10个与HbMyb1有相互作用的蛋白，其中 1
号插入片段是橡胶延伸因子(rubber elongation
factor，REF)的一段 cDNA，编码其 C端 127个
氨基酸；2号插入片段是橡胶小粒子蛋白(small
rubber particle protein，SRPP)的一段 cDNA，编
码其C端 160个氨基酸；3号插入片段编码 143个
氨基酸，与水稻 3 - 羟酰基 - A C P - 脱氢酶( 3 -
hydroxylacyl-acyl-carrier protein dehydratase)同源
性为 82%；4号插入片段编码 87个氨基酸，与桃
NAD-依赖的山梨糖醇脱氢酶(NAD-dependent sor-
bitol dehydrogenase enzyme，SDH)同源性为
89%；5号插入片段编码 152个氨基酸，与拟南
图 1 诱饵载体的鉴定
Fig.1 Identification of bait vector
　　M：DNA ma rk er；1：PCR 扩增的 H b My b 1 片段；2：
pGBKT7-HbMyb1质粒 DNA； 3：pGBKT7-HbMyb1 DNA经
NcoI and PstI双酶切； 4：pGBKT7-HbMyb1 PCR鉴定。
图 2 cDNA文库插入片段 PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果
Fig.2 Agarose gel electrophoresis pattern of the inserts of 18
randomly picked clones in the latex cDNA library
图 3 阳性克隆的筛选和验证
Fig.3 Screening and re-confirmation of candidates
　　a ：1 、2 、4 是阳性克隆， 3 、 5 是假阳性克隆；b：
X-α-Gal分析 Ade +、H is+、Leu +、T rp + 克隆。
2 胶乳 cDNA文库的鉴定
按上述方法构建成胶乳 cDNA文库，文库构
建后以有限稀释法测定胶乳 cDNA文库滴度为
3.6×108 cfu·mL-1，随机挑取胶乳 cDNA文库中 18
个克隆菌落，以 5 LD Amplimer 和3 LD Amplimer
为引物进行 PCR扩增，测得胶乳 cDNA文库的插
入片段基本在 400 bp以上(图 2)，符合酵母双杂
交 cDNA文库的构建要求。
3 酵母双杂交筛选及鉴定
pGBKT7-HbMyb1-Y187酵母与文库宿主菌液
共培养 24 h后，杂交结合率为 3.9%，达到文库
筛选结合率必须>2%的要求。三缺和四缺板上共
有 3.2×105 个转化子，经过反复在四缺板上划线鉴
定后共生长出 235个杂交酵母菌落，挑取四缺板
上生长的菌落在新鲜的 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/ 3-
AT/X-α-Gal上划线，能继续生长，呈蓝色的菌
落有 130个(图 3-a 中 1、2、4)。将划线后继续
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芥氧化还原酶(oxidoreductase)同源性为 73%；6号
插入片段编码 138个氨基酸，与拟南芥假定的富
含亮氨酸重复蛋白(putative leucine-rich repeat
protein)同源性为 80%；7、8、9、10号插入片
段分别编码 4个未知蛋白。虽然 3、4、5、6号
插入片段编码蛋白经过比对后与已知蛋白具有同源
性，但是否就是这些已知蛋白，还有待进一步证
明。
讨　 论
蛋白质间相互作用是当前研究的一个热点。
在所有生命活动中，蛋白质之间的相互作用是必
不可少的，它是细胞进行一切代谢活动的基础。
蛋白质的相互作用能产生许多效应，了解蛋白质
相互作用的方式、作用程度、作用结果，将有
助于蛋白质功能的分析、生命发育的探索和疑难
病理的研究等众多问题的解决。因此揭示蛋白质
间相互作用的关系，建立相互作用关系的网络图
已成为蛋白质组学研究中引人注目的问题。自酵
母双杂交系统创立以来(Fields和 Song 1989)，此
项技术已在诸多领域得到广泛应用。实践证明，
酵母双杂交技术是筛选和鉴定相互作用蛋白的一个
非常有效的手段。
本文以HbMyb1为诱饵，从巴西橡胶树胶乳
cDNA文库中筛选到 10个与HbMyb1可能有相互
作用的克隆。其中筛选到的 REF和 SRPP是死皮
病发生的标志性蛋白，在本实验测序结果中多次
出现。Sookmark等(2002)研究健康树和死皮树中
胶乳的差异蛋白质的结果表明，这两种蛋白在健
康树和死皮树中均存在，但在死皮树中大量积
累。尽管两种蛋白含量在死皮和健康树中有差
异，但其在转录水平上则没有差异。REF不仅在
橡胶聚合过程中起作用，同时也是一个胶乳过敏
原(Hev b1)。SRPP 与菜豆胁迫相关蛋白(PvSRP)
高度同源。一般认为 PvSRP在植物防御机制中起
作用，且受重金属、伤害及病原体等的诱导，但
乙烯刺激和伤害均不改变橡胶树SRPP 基因的转录
水平。另外 3个蛋白分别编码 3-羟酰基 -ACP-脱
氢酶、NAD-依赖的山梨糖醇脱氢酶、氧化还原
酶。D’Auzac等(1985)的研究表明，乳管细胞内
活性氧代谢失调时，黄色体膜破裂，最终导致胶
乳原位凝固和产胶功能衰竭而死皮。这 3个蛋白
可能都参与胶乳中的氧化还原过程，与活性氧代
谢失调导致死皮病有关。假定的富含亮氨酸重复
蛋白存在于多种功能不同的蛋白中。在植物中，
富含亮氨酸重复的蛋白在细胞生长发育、抗病反
应过程中均起作用，与蛋白质之间的相互作用以
及信号转导有密切关系。这些研究结果将有助于
进一步深入探讨HbMyb1的功能及阐明死皮病的发
生机制。虽然本文筛选了以上 10个与HbMyb1相
互作用的蛋白，但这些蛋白如何与HbMyb1发生
作用？它们在橡胶树死皮病的发生过程中究竟发挥
什么功能？尚待进一步研究。
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