全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 2期，2008年 4月 251
禾谷镰孢转化体系的优化
袁婷露 1,2，张彦 2，於新建 2，曹秀云 1，张栋 2,*
1沈阳农业大学农学院，沈阳 110161；2中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所，上海 200032
提要：禾谷镰孢是小麦赤霉病和玉米茎腐病的主要病原真菌。试验优化了聚乙二醇介导的原生质体转化法，建立了禾谷
镰孢高效转化的稳定体系，并总结了影响转化成功的主要因素。以此方法对禾谷镰孢进行活体荧光标记，并用转化菌株
侵染小麦胚芽鞘，在荧光显微镜下追踪病原真菌在宿主植物体内的生长及扩展过程。
关键词：禾谷镰孢；原生质体；转化
Optimization of Transformation System of Fusarium graminearum
YUAN Ting-Lu1,2, ZHANG Yan2, YU Xin-Jian2, CAO Xiu-Yun1, ZHANG Dong2,*
1College of Agronomy, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China; 2Institute of Plant Physiology and Ecology,
Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200032, China
Abstract: Fusarium graminearum is one of the main pathogens of wheat head blight and maize stalk rot. In this
paper, we optimized the transformation method using protoplasts mediated by polyethylene glycol (PEG), there-
fore set up an efficient transformation system for F. graminearum. We also discussed the key factors that
affect the transformation efficiency. Using this method, we were able to transform F. graminearum with
fluorescence marker containing plasmids. Inoculating wheat coleoptiles with fluorescence-labeled F. graminearum
strain allows live tracking of the growth and spread of F. graminearum within host plants.
Key words: Fusarium graminearum; protoplast; transformation
收稿 2008-01-28 修定 2008-03-17
资助 国家“973”计划(2006CB1 01901)和中国科学院知识
创新工程重要方向项目(KSCX2-YW-N-005)。
* 通讯作者(E-mai l：dzha ng@sippe.ac .cn；Tel：0 21 -
5 4 9 2 4 0 7 4 )。
过去 10年间，数十种真菌的全基因组序列被
测定公开，其中包括许多重要的病原真菌，这预
示着真菌遗传学的一个大发展(Galagan等 2005)。
大规模的致病基因筛选、深入的致病机理研究正
吸引着全世界越来越多的研究组进行真菌的遗传学
操作。虽然真菌的遗传转化相对植物而言更为简
便，早在上世纪 90年代早期就已建立了许多真菌
的转化方法，但是由于真菌的多样性、转化体系
的不稳定性等原因，使新加入的研究人员不易掌
握。本文详细介绍了稳定可靠的禾谷镰孢的原生
质体转化体系，并总结了转化成功的要点。
禾谷镰孢[Fusarium graminearum Schwabe，
有性态为Gibberella zeae (Schw.) Petch，称玉蜀
黍赤霉]是小麦和大麦赤霉病的主要致病真菌。赤
霉病在世界范围内尤其是亚洲、美洲、欧洲的强
烈爆发，对世界粮食资源形成了严重威胁(Dubin
等 1997)。在美国，赤霉病在植物病害中影响最
大，仅在 90年代，就使美国农业经济损失了 3亿
美元(McMullen等 1997；Windels 2000)。在我国，
小麦赤霉病也蔓延广泛，造成的损失仅次于小麦
条锈病(赵凌和魏莉娟 2003)。同时，禾谷镰孢还
能侵染玉米和水稻等禾谷类作物使其染病(Webster
和Gunnell 1992；White 1999)。禾谷镰孢带来的
危害是双重的：其一，它感染谷类，降低种子
的品质和产量；其二，它产生脱氧雪腐镰刀菌烯
醇(deoxynivalenol, DON)等真菌毒素，使感病的谷
物不能再被作为食物或饲料(McMullen等 1997)。
目前，禾谷镰孢菌株PH-1 (NRRL31084)的全
基因组序列已被测出，该菌株在欧洲和北美被发
现，并在世界范围都有分布(O’Donnell等 2000)。
该菌株全基因组序列的测出，对于研究禾谷镰孢
的致病基因及其致病机理有着重要意义。因此，
一个高效稳定的转化方法是从遗传学角度研究禾谷
镰孢致病基因必不可少的。本实验室在已有试验
方法的基础上建立了稳定的聚乙二醇(polyethylene
glycol, PEG)介导的原生质体转化法，对禾谷镰孢
PH-1菌株进行活体荧光标记，并用此禾谷镰孢侵
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染小麦胚芽鞘，在荧光显微镜下观察真菌对小麦
的侵染过程。
材料与方法
1 供试菌株、小麦品种及质粒
禾谷镰孢 PH-1菌株(Fusarium graminearum)
(图 1 )，由美国的普渡大学徐金荣教授提供。
NRRL5883菌株购自中国普通微生物菌种保藏中
心(编号 3.4521) ；小麦(Triticum aestivum)品种为
感病品种‘中原 98-68’；质粒 pZD101 (图 2)，
是将质粒 pUC18(TaKaRa D3218)加入了潮霉素
(hygromycin B)抗性片段、荧光(AmCyan)片段(来
自 BD Clontech公司)和粗糙脉孢霉(Neurospora
crassa) VM3启动子片段而获得；pZD101-RFP与
pZD101结构基本相似，只是将AmCyan荧光片段
改为 RFP红色荧光片段。
气煮沸，但由于火候原因造成批次之间差异较
大，改用高压灭菌锅比较稳定)，121 ℃ 10 min，
单层纱布过滤除渣；TB3培养基(Hou等2002)　：1.0 g
酵母膏，3.0 g水解酪蛋白，20%蔗糖，0.7%琼
脂糖；低熔点 TB3培养基(Hou等 2002) ：1.0 g酵
母膏，3.0 g水解酪蛋白，20% 蔗糖，0.7% 低
熔点琼脂糖；YEPD培养基(Hou等 2002) ：3.0 g
酵母膏，10.0 g蛋白胨，20.0 g葡萄糖，定容
于 1 L水；STC缓冲液 (Hohn和Desjardins 1992)　：
20%蔗糖，10 mmol·L-1 Tris-HCl，50 mmol·L-1
氯化钙，pH 8.0；PTC缓冲液：40% PEG4000，
溶于 S TC。
崩溃酶(driselase) ：Sigma D9515；几丁质
酶(chitinase) ：Sigma C6137；溶解酶( lysing
enzyme) ：Sigma L1412；液体溶菌酶(cell wall
degrading enzyme complex) ：Sigma V2010；氨
苄青霉素(ampicillin) ：Sigma A9518；潮霉素
(hygromycin B) ：Sigma H3274。
菌丝酶解混合液的配制：750 mg崩溃酶，12
mg几丁质酶，450 mg溶解酶，溶于 30 mL 1.2
mol·L-1氯化钾，在脱色摇床上轻摇(120 r·min-1) 1 h
后，使其充分溶解，离心(8 000×g) 8 min，弃
沉淀，取上清用作菌丝酶解混合液。
扩增潮霉素抗性基因的一对引物为 5 -
CATACTCTTCCTTTTTCAATTCAATGCGT-3，
5-CGCGGCTTCGAATCGTGGCTA-3，扩增条件
为 94 ℃变性 30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 2
min，30个循环。扩增AmCyan荧光标记基因的
一对引物为5-TAGCCCTGTCCAACAAGTTCATC-
3，5-TTAGAAGGGCACCACGGAGGT-3，扩增
条件为 94 ℃变性 30 s，53 ℃退火 30 s，72 ℃延
伸 1 min，30个循环。
3 禾谷镰孢原生质体制备
用无菌水从 V8培养基上洗下培养 1~2周的
PH-1的孢子，在 100 mL绿豆培养基中，在 25 ℃
下振荡(150 r·min-1)培养 3 d。单层纱布过滤离心
后，收集孢子沉淀，重悬于 100 mL YEPD培养
液中，在 25 ℃下振荡(175 r·min-1)培养 12~14 h
(注：严格控制不超过 14 h)。单层纱布过滤培养
液，收集留在纱布上的菌丝部分，用菌丝酶解混
合液重悬(酶解100 mL YEPD培养液中的菌丝，用
30 mL酶解混合液)，在 30 ℃下振荡(90 r·min-1)酶
图 1 禾谷镰孢 PH-1分生孢子和原生质体
Fig.1 Fusarium graminearum PH-1 spore and protoplast
a为分生孢子，b为原生质体，标尺为 20 µm。
2 培养基和试剂
V8培养基(Tuite 1969) ：163 mL V8果汁，
1.0 g碳酸钙，15 g琼脂，定容到 1 L水；绿豆
培养基[根据姚红燕等(2005)方法稍作改动] ：1 L
水加 40 g绿豆，放入高压灭菌锅(注：一般用煤
图 2 质粒 pZD101
Fig.2 Vector pZD101
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解 1~2 h。期间每隔 0.5 h在显微镜下观察原生质
体形成情况。在原生质体明显大量增多时，用尼
龙膜(Nitex nylon membrane，孔径 30 µm)过滤菌
丝酶解液，离心(1 000×g) 5 min，收集沉淀中的
原生质体。用 1.2 mol·L-1氯化钾洗原生质体沉
淀。离心(1 000×g) 5 min。期间显微镜观察，并
用血球计数板计数原生质体数目。用 STC重悬原
生质体，使其终浓度为 2×107~5×107个 ·mL-1。分
装原生质体于 EP管，每管 200 µL。慢冻后保存
于-70 ℃。一般每 100 mL YEPD菌液可得到 10
mL 原生质体。
4 原生质体转化
将质粒 pZD101用 SspI单酶切为线性，试剂
盒切胶回收(博大泰克 MK005-2)，取 20 µL(约 3
µg)，加入到 200 µL上述原生质体中，混匀，静
置 15 min，分 3次依次加入 100、200和 700 µL
PTC，每次间隔 1 min，混匀，再静置 10 min，
然后与 5 mL含氨苄青霉素(终浓度为 100 µg·mL-1)
的低熔点TB3培养基(提前在37 ℃下保温使其保持
液体形态)温和混匀，在加有氨苄青霉素(终浓度
为 100 µg·mL-1，可以抑制细菌生长)和潮霉素(终
浓度为 400 µg·mL-1)的TB3培养基上铺平板，室温
培养 4~5 d即有菌斑长出。
5 胚芽鞘侵染法
根据Wu等(2005)方法稍作改动，在小麦真
叶未长出时将小麦胚芽鞘剪去 2~3 mm，用棉花
条包裹，往棉花条中注入50 µL PH-1孢子菌液(孢
子浓度为 107个 ·mL-1)，将小麦置于光照培养箱内
在 24 ℃、相对湿度 99％的条件下培养 3 d后，取
下棉花，继续培养并观察病斑形成情况，并在显
微镜下观察菌丝在胚芽鞘细胞中的生长情况。
实验结果
1 原生质体制备及转化方法
经多次试验，首先在液体的绿豆培养基中培
养 72 h后获得大量孢子，然后转接到YEPD液体
培养基中，继续培养 12~14 h，这样得到的大量
新生菌丝作为原生质体制备的初材效果较好且稳
定。
在 PEG介导的转化方法中，酶解制备原生质
体是关键。我们采用了 Sigma公司的各种酶(材料
与方法 2), 并针对这些酶所需的酶解条件，分别
进行了试验。
1.1 缓冲液浓度对原生质体制备的影响 缓冲液对
酶的活性以及原生质体的稳定影响很大。我们试
验了KCl的不同浓度，发现用 1.2 mol·L-1 KCl作
为缓冲液原生质体得率最高(图 3)。
图 3 酶解缓冲液KCl的浓度与原生质体得率的关系
Fig.3 Effects of enzyme buffers at different KCl concentra-
tions on percentage of protoplasting
1.2 酶解液比例和酶解时间对原生质体制备的影
响 配制 1 mL酶液，分别尝试 4种组合：① 25
mg崩溃酶，0.1 mg几丁质酶，5 mg溶解酶；
② 25 mg崩溃酶，0.1 mg几丁质酶，15 mg溶解
酶；③ 25 mg崩溃酶，0.4 mg几丁质酶，5 mg
溶解酶；④ 25 mg崩溃酶，0.1 mg几丁质酶，
5 mg溶解酶，100 µL液体溶菌酶。结果表明，
采用第②种和第③种组合的酶解液时原生质体得率
最高(图 4)。因此将第②种和第③种组合比例综
合，在 1 mL酶解液中加入 25 mg崩溃酶，0.4
图 4 酶解液比例、酶解时间及原生质体得率的关系
Fig.4 Effects of different enzymatic lysis time and enzyme
combinations on percentage of protoplasting
植物生理学通讯 第 44卷 第 2期，2008年 4月254
mg几丁质酶，15 mg溶解酶。
试验表明，酶解时间在 1 h之后原生质体得
率大幅提高，虽然随着时间的延长得率还有所提
高，但是酶解时间过长会影响原生质体的活力，
降低转化效率，因此将酶解时间控制在 1~2 h。
1.3 转化及转化子的鉴定 我们采用带有组成型表
达启动子驱动下的 A m C y a n 荧光蛋白基因的
pZD101质粒DNA转化禾谷镰孢PH-1菌株。经4~5 d
培养后筛选培养基上的菌落为候选禾谷镰孢转化
子，挑取少量菌丝，在荧光显微镜下观察，可
以看到菌丝带有明显的蓝绿色荧光(图 5-c、d)，
而野生型禾谷镰孢菌丝的自发荧光(图 5-a、b)是
很微弱的，初步可以判断为转化子。提取转化子
的基因组 DNA，以此为模板进行 PCR扩增，得
到了转入质粒上的抗药性片段和荧光标记片段(图
6)，证实目的DNA片段已经插入到禾谷镰孢的基
因组中。我们用质粒 pZD101-RFP转化禾谷镰孢
PH-1，得到红色荧光蛋白标记的禾谷镰孢转化子
(图 5 - e、f )。用质粒 p Z D 1 0 1 转化禾谷镰孢
NRRL5883菌株，也得到了NRRL5883菌株转化
图 5 禾谷镰孢菌转化子菌丝
Fig.5 Mycelia of transformants of Fusarium graminearum
a、b 为禾谷镰孢野生型菌丝，c、d 为蓝绿色荧光蛋白标记的禾谷镰孢 P H -1 菌丝，e、f 为红色荧光蛋白标记的禾谷镰孢
PH -1 菌丝；g、h 为蓝绿色荧光蛋白标记的禾谷镰孢 N R R L5 8 8 3 菌丝；b、d、f、h 为荧光显微镜下的照片，标尺为 2 0 µ m。
图 6 转化子插入片段的 PCR结果鉴定
Fig.6 DNA fragments amplified by PCR from transformants
of Fusarium graminearum PH-1
1：转化子 D N A 为模板扩增荧光基因片段；2：质粒
p Z D 1 0 1 为模板扩增荧光基因片段；3：未转化的对照菌丝
D NA 为模板扩增荧光基因片段；4：转化子 D N A 为模板扩增
Hyg基因片段；5：质粒 pZD 1 01 为模板扩增 H yg 基因片段；
6：未转化的对照菌丝 D N A 为模板扩增 H y g 基因片段；7：
未加模板的扩增结果；M：D N A 分子量标记。
子(图 5-g、h)。这就表明该 PEG介导的原生质体
转化体系具有普遍适用性。
一般我们每次用 200 µL原生质体(2×107~
5×107个 ·mL-1)可得到转化子3~5个 ·µg-1质粒DNA。
2 禾谷镰孢在胚芽鞘细胞中的生长
采用表达荧光蛋白的禾谷镰孢转化子，我们
对禾谷镰孢在宿主体内的侵染过程进行了追踪观
察。采用转化菌株接种小麦胚芽鞘部位。10 d
后，小麦伤口部位产生明显的褐色病斑(图 7)。荧
光标记的禾谷镰孢侵染 3 d后，将小麦胚芽鞘病
斑部位剪下，在荧光显微镜下观察菌丝在胚芽鞘
细胞中的生长情况，发现菌丝已经侵入胚芽鞘细
胞，并已经扩展到其他细胞(图 8)。
讨　　论
原生质体转化法因为较简便，不需要构建像
植物生理学通讯 第 44卷 第 2期，2008年 4月 255
图 7 禾谷镰孢转化菌株侵染小麦胚芽鞘部位 10 d后
胚芽鞘病斑生长情况
Fig.7 Lesions developed on wheat coleoptiles infected by
Fusarium graminearum transformants 10 days
post inoculation
a为用水处理的对照, c为禾谷镰孢侵染的胚芽鞘，b和 d分
别为其胚芽鞘部位的放大图。
图 8 禾谷镰孢菌转化菌株菌丝在胚芽鞘细胞中
生长 3 d的状况
Fig.8 Mycelia within coleoptile cells 3 days post inoculation
by Fusarium graminearum transformants
在荧光显微镜下观察胚芽鞘病斑部位，绿色荧光标记的为
禾谷镰孢菌丝，标尺为 5 0 µm。
农杆菌转化所需的专门载体，因而目前仍是最常
用的转化方法之一。关于禾谷镰孢的转化方法，
国内外已有报道( P r oc t or 等 1 9 9 5；S a l ch 和
Beremand 1993；陈利锋 2001)，但是转化效率不
稳定且不易重复，究其原因是原生质体质量和得
率不高。所以我们主要从以下两方面进行了改
进：一是所收集菌丝的生长状态，以往报道中往
往较为忽视菌丝生长状态的描述，我们经多次试
验，确定首先在液体的绿豆培养基中培养 72 h后
获得大量孢子，然后转接到 YEPD 液体培养基
中，继续培养 12~14 h，这样得到的大量新生菌
丝作为原生质体制备的初材效果较好且稳定；二
是制备原生质体的酶的选用及酶解条件，以往方
法中所用的酶现在市场上有些已不再供应，使得
新开展这一工作的实验室无法重复，我们采用了
Sigma公司的各种酶, 并针对这些酶所需的酶解条
件，分别进行了试验，最终确定酶解液成分为1 mL
1.2 mol·L-1氯化钾中加入 25 mg崩溃酶，0.4 mg
几丁质酶，15 mg溶解酶，用此酶解液在 30 ℃
酶解新生菌丝得到的原生质体质量较好且得率较
高。本文还采用改进的 PEG介导的转化方法，对
禾谷镰孢 PH-1菌株进行了AmCyan、RFP等荧光
标记，对检验转化成功与否具有直观的效果，降
低了假阳性的几率。经过反复试验证明该方法成
熟稳定，本实验室已用该方法成功转化了数十种
不同的质粒，每 107原生质体每微克DNA的平均
转化效率达到 3~5个转化子。我们还用同样的方
法得到了禾谷镰孢NRRL5883菌株转化子，证明
该方法有着普遍适用性。
禾谷镰孢感染小麦，主要使小麦穗部产生病
症。但是在试验中，从小麦播种到长出穗子，历
时较长，不适合室内试验。Wu等(2005)报道，
通过室内禾谷镰孢接种小麦胚芽鞘、观察胚芽鞘
产生的病斑大小来鉴定禾谷镰孢致病力的强弱，
其结果与穗部试验结果高度相关。本实验选用感
病小麦品种‘中原 9 8 - 6 8’(贾建修和孔凡衫
2005)，采用荧光标记的禾谷镰孢菌株侵染小麦胚
芽鞘，1 d后即能在显微镜下观察到胚芽鞘细胞中
的菌丝，而且侵染时间越长，菌丝生长越迅速，
侵染范围越大。
目前，对禾谷镰孢如何侵染寄主并在寄主体
内继续生长等问题，还没有深入的研究。采用荧
光标记的禾谷镰孢菌株侵染小麦，便于在显微镜
下观察禾谷镰孢在寄主细胞中的生长情况，可能
会为解决上述问题提供帮助。
参考文献
陈利锋(2001). 禾谷镰孢菌高产毒菌株的构建. 菌物系统, 20 (3):
330~336
贾建修, 孔凡衫(20 05). 小麦新品种中原 98-6 8. 中国种业, 9 :
67~67
姚红燕, 陈利锋, 孙枫, 陈官菊, 俞刚(2005). 禾谷镰孢 Tri12基因
敲除突变体的致病力. 南京农业大学学报, 28 (2): 32~36
赵凌, 魏莉娟(2003). 小麦赤霉病的危害与检验. 质量跟踪, 12:
植物生理学通讯 第 44卷 第 2期，2008年 4月256
39~39
Dubin HJ, Gilchrist L, Reeves J, McNab A (1997). Fusarium Head
Blight: Global Status and Prospects. Mexico: International
Maize and Wheat Improvement Center (CIMMYT)
Galagan JE, Henn MR, Ma LJ, Cuomo CA (2005). Genomics of the
fungal kingdom: insights into eukaryotic biology. Genome
Res, 15 (12): 1620~1631
Hohn TM, Desjardins AE (1992). Isolation and gene disruption of
the Tox5 gene encoding trichodiene synthase in Gibberella
pullicaris. Mol Plant-Microbe Interact, 5: 249~256
Hou Z, Xue C, Peng Y, Katan T, Kistler C, Xu JR (2002). A
mitogen-activated protein Kinase (MGV1 ) in Fusarium
graminearum is required for female fertility, heterokaryon
formation, and plant infection. Mol Plant-Microbe Interact,
15 (11): 1119~1127
McMullen MP, Jones R, Gallenberg D (1997). Scab of wheat and
barley: a re-emerging disease of devastating impact. Plant
Disease, 81: 1340~1348
O’Donnell K, Kistler HC, Tacke BK, Casper HH (2000). Gene
genealogies reveal global phylogeographic structure and re-
pr odu c t ive i so la t i on a mong l in ea ge s of Fu s a r i u m
graminearum, the fungus causing wheat scab. Proc Natl Acad
Sci USA, 97 (14): 7905~7910
Proctor RH, Hohn TM, McCormick SP (1995). Reduced virulence
of Gibberella zeae caused by disruption of a trichothecene
toxin biosynthetic gene. Mol Plant-Microbe Interact, 8 (4):
593~601
Salch YP, Berema nd MN (1 99 3 ) . G ibb e r e lla pu l i c ar i s
transformants: state of transforming DNA during asexual
and sexual growth. Curr Genet, 23 (4): 343~350
Tuite J (1969). Plant Pathological Methods: Fungi and Bacteria.
Minneapolis: Burgess Publishing Company
Webster RK, Gunnell PS (1992). Compendium of Rice Disease. St.
Paul, MN: The American Phytopathological Society, 62
White DG (1999). Compendium of Corn Diseases. St. Paul, MN:
The American Phytopathological Society
Windels CE (2000). Economic and social impacts of Fusarium
head bligt: changing farms and rural communities in the
Northern Great Plains. Phytopathology, 90: 17~21
Wu AB, Li HP, Zhao CS, Liao YC (2005). Comparative pathoge-
nicity of Fusarium graminearum isola tes from China re-
vea led by wheat coleopti le and flore t inocula tions.
Mycopathologia, 160 (1): 75~83
Zheng L, Campbell M, Murray J, Lam S, Xu JR (2000). The BMP1
gene is essential for pathogenicity in the gray mold fungus
Botrytis cinerea. Mol Plant-Microbe Interact, 13: 724~732