全 文 ：植物生理学通讯 第41卷 第6期，2005年12月758
影响茎用芥菜愈伤组织诱导和植株再生的因素
陈利萍* 徐春霞 李春顺
浙江大学园艺系，杭州 310029
提要 茎用芥菜子叶培养在 MS+0.25 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 6-BA+0.25 mg·L-1 2,4-D 培养基上，可获得较高质量的愈伤组
织。愈伤组织培养在 MS+1~2 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 NAA 培养基上分化频率为 8.3%, 而在加有羧苄青霉素和头孢霉素的
培养基上，最高分化频率可达 52.4%。将获得的再生植株转移到 1/2MS+0.1 mg·L-1 NAA 的生根培养基中，可获得完整植株。
关键词 茎用芥菜；愈伤组织；分化；抗生素；植株再生
Factors Affecting Callus Induction and Plant Regeneration of Tuber Mustard
(Brassica juncea Coss. var. tumida Tsen et Lee)
CHEN Li-Ping*, XU Chun-Xia, LI Chun-Shun
Department of Horticulture, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China
Abstract When the cotyledons of tuber mustard (Brassica juncea Coss. var. tumida Tsen et Lee) were
cultured on MS medium containing with 0.25 mg·L-1 NAA, 0.5 mg·L-1 6-BA and 0.25 mg·L-1 2,4-D, the high
quality calli were obtained. The differentiation rate of these calli on MS medium containing 1–2 mg·L-1 6-BA and
0.2 mg·L-1 NAA was 8.3%. When the cefotaxime or carbenicillin was added into MS medium containing 1–2
mg·L-1 6-BA and 0.2 mg·L-1 NAA, the maximum differentiation rate reached 52.4%. After all the regenerated
shoots were transplanted on 1/2MS medium added 0.1 mg·L-1 NAA (rooting medium), the entire plants were
obtained.
Key words tuber mustard (Brassica juncea Coss. var. tumida Tsen et Lee); callus; differentiation; antibiotic;
plant regeneration
收稿 2005-04-11 修定 　2005-07-22
资助 浙江省自然科学基金项目(302340)。
*E-mail: Chenliping@zju.edu.cn, Tel: 0571-86971006
茎用芥菜(Brassica juncea Coss. var. tumida
Tsen et Lee)是十字花科芸薹属的一类蔬菜，在浙
江、四川等省都有大面积栽培。从其获得再生植
株体系来说，通过原生质体培养、子叶直接诱导
不定芽等建立的再生体系已有所报道[1～4]。而用
组织或器官诱导愈伤组织和再生植株的报道还未
见。愈伤组织的诱导、分化和再生植株是作物遗
传多样性获得和遗传转化的途径之一，对茎用芥
菜种质改良和资源创新也有一定的意义。本文探
索几种影响茎用芥菜愈伤组织的诱导、分化和植
株再生的因素。
材料与方法
以茎用芥菜(Brassica juncea Coss. var. tumida
Tsen et Lee)细胞质雄性不育系的无菌苗为材料。
无菌苗的培育方法如下所述，挑选籽粒饱满的种
子，用自来水反复冲洗后，再用 75% 酒精消毒 1
min，蒸馏水冲洗 3 次，而后在 5% NaClO 水溶
液(加洗洁精1~2滴)中灭菌 15 min，无菌水冲洗
4~5 次，在超净工作台内用滤纸吸干种子表面水
分，播于 1/2MS[5]+0.1 mg·L-1 6-BA 的培养基中。
暗处发芽24 h后，在 16 h·d-1 连续光照下培养。
取播种后 8 d 的无菌苗子叶，切成 0.1~0.2
mm×0.1~0.2 mm 大小，放入表 1 所示的 MS 附加
不同浓度 6-BA 和 NAA 的培养基中。每瓶培养基
上放5个外植体，重复3次。诱导至20 d时统计
愈伤组织的诱导频率及性状。每 20 d 继代 1次，
将经过2次继代培养的愈伤组织转到分化培养基中
进行分化培养，第 9 天统计出现绿点的愈伤频
率，30 d后统计分化频率。将诱导的芽转入1/2MS
培养基中进行壮苗 1 周，然后转入生根培养基
1/2MS+0.1 mg·L-1 NAA 中生根。取出已经生根的
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再生小植株，移栽至基质(蛭石∶珍珠岩 =1∶1)
中进行炼苗生长。
以上各培养基中蔗糖含量均为30 g·L-1，琼脂
为 8 g·L-1，pH 值为 5.8。培养温度 25℃。除愈
伤组织诱导和继代培养需在连续黑暗条件下以外，
其它均在16 h·d-1 连续光照条件下培养。
实验结果
1 子叶愈伤组织的诱导
据茎用芥菜原生质体培养的实验报道，原生
质体诱导的愈伤组织在增殖过程中易出现毛状根或
生根，从而影响愈伤组织质量和进一步的分化。
以一定组合的 NAA 和 2,4-D 诱导愈伤组织可取得
比较满意的结果[2]。为了获得具有分化能力的愈
伤组织，我们研究了不同种类和浓度植物生长调
节剂对愈伤组织诱导的影响。结果(表1)表明，茎
用芥菜子叶培养在 MS 附加不同浓度 NAA 和 6-BA
的培养基上时，外植体在形成愈伤组织的同时会
形成大量的不定根、毛状根及不定芽(图1-a)，不
能获得完全脱分化的愈伤组织。而加入2,4-D可抑
制根和芽的发生，2,4-D 与 NAA 和 6-BA 的不同组
合形成不同颜色和质地的愈伤组织。根据我们培
养茎用芥菜原生质体的结果[2]，乳白色、细颗粒
状愈伤组织具有较好的分化潜力(图 1-b)。因此，
我们即用这类愈伤组织作进一步的分化试验。
表1 不同种类和浓度的植物生长调节剂对茎用芥菜愈伤组织诱导的影响
Table 1 Effects of various concentrations and plant growth regulators on callus induction of tuber mustard
培养基(浓度/mg·L-1) 愈伤组织形成的量 愈伤组织的特性
M S 无 无
MS+NAA 1 + 根，毛状根
MS+NAA 1+6-BA 0.5 +++ 根，毛状根，不定芽
MS+NAA 0.5+6-BA 0.5 +++ 根，毛状根，不定芽
MS+NAA 0.25+2,4-D 0.25+6-BA 0.5 ++ 乳白色，细颗粒状
MS+2,4-D 0.25+6-BA 0.5 ++ 奶黄色，细颗粒状
MS+2,4-D 1+6-BA 0.5 +++ 黄色，较大颗粒状
MS+2,4-D 1 ++ 白色，大颗粒状
　　“+ ”代表愈伤组织的生长量的相对多少，“+ ”越多表示相对生长量越大。
图1 茎用芥菜愈伤组织的诱导和植株再生
Fig.1 Callus induction and plant regeneration of tuber mustard
　　a：根和毛状根的形成；b：有分化能力的愈伤组织；c：愈伤组织在分化培养上出现绿点；d：分化过程中毛状根的形成；
e ：不定芽的形成；f ：根的形成；g ：移栽后的再生植株。
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2 愈伤组织的分化
将所选愈伤组织接种在分化培养基 MS+1~2
mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 NAA 上，培养1周后开始
出现绿点(图1-c)，第9天时出现绿点的愈伤组织
可达 41.7%。但随着愈伤组织的进一步分化，也
同时长出毛状根(图1-d)，一些绿点未再继续分化
为不定芽，最后不定芽分化频率仅为8.3% (图1-
e)。为了建立高效的愈伤组织分化再生体系，我
们研究了不同植物生长调节剂对愈伤组织分化的影
响，但没有获得满意的结果。有研究表明，分
化培养基中加一定的抗生素能促进愈伤组织的生长
和分化。如唐巍等[6]在火炬松的实验观察到，500
mg·L-1羧苄青霉素和2 mg·L-1 6-BA、0.5 mg·L-1 IBA
的组合可促进转基因愈伤组织生长和分化，前者
增加 54.2%，后者增加 45.7%。也有一些实验认
为，抗生素对愈伤组织诱导和分化有抑制作用[7]。
我们研究抗生素影响茎用芥菜愈伤组织分化的结果
表明，培养基中加入不同浓度羧苄青霉素或头孢
霉素时，愈伤组织分化频率明显提高(图 2)，加
入 250 mg ·L-1 羧苄青霉素的最高分化频率可达
52.4%。
3 生根培养
通过愈伤组织获得的再生芽都比较弱小，因
此生根前需要在1/2 MS培养基中培养1周左右再
转到生根培养基 1/2MS+0.1 mg·L-1 NAA 上，90%
以上可以生根，长成完整植株(图 1-f、g)。
讨　　论
愈伤组织分化是植物再生的重要环节。以往
的研究，主要是通过选择培养基中适宜的植物生
长调节剂和合宜浓度的生长调节剂来提高分化频
率。本文在茎用芥菜愈伤组织分化培养基中加入
抗生素后的结果表明，羧苄青霉素和头孢霉素不
但没有降低愈伤组织的分化频率，反而促进分化
频率的大幅提高。抗生素提高分化频率的机制是
什么，尚待进一步研究。
茎用芥菜高效再生体系的建立为采用现代生
物技术辅助常规育种提供了保障。在茎用芥菜再
生体系研究中，原生质体培养再生体系的建立有
其独特的优点，但其实验技术要求高，应用于体
细胞无性系变异和基因转化还有一定的距离和困
难。因此，我们仍先从组织水平上建立再生体
系。有研究表明，通过愈伤组织获得的再生植
株，可丰富植株的遗传多样性[8,9]。但用组织培养
技术进行基因转化获得的转基因植株，有时会存
在着其他性状不够理想等问题。因此，获得转基
因植株的遗传多样性就显得尤为重要，而本文结
果可能对解决这一问题有所帮助。
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图2 抗生素对茎用芥菜愈伤组织分化的影响
Fig.2 Effects of antibiotics on callus
differentiation of tuber mustard