全 文 ：植物生理学通讯 第41卷 第6期，2005年12月 805
5 种杂交粳稻亲本SCAR 标记的建立及其在真伪纯度鉴定中的应用
潘爱虎1,2 梁婉琪2 袁勤3 曹黎明3 陈亮1,* 张大兵2,4,*
1 厦门大学生命科学学院，细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室，福建厦门361005；2上海市农业科学院生物
技术研究中心，上海市农业遗传育种重点实验室，上海 201 1 0 6；3 上海市农业科学院作物育种栽培研究所，上海
201106；4 上海交通大学生命科学技术学院，上海 200240
Establishment of SCAR Markers and Its Application in Identification and Au-
thenticity of Parent Purity of Five Hybrid japonica Rice Lines
PAN Ai-Hu1,2, LIANG Wan-Qi2, YUAN Qin3, CAO Li-Ming3, CHEN Liang1,*, ZHANG Da-Bing2,4,*
1The Key Laboratory of Ministry of Education for Cell Biology and Tumor Cell Engineering, School of Life Sciences, Xiamen University,
Xiamen, Fujian 361005, China; 2Agro-biotech Center, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai Key Laboratory
of Genetic Breeding, Shanghai 201106, China; 3Crop Breeding and Cultivation Research Institute, Shanghai Academy of Agricultural
Sciences, Shanghai 201106, China; 4School of Life Science and Biotechnology, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200240,
China
提要 选用 36 个随机引物对“寒丰 A”、“寒丰 B”、“8204A”、“8204B”、“R161”等 5 份杂交粳稻亲本材料进行 RAPD 扩
增，对其中特异RAPD标记片段进行克隆和测序。根据获得的特异DNA 序列设计序列特征扩增区(SCAR)特异的引物，将
18 个 RAPD 标记转化成 6 个稳定的 SCAR 标记。用这些 SCAR 标记对亲本和杂种 F1 代单株进行检测，实验室检测种子纯
度的结果与海南田间种植的结果基本一致。此外，应用水稻细胞质雄性不育特异的1 对PCR 引物，分辨出2 对不育系/ 保
持系亲本：“寒丰 A”与“寒丰 B”、“8204A”与“8204B”。
关键词 杂交粳稻；种子纯度鉴定；RAPD 标记；SCAR 标记
收稿 2005-01-27 修定 　 2005-09-19
资助 上海市科技兴农重点攻关项目[农科攻字(2000)号第1-
3号]、上海市农业科学院青年科技基金(2000-09-02-1)。
*通讯作者(E-mail：zhangdb@sjtu.edu.cn, Tel: 021-
34201073)。
杂交粳稻亲本的纯度直接影响原种生产过程
中制种的效果，而杂交种的纯度又直接影响杂交
水稻的产量，因此，纯度低或真实性差的种子会
给农业生产和农民带来重大损失。
在种质鉴定中，传统的遗传标记如形态标
记、细胞标记、生化标记等都是基因表达型的标
记，可利用的多态位点较少，且易受环境影响，
不能满足种质资源鉴定的需要。
随着分子生物学技术的发展，一些分子标记
逐渐应用于种质资源的鉴定中，如随机引物扩增
多态性DNA (random amplification of polymorphic
DNA, RAPD)[1~4]、核酸限制性片段长度多态性
(restriction fragment length polymorphisms, RFLP)、
简单序列重复(simple sequence repeat, SSR)等，其
中 RAPD 的多态性检出率高，但是实验重复性和
可靠性较差，难以推广应用。而一种基于常规
PCR 反应、由 RAPD 标记转换而来的序列特征扩
增区(sequence characterized amplified region, SCAR)
标记，则可以克服这一缺点，受到广泛的关注。
本文在对15种上海地区主要杂交粳稻亲本材
料进行RAPD分析[3]的基础上，建立了其中5个亲
本的特异 SCAR 分子标记，并对目前上海地区杂
交粳稻三系法生产中使用的主要不育系：“寒丰
A ”、“8 2 0 4 A ”，主要的保持系：“寒丰 B ”、
“8 2 0 4 B”，主要的恢复系“R 1 6 1”，以及杂交
粳稻组合“8 优 1 6 1 ”、“寒优湘晴”、“申优
1 号”进行了真伪和纯度鉴定。
材料与方法
选用的粳稻(Oryza sativa)亲本品种包括“寒
丰 A ”、“8 2 0 4 A ”等 2 个不育系，“寒丰 B ”、
“82 0 4 B”等 2 个保持系，“恢复系 R16 1”，这
些材料为上海地区杂交稻推广应用的骨干亲本。
选用的杂交组合有“8 优 1 6 1 ”、“申优 1 号”、
“寒优湘晴”等，其中“8 优 1 6 1 ”是以
“8204 A”为母本，“R161”为父本杂交配组育
成的杂交粳稻新组合；“寒优湘晴”是上海市近
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年来主推的优质杂交稻品种，其父本为“湘
晴”，母本为“寒丰”；“申优 1 号”的父本
为“R 1 6 1 - 1 0 ”，母本为“寒丰”。这些材料
均由上海市农业科学院作物育种栽培研究所提供。
主要生化试剂Taq DNA 聚合酶和dNTPs 等均
购自 TaKaRa 公司。
按文献 5 方法从新鲜幼苗叶片中提取基因组
总 D N A 。
RAPD扩增共选用了36个 10碱基的随机引物
(购自上海生工生物工程有限公司，编号为 S1、
S3、S11、S13、S17、S21、S42、S43、S44、
S48、S66、S67、S68、S84、S118、S125、
S15 1、S1 5 7、S34 1、S3 5 3、S36 4、S3 7 1、
S43 3、S4 4 2、S44 4、S4 5 9、S46 4、S4 9 6、
S 1 0 0 1、S 1 0 1 9、S 1 0 2 0、S 1 0 3 6、S 1 1 4 3、
S1237、S1257、S1325)。RAPD 扩增反应采用
已建立的条件和体系[3]。RAPD 扩增产物在 1.2%
琼脂糖凝胶上电泳后，溴乙锭(EB)染色，用上海
天能公司生产的凝胶成像系统拍照分析。
从凝胶上切割下 RAPD 扩增的多态性 DNA 片
段，采用电洗脱法回收，方法参照文献 6。再将
回收的 DNA 片段克隆入 pMD18-T，筛选阳性克
隆进行测序分析。
根据杂交粳稻亲本“寒丰 A ”、“寒丰 B ”、
“8 2 0 4 A”、“8 2 0 4 B”、“R 1 6 1”特异的 R A P D
多态性 DNA 片段的测序结果，分别合成序列特异
性引物，进行 PC R 扩增。PC R 引物序列、扩增
片段大小见表 1。PCR 反应在 PTC100 PCR 仪(MJ
Reasearch)上进行。PCR反应体积为30 mL；PCR
反应体系中包括：50 mmol·L-1 KCl、10 mmol·L-1
Tris-HCl (pH 8.3)、1.5 mmol·L-1 MgCl2、0.2
mmol·L-1 dNTPs、0.6 mmol·L-1 引物、1.5 U Taq
DNA 聚合酶、50 ng 基因组 DNA 模板。PCR 反
应条件为：94℃预变性 3 min；然后94℃变性30
s，58℃退火40 s，72℃延伸 50 s，35 个循环；
72℃再延伸7 min。PCR 扩增产物进行2% 琼脂糖
凝胶电泳分析。
不育系与保持系亲本的PCR 鉴别参照 Akagi
等[7]的结果，合成 1 对引物，区分 2 对不育系与
保持系(“寒丰 A”与“寒丰 B”、“8 2 0 4 A”与
“8204B”)。将这对引物称之为细胞质雄性不育
(cytoplasmic male sterility，CMS)引物。其序列
为：CMS1, 5 ATGGCAAATCTGGTCCGATG 3；
CMS2, 5 ACTTCATAAGGAAAGACTAC 3。其扩
增产物为 239 bp。PCR 反应体积为 30 mL；PCR
反应体系中包括：50 mmol·L-1 KCl、10 mmol·L-1
Tris-HCl (pH 8.3)、1.5 mmol·L-1 MgCl2 、 0.2 mmol·L-1
dNTPs、0.6 µmol·L-1 CMS 引物、1.5 U Taq DNA
聚合酶、50 ng 基因组 DNA 模板。PCR 反应条
件为：94℃预变性3 min；然后 94℃ 变性 30 s，
56℃退火40 s，72℃延伸50 s，35个循环；72℃
再延伸7 min。PCR 扩增产物进行 2% 琼脂糖凝胶
电泳分析。
鉴定杂交粳稻亲本和杂交种真伪纯度时，提
取杂交粳稻亲本( 如“寒丰 A ”、“寒丰 B ”、
“8 2 0 4 A ”、“8 2 0 4 B ”、“R 1 6 1 ”) 和杂交种
(“8 优 1 6 1 ”、“寒优湘晴”、“申优 1 号”) 单
株幼苗基因组总 DNA，分别用序列特异性引物进
表1 序列特异的SCAR-PCR引物设计和预期的扩增片段大小
引物编号 SCAR引物序列 特异性 长度/ bp
98F 5 GGA CCC AAC CAC TGA CTC 3 “8 2 0 4 A ”、“8 2 0 4 B ” 863
98R 5 GGA CCC AAC CTT AAC TAC C 3
1041F 5 GAA CGG ACT CCT AAC TAC 3 R161 262
1041R 5 TAT GAC GGA GGA GCA TGT 3
1061F 5 GAA CGG ACT CCA AGA CGT 3 “寒丰 A ”、“寒丰 B ” 191
1061R 5 GGA CCC AAC CCA AAC TGT 3
1071F 5 ATC GCT GCG TGC AGC AAG 3 “寒丰 A ”、“寒丰 B ” 339
1071R 5 GAA CGG ACT CCT AAT TAT AGC 3
109F 5 CTA CTG CCG TTT TCA ACC 3 R161 684
109R 5 CTA CTG CCG TCA CAT GGA 3
112F 5 TCT GGT GAG GTT GCC AGC 3 “8 2 0 4 A ”、“8 2 0 4 B ”、“R 1 6 1 ” 633
112R 5 TCT GGT GAG GGA AAG GGA 3
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图1 S157引物分析5种粳稻亲本材料RAPD的电泳
　　1 ：“寒丰 A ”；2 ：“寒丰 B ”；3 ：“8 2 0 4 A ”；
4 ：“8 2 0 4 B ”；5 ：“R 1 6 1 ”( 箭头示特异条带) 。
行 PCR 扩增，记录和统计实验结果。与海南田间
种植的结果进行比对，验证实验室分子标记鉴定
的准确性。
实验结果
1 5 种杂交粳稻亲本的RAPD 标记
先后选用了 36 条 RAPD 随机引物对 5 种杂交
粳稻亲本，包括“寒丰 A ”、“寒丰 B ”、
“8 2 0 4 A”、“8 2 0 4 B”和“R 1 6 1”的 D N A 多
态性进行了分析。为了找到更多的 D N A 分子标
记，我们还尝试了将 2 种引物组合使用，扩增出
两端分别具有其中一条引物的 DNA 区段，从而产
生新的带型。PCR 扩增共得到差异性 DNA 条带 31
条。以 S157 引物为例，分析 5 种粳稻亲本材料
的 RAPD 电泳结果如图 1。
2 RAPD 标记转化为 SCAR 标记
对 31 个特异性片段进行了克隆、测序，其
中18个差异位点有明显的多态性，已根据这些设
计专一引物(即 SCAR 引物)共 18 对，并用这些引
图2 不同引物鉴定水稻SCAR-PCR的电泳
　　引物：a，98F/ 9 8 R；b，104 1 F / 1 0 4 1 R；c，109 F / 1 0 9 R；d，106 1 F / 1 0 6 1 R。M：DL2 0 0 0 分子量标记，大小分别为
2 000、1 000、750、500、250、100 bp; M：pGEM-7Zf(+)/HaeIII；0：空白对照，无 DNA 模板；1：“寒丰 A”; 2：
“寒丰 B ”; 3 ：“8 2 0 4 A ”；4 ：“8 2 0 4 B ”；5 ：“R 1 6 1 ”。
物对 5 种水稻的 DNA 进行了 PCR 扩增，发现其中
有6对引物(表1)在某些水稻种中显示为有差异的
特征带，表明由 RAPD 标记转化为 SCAR 标记成
功(图 2)，而其余12对引物在几种水稻中的扩增
结果无明显差异。
实验中，ID1041Q 的测序结果是 1 854 bp,
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ID1071的测序结果是362 bp。由于要考虑引物中
GC碱基的含量，设计引物的位置没有从测序片段
的两个末端开始，而是向片段的中间靠拢了一部
分，因此最后得到的 SCAR 片段的大小分别是：
引物1041F/1041R得到的 PCR产物为 262 bp，引
物 1071F/1071R 得到的 PCR 产物为 339 bp。
3 不育系和保持系亲本的PCR鉴别
针对难以区别水稻不育系与保持系的问题，
我们参照 Akagi 等[7]的结果，合成了 1 对 CMS 引
物。由于水稻不育系中含有这一专一序列，因此
采用这对引物，可以将两对不育系与保持系(“寒
丰 A”与“寒丰 B”、“8 2 0 4 A”与“8 2 0 4 B”)
区分开来。实验结果表明，在“寒丰 A ”、
“8204 A”这两个杂交粳稻亲本不育系中可以扩
增得到预期的目的片段239 bp，而在其相应的保
持系“寒丰 B”、“8 2 0 4 B”和恢复系“R 1 6 1”
中没有该大小的目的条带(图 3)。另据报道，某
些不育的胞质杂种植物中，PCR 扩增不出这一序
列，这里，其后代恢复了育性，显示在这些胞
质杂种中，可能是体细胞突变导致了不育之果。
4 5 种杂交粳稻亲本及其杂交种真伪纯度的鉴定
和应用
采用已有的 SCAR 标记的引物和 CMS 引物，
对上海市农业科学院作物育种栽培研究所送检的第
1批4个杂交粳稻亲本的样品进行了分子鉴定。经
与田间种植的结果比较，4 个样品的不育株率基
本吻合，4 个样品纯度有 3 个基本吻合，另有 1
个样品(8204A1)的分子检测纯度偏低，可能是由
于检测样本数目太少导致误差偏大。在此基础
上，对送检的第 2 批 3 种水稻种子“寒丰 A”(农
科 -1) A46、“8204A”(农科 -2) A47 和“寒优
湘晴”进行了纯度鉴定，并与海南种植的情况进
行相互验证。鉴定结果表明：加大了样本数量之
后，实验室鉴定的结果与田间鉴定的结果更加接
近(表 2)。“8 优 161”和“申优1 号”仅进行了
实验室分子检测，未得到田间种植鉴定结果。
讨　　论
杂交水稻在繁殖、制种过程中造成的人为或
机械混杂是亲本混杂退化的主要原因，外来花粉
图3 用 CMS引物对5种水稻进行PCR反应的结果
　　M：DL 2 0 0 0 分子量标记，大小分别为 2 0 0 0、1 0 0 0、
750、500、250、100 b p ; 0：空白对照，无 DNA 模板；
1 ：“寒丰 A ”；2 ：“寒丰 B ”；3 ：“8 2 0 4 A ”；4 ：
“8 2 0 4 B ”；5 ：“R 1 6 1 ”。
表2 实验室和海南田间种植鉴定杂交粳稻纯度的比较

品种

检测
不育系特异标记 SCAR特异标记
实验室
海南田间种植鉴定
　


　　　 纯度/% 数/株 CMS引物扩增 不育株 SCAR特异标 百分 实际纯 不育
阳性数/株 率/% 记阳性数/株 率 /% 度/% 率 /%
“寒丰 A ”1 号 36 36 100.0 36 100.0 100.0 99.6 —
“寒丰 A ”2 号 66 58 87.9 64 97.0 86.4 90.0 —
“8 2 0 4 A ”1 号 45 44 97.8 35 77.8 77.8 99.5 99.5
“8 2 0 4 A ”2 号 52 41 78.8 40 76.9 76.9 89.5 89.5
“寒丰 A”(农科 -1) A46 127 — — 126 99.2 99.2 99.9 —
“8204A”(农科 -2) A47 143 — — 143 100.0 100.0 99.9 —
“寒优湘晴” 137 — — 135 98.5 98.5 98.0 —
“8 优 1 6 1 ” 150 — — 138 92.0 92.0 — —
“申优 1 号” 122 112 91.8 112 91.8 90.2 — —
　 　“ — ”： 未 测 。
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侵入会造成亲本后代的生物学混杂、亲本本身的
基因突变等自然变异也会造成混杂退化[ 8 ]。此
外，不育系育性不稳、人为造假会影响杂交水稻
杂种纯度。假种坑农事件曾经给农业生产带来巨
大损失。由于水稻种子的纯度难以从种子形态上
辨认，因而简便、快速、准确、早期地对水稻
品种纯度进行鉴定十分重要[2,9]。
传统的种植鉴定最为直接可靠，但周期长、
费工占地，会延误农时；同工酶技术所能检测的
多态性位点少，无法鉴定出一些水稻品种间的串
粉所导致的杂种不纯，另外种子的生长时期不同
常常会影响同工酶酶谱的结果，故而对鉴定时期
要求严格[2]。RAPD 技术在种质鉴定中有广泛的应
用前景，它所需的样品 D N A 量少，反应灵敏度
高，没有组织和发育阶段的特异性，易于早期快
速检测，能大量揭示从形态和生理生化指标上无
法检测到的丰富差异[10,11]，但这项技术还有不够
稳定以及分析相对复杂的缺点。如将 RAPD 标记
转化为 SCAR-PCR 标记后，则可以增强所获得的
R A P D 标记的特异性，并可简化 P C R 分析。
鉴于目前对上海推广的粳稻分子标记的研究
很少，我们在对上海地区15种主要杂交粳稻亲本
材料进行RAPD分析[3]的基础上，建立了其中5个
亲本的 SCAR 标记，并对目前上海地区杂交粳稻
三系法生产中使用的主要不育系、保持系、恢复
系以及杂交粳稻组合进行了真伪和纯度的鉴定。
由于RAPD 标记中的一条 EB 染色的带可能是一种
单一的片段，也可能是一种混合标记，即在基因
组 DNA 中扩增位点不一、长度相同或不同的一组
片段的混合片段标记[ 1 2 ]，因此，并非所有的
RAPD 标记都能成功转化为 SCAR 特异标记，在转
化过程中，有部分 SCAR 引物扩增不出目标条带
或者在所有的基因型中都扩增出相同的条带而导致
多态性的丧失。这些 RAPD 的多态性可能是由于
引物结合位点的点突变造成的，而 SCAR 引物可
减轻突变区核苷酸序列的差异程度[13]。王斌等[14]
也认为并非所有 RAPD 或 AFLP 标记都可以转变成
SCAR 标记，仅有1/3 的 RAPD 标记可转变成 SCAR
标记，因为严紧的反应条件常常使反应的特异性
比较高。
从理论上讲，能够区分杂交水稻亲本的标
记，可有效地对这些亲本组合的杂交种进行鉴定[9]。
我们的结果表明，采用 SCAR 分子标记技术进行
杂交种纯度的鉴定是可行的，样本较少时虽然有
部分偏差，但若加大样本量后，实验室分子鉴定
的结果与田间种植鉴定的结果可以更加接近。根
据我们的经验，采用这一方法进行纯度鉴定，单
个样本的检测周期为 2~3 个星期，而海南鉴定纯
度则约需 90 d。另外，采用高压对 SCAR-PCR 产
物进行快速电泳，所用的琼脂糖材料节省、电泳
时间短，这为采用分子方法鉴定大批量杂交种子
的纯度与真实性提供了快速简单的检测SCAR-PCR
扩增产物的方法[15]。
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