全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 3期，2007年 6月 547
田间栽植芦笋嫩茎的原生质体分离条件初探
尹富强 1，陈光宇 2,*，周劲松 2，罗绍春 2，汤泳萍 2，占丰溪 2，刘宜柏 1
1江西农业大学农学院，江西南昌 330045；2江西省农业科学院生物工程中心，江西南昌 330200
收稿 2007-01-22 修定 　2007-04-23
资助 江西省自然科学基金(赣科基办字[2002]3 号)和江西省
自然科学基金(0 4 3 00 4 3 )。
* 通讯作者(E-ma i l：genebk sh@hotma i l . com；T el：
07 91 -7 09 03 08 )。
田间栽植芦笋(Asparagus officinalis L.)嫩茎的
原生质体分离在江西省农业科学院生物工程中心进
行。酶溶液以Km8p培养基为溶剂，称取一定量
的纤维素酶Onozuka R-10 (Yakult Honsha Co. Ltd.)、
半纤维素酶Hemicellulase (Sigma H-2125)和果胶酶
Pectinase (Tokyo Kasel Kogo Co. Ltd.)，并附加 0.1%
的MES、0.2%的 CaCl2·2H2O和 0.6~0.9 mol·L-1葡
萄糖作为渗透压调节剂，待完全溶解后调pH至5.8，
在无菌操作台上用 0.45 µm的滤膜抽滤至锥形瓶
中，备用。从田间取出 10~20 cm长的嫩笋，剥
掉鳞片后在自来水下轻轻擦洗 10 min，剪去顶端
鳞片包被的部分，在无菌操作台上切成段后用
75%酒精灭菌 2 min，用无菌水冲洗 1次，再用
10%的次氯酸钠灭菌 15 min，后用无菌水冲洗 5
次，用刀片削去嫩笋表皮，并切成薄片后，无
菌条件下称量 1.5 g置于盛有 10 mL酶液的锥形瓶
中，放在(26±1) ℃遮光的摇床上低速振荡酶解。
酶解 2 h后，每小时在显微镜下观察 1次，以确
定酶解的最终时间。原生质体产量达到最大时，
用界面法纯化原生质体，培养。所有处理均重复
3 次，结果如下。
1. 芦笋嫩茎原生质体分离的最佳酶组合和浓
度为：0.3%纤维素酶、0.1%半纤维素酶和 0.1%
果胶酶。半纤维素酶对芦笋嫩茎原生质体的分离
是必需的，不使用的原生质体产量非常低(图 1)。
2. 芦笋嫩茎原生质体分离的最佳渗透压物质
图 1 不同酶解条件对芦笋嫩茎原生质体产量的影响
　　在 0.2%半纤维素酶和 0.1%果胶酶浓度恒定的条件下，不同浓度纤维素酶用于芦笋嫩茎原生质体的分离，其 LSD0.05=0.31×106
个 · g-1 [即在 α=0.05 水平上，最小显著差数(LSD)等于 0.31×10 6个 · g-1，若处理间的差数大于该值，则表示在给定水平上处理间差
异显著，反之，则差异不显著，下同]；在 0 . 3 % 纤维素酶和 0 . 1 % 果胶酶浓度恒定的条件下，不同浓度半纤维素酶用于芦笋嫩
茎原生质体的分离，其 LSD0.05=0.28×10 6个 · g -1；在 0.3%纤维素酶和 0.1%半纤维素酶浓度恒定的条件下，不同浓度果胶酶用于
芦笋嫩茎原生质体的分离，其 LSD0.05=0.36×106个 · g-1。
为 0.8 mol·L-1的葡萄糖，比用芦笋愈伤组织或组
培苗分离原生质体的渗透压都高，这可能是由于
芦笋嫩茎含有大量的维生素、氨基酸和矿质元
素，尤其是其氨基酸含量更高，以致细胞渗透压
升高之果。因而分离芦笋嫩茎原生质体时要求高
渗透压(图 2)。
3. 不同生长季节的田间栽植芦笋嫩茎与原生
质体分离也有关系。4~6月份的材料分离原生质
体所需酶浓度低(0.3%纤维素酶、0.1%半纤维素
酶和 0.1%果胶酶)，酶解时间短(4 h)，平均产量
植物生理学通讯 第 43卷 第 3期，2007年 6月548
图 2 不同酶解条件对芦笋嫩茎原生质体分离的影响
　　在 0.3% 纤维素酶﹑ 0.1% 半纤维素酶和 0.1% 果胶酶恒定的条件下，不同酶解条件用于芦笋嫩茎原生质体的分离。渗透压浓
度 LSD0.05=0.48×106个 ·g-1。酶解时间 LSD0.05=0.51×106个 ·g-1。不同基因型 LSD0.05=1.02×106个 ·g-1。
高(2.5×106 个 ·g-1)。11~12月份的材料所需酶浓度
高(1.5%纤维素酶、1.5%半纤维素酶、1%果胶
酶)，酶解时间明显延长(8 h)，平均产量反而降
低(1.0×106 个 ·g-1)。所以，要想获得高产量和高
质量的原生质体，应在 4~5月份即芦笋生长旺盛
期取材。
4. 不同基因型芦笋嫩茎的原生质体产量差异
很大，在 5 个品种中，‘Purpls passion’为四
倍体，‘U C 1 5 7’、‘A t a l s’、‘A p o l l o’和
‘Jersey knight’均为二倍体。部分品种间原生
质体产量差异显著，但以四倍体品种产量最低，
这可能与其倍性有关(图 2)。
5. 芦笋嫩茎的最佳酶解时间为 4 h (图 2) ；
在相同酶解条件下，同一品种的白芦笋产量略高
于绿芦笋。
6. 酶浓度、酶解时间、酶解渗透压和取材
时间都是优化的芦笋品种‘Atals’产量最高，可
达 3.0×106个 ·g-1。