全 文 ：植物生理学通讯 第41卷 第3期，2005年6月 293
小立碗藓愈伤组织诱导和培养
潘一廷1,2,3 施定基2,* 杨明丽2 吴鹏程2 杜桂森3
1 北京石油化工学院，北京102617；2 中国科学院植物研究所，北京100093；3 首都师范大学生物系，北京100037
提要 小立碗藓已经成为植物功能基因组学的模式系统，其材料的大量培养是所有工作的基础。文章探讨了小立碗藓愈
伤组织诱导和组织培养的基本条件，并观察了小立碗藓愈伤组织的亚显微结构。
关键词 小立碗藓；愈伤组织；电镜观察
Callus Induction and Culture of Physcomitrella patens
PAN Yi-Ting1,2,3, SHI Ding-Ji2,*, YANG Ming-Li2, WU Peng-Cheng2, DU Gui-Sen3
1Beijing Institute of Petrochemical Technology, Beijing 102617, China; 2Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing
100093, China; 3Department of Biology, Capital Normal University, Beijing 100037, China
Abstract The moss, Physcomitrella patens has recently been used as a model system in studies on the func-
tional genomics of plants. Its callus induction and observation of the callus ultrastructure of Physcomitrella
patens has been reported in this paper.
Key words Physcomitrella patens; callus; ultrastructural observation
收稿 2004-06-28 修定 　2005-02-03　
*通讯作者(E-mail: cyanoshi@public.bta.net.cn, Tel:　
022-66880322)。
小立碗藓是葫芦藓目(Funariales)葫芦藓科
(Funariaceae)小立碗藓属(Physcomitrium)的藓
类[1]。1997年，Schaefer和 Zryd[2]发现这种藓类
的核 DNA 可高频率发生同源重组，使其成为研究
植物功能基因组学的模式系统。自从1960年Ward
首次诱导了金发藓(Polytrichum commune)和仙鹤藓
(Atrichum undulatum)原丝体愈伤组织以来，迄今
已有50多种苔藓获得了愈伤组织。不管是苔类还
是藓类，每种材料的愈伤组织诱导所需要的培养
基和添加的激素都不同，因此，每种材料愈伤组
织诱导都需要经过大量的摸索实验。由于小立碗
藓已广泛应用于植物分子生物学的研究[3,4]，所
以，如何获得这种材料显得尤为重要。在小立碗
藓基因打靶实验中，要求其转化材料——原丝体
是同一发育阶段[5,6]，转化材料的大量获得和发育
阶段同一性是实验成功的关键。一般采用液体培
养基注入式发酵罐培养[7,8]，这种方法操作费用和
技术要求较高，一般实验室难以实现；而小立碗
藓愈伤组织的诱导则可提供另一条获得基因打靶转
化实验材料的方法。本文就此做探讨。
材料与方法
小立碗藓(Physcomitrella patens)原丝体由日本
M Hasebe教授(National Institute for Basic Biology)赠
送。材料表面消毒后无菌接种到 BCD[5]固体培养
基上，温度(25±1)℃，在光照度为40 mmol·m-2·s-1
培养箱中持续光照培养。
小立碗藓基本培养基(BCD，单位：mmol·L-1):
KNO3 10、MgSO4 1、FeSO4 0.045、KH2PO4 (KOH
调 pH 6.5) 1.8、CaCl2 1、酒石酸氨(AT) 5。TES
(微量元素，单位：mmol·L-1): CuSO4 0.22、ZnSO4
0.19、H3BO3 10、Na2MoO4 0.1、MnCl2 2、CoCl2
0.23、KI 0.17。
取无菌小立碗藓愈伤组织，用磷酸缓冲液
(pH 6.5)冲洗3次，将愈伤组织分离成单个颗粒。
冲洗后，用 2.5% 的戊二醛固定，按材料与固定
液之比为 1∶5 于室温下固定 20 min，换 1 次固
定液，4℃下固定24 h。用磷酸缓冲液冲洗3次，
每次15 min，然后用1%锇酸固定。脱水，SUPRR
树脂包埋。用HITACHI H-6000 透射电镜(TEM 75 V)
观察、照相。
实验结果
苔藓植物愈伤组织的诱导一般以 MS 为基础
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培养基，加 2%~ 4 % 的葡萄糖，而不加植物生长
调节物质，只有少数物种需要低浓度水平的生长
调节物质存在。我们的实验表明，葡萄糖是影响
小立碗藓愈伤组织产生的一个重要因素，在无生
长调节物质的 BCD 培养基中不产生愈伤组织。加
0.5%~4% (W/V)葡萄糖，同时加 1 mg·L-1 的 6-BA
或 2,4-D，取配子体茎尖，接种到培养基上，在
温度(25±1)℃，持续光照，光照度40 mmol·m-2·s-1
下诱导出愈伤组织。诱导的愈伤组织每个星期继
代 1 次，培养基为 BCD+4% 葡萄糖 +1 mg·L-1 6-
B A ，愈伤组织生长稳定。
茎叶体在含有2,4-D 培养基上培养一段时间
后，不形成愈伤组织，仍为茎叶体，且茎叶体
出现异常现象，其茎上面出现瘤状物。在含2,4-
D培养基上培养2个星期后茎叶体周围产生新生原
丝体(图1)，在此种培养基上生长的原丝体不产生
芽体，说明 2,4-D 抑止芽的发生。
小立碗藓配子体茎尖在含1 mg·L-1 6-BA 培养
基上培养 20 d 左右出现疏松的绿色愈伤组织(图
2)，继代培养 3 次后形成稳定的愈伤组织培养体
系，并可进一步扩大培养。在含 4% 葡萄糖的培
养基上诱导愈伤组织较快，15 d就有愈伤组织出
现。诱导出的愈伤组织在含 4% 葡萄糖 +1 mg·L-1
6-BA 的 BCD 培养基上扩大培养，生长迅速，并
能维持脱分化状态。愈伤组织转到无生长调节物
质的BCD 培养基上培养 15 d 以后又可以再分化，
长出绿色的原丝体。
在愈伤组织诱导的过程中，葡萄糖超过 4 %
时，愈伤组织严重褐化(图 3)。大多数苔藓植物
中都含有多酚化合物，容易产生褐变，从而阻碍
愈伤组织的继代和再分化。这是诱导苔藓愈伤组
织需要注意的一个问题。
透射电子显微镜观察(图4)表明，愈伤组织细
胞比正常细胞体积增大，细胞壁薄，细胞质减
少，液泡变大，细胞中含有叶绿体。叶绿体内
有少量类囊体弯曲环绕在淀粉粒之间，淀粉粒含
量多，而且大。基粒类囊体和基质类囊体受大的
淀粉粒压缩，界限不明显。叶绿体附近有大量的
图1 在含2,4-D的培养基上生长的小立碗藓
Fig.1 Culturing of P. patens on the medium with 2,4-D
图3 褐化严重的小立碗藓愈伤组织
Fig.3 The browned callus of P. patens
图2 小立碗藓愈伤组织
Fig.2 The callus of P. patens
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线粒体存在(图 5)。
讨 论
苔藓在无生长调节物质作用下，不管是孢子
体、配子体，还是哪个组织都可通过相似的发育
途径再生：由绿丝体和轴丝体产生芽体，然后发
育成配子体[ 9 ]，是再分化过程，而没经过去分
化，也就是说，苔藓的再生是没有经过未分化的
愈伤组织细胞。通过这种方式产生的原丝体处于
图5 小立碗藓愈伤组织叶绿体及其周围的线粒体
Fig.5 A chloroplast and mitochondria nearby
the chloroplast in P. patens callus
图4 小立碗藓的愈伤组织细胞
Fig.4 Cells of P. patens callus
图6 小立碗藓的培养途径
Fig.6 Culture ways of P. patens
不同的发育阶段，这对于进行基因打靶的同源重
组试验不利。愈伤组织诱导成功地解决了这个问
题，可以在实验室进行探索性基因打靶试验，形
成另一个培养小立碗藓途径(图 6)。
大多数苔藓植物愈伤组织诱导培养基为含4%
(或 6%)葡萄糖和1 mg·L-1 2,4-D的 MS培养基，并
且发现培养基的高糖和高渗透压是影响愈伤组织诱
导的主要因子，添加生长素对诱导愈伤组织没有
直接关系。我们尚未见到国内外已发表有关诱导
小立碗藓愈伤组织的报导。在本试验中，培养基
的高糖和高渗透压是愈伤组织诱导的一个影响因
子，但是只有在含有不同浓度的6-BA培养基上才
能诱导出愈伤组织，并能重复继代培养、维持脱
分化状态和正常生长，而在 2,4-D 培养基上并未
诱导出愈伤组织。6-BA 促进细胞分裂，诱导愈
伤组织在维管植物和苔藓植物中的应用很广泛，
在小立碗藓组织培养中的促分裂作用也很明显。
小立碗藓愈伤组织诱导培养基中葡萄糖含量
超过 4% 时，褐变现象严重。褐变现象的发生与
外植体中所含酚类化合物的多少和多酚氧化酶活性
有直接关系[10]。这些酚类化合物在完整的组织和
细胞中与多酚氧化酶分隔存在，比较稳定，在外
植体建立时，受伤细胞的分隔效应被打破，酚类
化合物外溢，与多酚氧化酶接触迅速氧化成褐色
的醌类物质，醌类物质又会在一些酶的作用下与
外植体组织的蛋白质发生聚合，引起细胞内其他
的酶系统失活，从而导致组织代谢活动紊乱，生
长停滞，最终死亡。这说明小立碗藓细胞含有较
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多的多酚化合物，在高葡萄糖的培养基上培养，
细胞的多酚化合物会增加，这在以后的总 DNA 提
取中也表现出来。在培养条件不适时，多酚化合
物在细胞内积累较多，在多酚氧化酶的作用下发
生氧化，组织逐渐变成褐色或黑色，最后细胞死
亡。在小立碗藓愈伤组织诱导实验中，为了减轻
褐化，外植体——原丝体培养基中不加葡萄糖，
同时，通过减少继代天数降低褐化程度和维持其
脱分化状态，效果明显。
从小立碗藓透射电镜观察中发现，小立碗藓
愈伤组织细胞中含有叶绿体。叶绿体是对外界环
境反应最敏感的细胞器，正常情况下，叶绿体成
梭形或椭圆形，内膜系统结构清晰。在小立碗藓
愈伤组织细胞内，叶绿体为大量淀粉粒充塞，含
有少量但正常的内膜系统，这说明愈伤组织细胞
内叶绿体也出现脱分化现象。Vannini[11]发现在培
养基中添加乙酸、葡萄糖等碳源可诱导单细胞眼
虫藻中叶绿体退化。小立碗藓愈伤组织细胞电镜观
察结果进一步说明高葡萄糖使叶绿体发生退化。
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