全 文 ：植物生理学通讯 第 40卷 第 3期，2004年 6月 319
几种影响籼稻成熟胚愈伤组织诱导及再生的因素
刘元风1,2 刘彦卓1 贺红3 王金花1,2 李玲2 李晓方1,*
1广东省农业科学院水稻研究所, 广州 510640； 2华南师范大学生命科学学院，广州 510631；3莱阳农学院农学系 , 莱
阳 265200
提要 建立了适合5 个籼稻品种成熟胚籼稻遗传转化的高效植株再生体系。N6 基本培养基有利于籼稻愈伤组织的诱导和
继代培养 ；N6 大量元素和 MS 微量元素有利于愈伤组织的分化。降低分化培养基中蔗糖含量，加入适量山梨醇、Cu2+、
Ag+ 和玉米素(ZT)均可明显提高水稻愈伤组织的再生植株频率，5 个品种分化频率均达到 75% 以上。
关键词 籼稻；成熟胚；愈伤组织；再生植株
Factors Influening of Callus Induction and Plantlet Regeneration from Ma-
ture Embryos in Indica Rice
LIU Yuan-Feng1,2, LIU Yan-Zhuo1, HE Hong3, WANG Jin-Hua1,2, LI Ling2, LI Xiao-Fang1,*
1Rice Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640; 2College of Life Sciences, South China
Normal University, Guangzhou 510631; 3Department of Agronomy, Laiyang Agricultural College, Laiyang 265200
Abstract A high efficient regeneration system of five indica rice suitable for genetic transformation were
established. N6 mediun was suitable for calli induction and subculture of indica rice. The N6 macroelements
and the MS microelements were advantageous to callus formation. By reducing sucrose and supplementing
with sorbitol, copper, silver and zeatin(ZT) to the media, the plantlet regeneration frequencies were evidently
increased. The plantlet regeneration frequencies of five varieties were over 75% in these media.
Key words indica rice; mature embryo; callus; plantlet regeneration
收稿 2003-09-15 修定 　 2004-02-09
资助　 国家自然科学基金重点项目 (30040025)。
* 通讯作者 (E-mail: lixiaofang38@263.net, Tel:020-85266185)。
业已建立的水稻 3 个亚种粳稻、籼稻和爪哇
稻的农杆菌转化体系[1~3]，主要针对某些模式品
种，并不适用于各水稻亚种内的所有品种。这些
水稻分化再生培养体系的常用外植体是幼胚、幼
穗、花粉粒和花药，其绿苗分化频率虽然高，但
材料来源受季节限制，实用性常受到一定程度的
影响。相对于幼胚和幼穗等外植体，成熟胚取材
不受季节限制，应用于遗传转化最为便利。3 个
亚种中，籼稻组培再生能力低[4]，仅有少数品种
可用于遗传转化。本文主要探讨不同基本培养基
中大量元素与微量元素组合、渗透压、生长调节
物质配比、山梨醇、Cu2+ 和 Ag+ 对水稻愈伤组织
再生频率的影响，并建立和优化了水稻成熟胚诱
导愈伤组织分化再生植株体系，可供高效农杆菌
介导的籼稻遗传转化体系参考。
材料与方法
5个籼稻(Oriza sativa sub.indica)品种矮秀占、
绿黄占、茉莉新占、绿源占 7 号和粤香占均由广
东省农业科学院水稻研究所育成。
分别在 5 个品种中挑选健康籽粒，手工剥去
颖壳，用75%酒精表面消毒2 min，再放入3.75%
次氯酸钠溶液消毒 40 min，无菌水冲洗 3~5 次，
然后接种到各诱导培养基上。每个处理接种 1 5
瓶，每瓶 18 粒，重复 3 次，置于 25~26℃下暗
培养，以诱导愈伤组织。10 d 后，统计 5 个材
料愈伤组织诱导率并观察愈伤组织质量状态。挑
选表面干爽、结构致密的愈伤组织，转到诱导培
养基上或4种组合继代培养基(表1)上，继代培养
1~2 次，每次 7~10 d，观察和比较 2种培养基对
愈伤组织继代培养的影响。
愈伤组织的分化和生根培养时，从继代 1~2
次的愈伤组织(每10 d继代1次)中挑选表面干爽结
构致密的愈伤组织置于高温灭菌的 50 mL 三角瓶
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表1 愈伤组织诱导、继代、分化和生根培养基的成分
Table 1 Components of media for callus induction, subculture, plantlet regeneration and rooting
培养基 组成成分/mg·L-1
N 6 D N6[5]+ 脯氨酸 500+ 水解酪蛋白（CH）300+2,4-D 2+ 琼脂 7 g·L-1+ 蔗糖 30 g·L-1，pH 5.8
N B N6 大量 +B5 有机、微量 +脯氨酸 500 +CH 300+2,4-D 2+ 琼脂 7 g·L-1+ 蔗糖 30 g·L-1，pH 5.8
N D N6+脯氨酸2.8 g·L-1+CH 300 +2,4-D 2+蔗糖30 g·L-1+琼脂8 g·L-1， pH 5.7
N M B N6 大量 +MS 微量 +B5 有机 +谷氨酰胺 250+ 脯氨酸 500+CH 300+2,4-D 2+ 蔗糖 30 g·L-1+ 琼脂 8 g·L-1，pH 5.8
M S MS[6]+ 脯氨酸 500+CH 300 +2,4-D 2+ 琼脂 8 g·L-1+ 蔗糖 30 g·L-1，pH 5.8
J1 N6D+ 甘露醇 12 g·L-1，pH 5.8
J2 J1+ZT 0.5+NAA 1，pH 5.8
J3 NB+ABA 3+ 甘露醇 12 g·L-1，pH 5.8
J4 NMB+6-BA 0.25 +NAA 0.5 + 甘露醇 12 g·L-1，pH 5.8
R 1 N6 大量、有机 +2倍 MS微量 +CH 1 000 +6-BA 2 +NAA 0.2+ 蔗糖 30 g·L-1+ 琼脂 8 g·L-1 ，pH 5.8
R 2 大量、微量、有机、CH、6-BA、NAA 及琼脂同 R1+ 山梨醇 20 g ·L -1+ 蔗糖 10 g ·L -1，pH 5.8
R 3 R2+ AgNO3 4，pH 5.8
R 4 R2+CuSO4 0.8，pH 5.8
R 5 R2+ZT 0.5，pH 5.8
R 6 M S 大量、微量 + N 6 有机 + C H、6 - B A、N A A、C u S O 4、山梨醇、蔗糖及琼脂同 R 2，p H 5 . 8
R 7 M S 大量及 2 倍微量 +N6 有机 +CH、6 - B A、N A A、C uS O 4、蔗糖及琼脂同 R2，pH 5 . 8
R 8 N 6 + C H、6 - B A、N A A、C u S O 4、山梨醇、蔗糖及琼脂同 R 2，p H 5 . 8
R 9 R2+ 脯氨酸 500，pH 5.8
M o 1/2MS +CH 1 000 +NAA 0.5 +蔗糖 30 g·L-1+ 琼脂 8 g·L-1，pH 5.8
　　N 6 D 、N B 、N D 、N M B 、M S 为诱导培养基；J 1 、J 2 、J 3 、J 4 为继代培养基；R 1 、R 2 、R 3 、R 4 、R 5 、R 6 、
R 7 、R 8 、R 9 为分化培养基；M o 为生根培养基。
中，用高温灭菌的2层牛皮纸封口，干燥3~5 d，
转入9种组合的分化培养基上，置于25~27℃光照
下培养(12 h光照/12 h黑暗，光照度为0.04 mmol ·
m-2·s-1) 5 周左右，15 d更换1次培养基，诱导芽
的分化，30 d 时统计小苗分化率。绿苗高约5~8
cm 时，转移到生根培养基上，促进根的生长，根
的生长率为100%。3~4 周后，用自来水将附在幼
苗上的培养基冲洗干净，移栽到温室中炼苗(盆
栽，即土壤培养)。3 d后，放在室外培养至成熟，
成活率为100%。在对水稻成熟胚愈伤组织的各分
化培养条件进行初步优化基础上，选取R1 为基本
分化培养基，另添加适当浓度的山梨醇、CuSO4、
AgNO3、ZT，观察这些物质对愈伤组织分化的影
响。
结果与讨论
1 培养基成分对水稻成熟胚愈伤组织诱导率的影
响
MS和N6是两种在水稻愈伤组织培养中应用最
为普遍的培养基，两者的成分明显不同，对愈伤
组织诱导和植株再生的效应也明显不同。从表2可
以看出，5 个品种在N6D[7]和 NB 培养基上的愈伤
组织诱导率比 NMB 约高 50%，比 MS 约高 40%；
在 ND 上愈伤组织诱导率虽为 57%~72%，但诱导
的愈伤组织结构致密、呈颗粒状、表面光滑、生
长旺盛(图 1-a、b)，而在 NMB 和 MS 上形成的愈
伤组织呈不分散的表面水浸状，很难分化成苗。
说明N6 培养基利于愈伤组织的诱导，而含MS 基
本成分的培养基则不利于愈伤组织的诱导；在愈
伤组织的诱导过程中，添加脯氨酸能明显地促进
表2 水稻成熟胚在不同培养基上愈伤组织的诱导率
Table 2 Callus induction rate in various induction media
愈伤组织的诱导率/%
培养基
茉莉新占 绿黄占 粤香占 矮秀占 绿源占7号
N6 D 95 97 97 92 90
N B 95 98 97 90 91
N D 65 72 63 57 58
N M B 40 41 35 33 37
M S 53 55 48 45 40
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愈伤组织的生长。由于品种差异, 5个品种中, 以
绿黄占在 N B 上形成的愈伤组织的结构和颜色较
好，其他4 个品种的较差。以上说明，N6D 和 ND
较适合作为这5 个品种愈伤组织的诱导培养基。
2 愈伤组织的继代培养
将在N6D 和 ND 诱导 10~12 d 的愈伤组织(图
1-b)从萌发的种胚剥离开来，转移到诱导培养基
上或 4 种继代培养基上继续培养。第 5 天观察，
诱导培养基和继代培养基上的愈伤组织状态没有显
著差异。而 7 d 后，特别是第 10 天时，继代培
养基上愈伤组织虽然渐渐长大，但结构疏松，颗
粒细而分散，色泽较暗；诱导培养基上继续培养
的愈伤组织则结构致密，颗粒状呈分散少，颜色
鲜黄，易分化成苗[8](图1-c)。实验结果表明，在
继代培养时，添加细胞分裂素、ABA 和甘露醇并
非对所有水稻品种愈伤组织的继代培养都有利。
如果初代培养的愈伤组织质量状态较好，继代时
可选用初代培养基。
3 植株的再生
MS 含有比 N6 浓度高且种类多的微量元素，
因而诱导再生植株效果更好[9]。在培养基中添加
2~3倍的MS微量元素，植株再生频率有显著提高[10]。
从表3可以看出，5个品种在相同大量元素的情况
下，R1、R 2、R 3、R 4 及 R 5 有利于植株再生，
R8 抑制植株再生；在相同微量元素情况下，R1、
R2、R3、R4 及 R5 有利，而 R6 和 R7 则抑制植
株再生。表明 N6 大量元素和 MS 微量元素组合的
培养基有利于植株再生，而含 MS 大量元素的培
养基则抑制植株再生(图 1-h)，但在生根培养时，
MS 大量元素和 N6 大量元素对植株根系生长没有
差异。在分化培养基 R9 上添加脯氨酸后，植株
的分化受到明显的抑制，说明脯氨酸在愈伤组织
分化时，可能通过鳌合铜离子来抑制不定芽的萌
发，延缓不定芽的形成。而朱根发和余毓君[9]认
为脯氨酸有利于愈伤组织分化。
在分化培养基中加入山梨醇，不仅可提高渗
表3 不同品种水稻在不同分化培养基上的分化频率
Table 3 Plantlet regeneration frequencies of five varieties
in different media
培养基 　　　愈伤组织的分化频率/% 茉莉新占 绿黄占 粤香占 矮秀占 绿源占7号
R1 7.0 2.0 5.4 3.2 0
R2 35.8 15.0 41.1 24.6 22.3
R3 88.9 87.5 87.3 80.0 79.3
R4 84.6 80.0 86.4 75.0 75.5
R5 86.7 78.0 78.3 74.4 75.3
R6 16.0 5.0 11.5 1.6 0
R7 3.0 0 1.7 0 0
R8 34.8 31.2 40.3 34.4 33.9
R 9 23.0 12.0 10.0 17.0 5.0
图1 茉莉新占成熟胚诱导的愈伤组织及其再生植株
Fig.1 The calli from mature embryos and the plantlets of‘Molixinzhan’
　　 a.诱导4 d的成熟胚; b. 诱导10 d的愈伤组织; c. 在诱导培养基上继代7 d的愈伤组织; d. 添加AgNO3(R3)后分化呈现的畸形小
苗; e. 添加CuSO4(R4)后分化形成的小苗; f. 添加ZT(R5)后长成的小苗; g. 左为未添加微量元素CuSO4 (R2), 右为添加CuSO4 (R4)后长
成的小苗; h. 在 MS 基本培养基(R7)上长成的小苗。
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透压，也有利于水稻愈伤组织的分化[12]，又可作
碳源[13]。我们的结果显示，在分化培养基中添加
适量山梨醇，降低蔗糖含量，对植株再生有显著
促进作用。分化培养基R2中添加20 g·L-1山梨醇，
蔗糖含量降低至10 g·L-1，植株再生频率明显高于
R1。以上表明提高山梨醇与蔗糖的比例有利于愈
伤组织分化。这种分化培养基可能是渗透压高，
还原力强，可阻抑酚类物质的形成，防止愈伤组
织褐化；山梨醇氧化可形成葡萄糖或果糖，进而
在植物细胞内形成蔗糖或麦芽糖，补充碳源，从
而促进愈伤组织分化。如果不降低蔗糖含量，植
物则优先利用蔗糖，以致山梨醇的作用明显降低。
以铜、银短时间处理水稻愈伤组织可增强愈
伤组织中过氧化物酶(POX)活性，从而诱导水稻
愈伤组织绿苗分化[14]; 杨跃生等[10]也认为在分化培
养基中添加5 mmol·L-1 CuSO4，是提高水稻愈伤组
织小苗分化率简单而有效的方法。本文结果显
示，分化培养基R4中添加 0.8 mg·L-1 CuSO4，至
第 4 天时，可见到一些愈伤组织表面出现含有叶
绿素的半球状多细胞的绿色区域，2 周后大部分
绿色区域开始形成幼芽，很少褐化(图1-e、g右) ；
R2 中不含 CuSO4，培养到第 4 天时，其愈伤组
织表面未见到这种变化，继续培养到10 d时，才
有绿点出现(图1-g左)，20 d时少数绿点区域开始
形成幼芽。说明 CuSO4 能促进芽的形成，提高绿
苗形成率。
AgNO3 可促进植物离体器官发生。农杆菌介
导甘蓝型油菜时，AgNO3 促进转化的油菜外植体
芽的再生，提高转化率[15]; Gil等[16]在水稻遗传转
化时观察到，A g N O 3 可克服植物细胞的超敏反
应。我们的结果表明，分化培养基 R3 上添加了
4 mg·L-1 AgNO3，1 周内愈伤组织的体积明显增
大，10~14 d 时，大部分愈伤组织表面有绿点区
域出现，并逐渐形成幼芽，每颗愈伤分化小苗的
数量比添加铜元素还多，植株再生率稍高于分化
培养基 R 4 ，但是幼叶生长不健壮，略呈畸形。
因此出现这种现象时，我们认为应尽快将小苗移
到生根培养基上，以利其正常生长 (图 1-d)。
细胞分裂素可以促进叶绿素合成和叶绿体的
形成[8]。分化培养基 R5 中含有 ZT，植株再生率
略低于分化培养基 R3 和 R4，但加 ZT 后，再生
苗颜色较深绿，幼苗较粗壮。再生植株生长健
壮，节间缩短，叶片增宽，叶色深绿(图 1-f)。
总之，9 种分化培养基中,R3、R4 和 R5 对 5
个品种成熟胚诱导愈伤组织再生苗分化率明显高于
其他的分化培养基。因此，我们选择 R4 为愈伤
组织分化培养基，建立了农杆菌介导的遗传转化
的高效再生体系(图1-e)。
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