全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 3期，2007年 6月 465
黑松不定芽的增殖
郑丹，朱丽华，叶建仁 *
南京林业大学森林资源与环境学院，南京 210037
提要：以无菌条件下萌发 22 d的黑松幼苗子叶 /胚轴材料为起始外植体，在GD+3 mg·L-1 6-BA+0.3 mg·L-1 NAA培养基中
诱导黑松不定芽的形成，其诱导率为96%。进一步探讨生长调节物质水平、基本培养基种类和继代周期对黑松不定芽增
殖影响的结果表明：6-BA浓度为 2 mg·L-1、NAA浓度为 0.2 mg·L-1时的增殖率最高，达 100%，增殖倍数也最高，为 4.88;
在 5种基本培养基(GD、DCR、WPM、1/2MS和 1/2GD)中，GD培养基比较适合不定芽的增殖，可以形成健壮有效的不
定芽；此种条件下培养30 d的黑松不定芽增殖率可达4.6倍。
关键词：黑松；组织培养；不定芽；增殖
Axillary Buds Proliferation for Pinus thunbergii (Parl.)
ZHENG Dan, ZHU Li-Hua, YE Jian-Ren*
College of Forest Resources and Environment, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China
Abstract: Axillary buds proliferation for Pinus thunbergii was described in this paper. Cotyledon/hypocotyl
explants obtained from 22 d old aseptically grown seedlings of Pinus thunbergii were used to establish initial
cultures. The explants were cultured on a GD medium containing 3 mg·L-1 6-BA (6-benzylaminopurine) and
0.3 mg·L-1 NAA (α-naphthylacetic acid) to obtain axillary bud and the induction rate could reach 96%. The
influences of plant growth regulators, basal medium, subcultures interval on proliferation of axillary buds were
experimented. It was showed that the highest induction rate of axillary buds was approximate 100% on GD
medium supplemented with 2 mg·L-1 6-BA and 0.2 mg·L-1 NAA, the highest proliferation multiple was 4.88.
Among the 5 kinds of basal media tested (GD, DCR, WPM, 1/2MS and 1/2GD), GD medium was the best to
the proliferation and growth of axillary buds. It was indicated that the best subculture interval was 30 days,
which was good not only for keeping the explants in a tender state but also for speeding up the growth of the
induced axillary buds.
Key words: Pinus thunbergii; tissue culture; axillary buds; proliferation
收稿 2007-04-09 修定 　2007-04-26
资助 国家林业局“9 4 8”项目( 2 0 0 3 -4 -3 8 )。
* 通讯作者( E-m a i l：j r y e @n j fu . e du . cn；T el：0 2 5 -
8 5 4 2 2 0 9 4 )。
黑松原产日本和朝鲜，树形美观，耐干旱瘠
薄，抗海风海雾能力强，是优良的庭院绿化观赏
树种及海岸和荒山荒滩造林的先锋树种。由于高
度感染由松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)引起
的一种毁灭性萎蔫病，原产地日本和我国引种的
黑松受害十分严重，近乎灭绝，对林业生产、森
林资源和生态环境造成严重的破坏(柴希民和蒋平
2003)。开展黑松离体组织培养技术研究，可能
是快速大量繁殖优良抗病黑松的最佳途径，在短
周期内可实现生产增益，同时也可为采用生物技
术对树种进行遗传改良打基础。对此，Kondo和
Okamura (1995)以黑松成熟胚、梁玉堂和邢世岩
(1990)以针叶束、朱丽华(2004)以无菌实生苗等为
外植体建立了黑松器官发生的组织培养再生体系。
器官发生途径虽然比较容易建立起植株再生体系，
但也有人认为存在植株增殖率低的问题(Thorpe等
1991)。而且随着生长时间的延长，不定芽出现
生长势衰弱、老化和死亡等现象，致使很多研究
仅停留在实验室阶段。因此，要使黑松离体培养
技术应用于大规模林业生产，系统研究不定芽的
增殖非常重要。
材料与方法
黑松(Pinus thunbergii Par1.)种子产自山东，
为自由授粉的成熟种子。用前作 4℃低温处理，
参照何月秋(2003)文中的方法培养无菌苗。将萌
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发生长 22 d的无菌苗从子叶着生部位下 1 cm处的
根切去，子叶连同 1 cm长的胚轴用作外植体(子
叶 /胚轴外植体)。参照朱丽华(2004)文中方法，
将诱导培养基稍加改进，接种外植体到附加 3
mg·L-1 6-BA+0.3 mg·L-1 NAA的改良GD培养基上，
５周后计算诱导率和平均芽数。
试验按两因素完全随机设计，将伸长至 2 cm
左右的单个芽切下，接种至添加 6-BA浓度为0.5、
1.0和 2.0 mg·L-1，NAA浓度为 0.1、0.2和 0.4 mg·L-1
的GD培养基上进行增殖培养，从中筛选出比较
适合的生长调节物质浓度，在此基础上进行不定
芽增殖的基本培养基和继代周期的筛选。
以上培养基均添加 25 mg·L-1蔗糖、500 mg·L-1
水解酪蛋白(CH)、450 mg·L-1谷氨酰胺(Gln)和 6
g·L-1卡拉胶，pH 5.8，121℃灭菌 16 min。培养
温度为(24±1)℃，光照强度 40 µmol·m-2·s-1，光照
16 h·d-1。每个试验重复3~5次，每重复包含10~30
个外植体，数据采用 SPSS软件进行分析。按增
殖率(%)=分化芽数(个)/接种芽数(个)×100%、增
殖倍数 =有效芽数(个)/接种芽数(个)进行计算。
实验结果
1 初代黑松不定芽的诱导
黑松子叶/胚轴外植体接种到附加不同浓度6-
BA与NAA的改良GD培养基上 10 d后，可见到
大部分黑松顶芽稍稍膨大。随着培养时间的延
长，子叶间及子叶基部见到有绿色小凸起。20 d
后，子叶基部长出 2 ~5 mm大小的小芽。以 3
mg·L-1 6-BA+0.3 mg·L-1NAA为宜，诱导率可达
96% (图 1-a)。
图 1 黑松不定芽增殖过程
Fig.1 Various stages of axillary bud proliferation in P. thunbergii
a：初代芽的形成；b：第 2 代芽的诱导；c：第 3 代芽的诱导。
2 黑松不定芽的增殖
在以往的报道中多数能够顺利建立黑松组织
培养的再生体系，获得其再生植株，但有关中间
繁殖体如何大量快速增殖的研究较少，本文探讨
不同生长调节物质浓度配比及基本培养基等因子对
黑松不定芽增殖的影响，并己诱导出生长正常的
第 2、3 代芽(图 1 - b、c )。从表 1 ~ 3 可见：
(1)将伸长的单个不定芽切下，接种在添加不
同浓度 6-BA和NAA的培养基上进行增殖的结果
(表 1)表明，在无生长调节物质培养基中不定芽仅
进行伸长生长，一直没有不定芽分化；在含 6-BA
和NAA的培养基中，1周后可见到不定芽基部膨
大，外植体切口处出现少量洁白的愈伤组织，２
周后就有腋芽萌动，切口处愈伤组织为黄绿色且
表 1 6-BA和NAA对黑松不定芽增殖的影响
Table 1 Effects of 6-BA and NAA on bud proliferation of
P. thunbergii
6-BA NAA 每外植体的芽 生长状态
/mg·L-1 /mg·L-1 数 /个
0 0 0a 老化，愈伤组织褐色紧实
0.5 0.1 0.3±0.2a 愈伤组织紧实
0.5 0.2 0.6±0.1a 保持幼嫩状态，愈伤组织湿润浅绿
0.5 0.4 0.3±0.1a 保持幼嫩状态，愈伤组织疏松膨大
1.0 0.1 2.2±1.0b 保持幼嫩状态，愈伤组织湿润浅绿
1.0 0.2 2.3±1.6b 保持幼嫩状态，愈伤组织湿润浅绿
1.0 0.4 0.6±0.2a 保持幼嫩状态，愈伤组织疏松膨大
2.0 0.1 4.5±0.8c 保持幼嫩状态，芽分化多
2.0 0.2 4.8±0.4c 保持幼嫩状态，愈伤组织湿润浅绿
2.0 0.4 3.7±2.2bc 保持幼嫩状态，愈伤组织疏松膨大
　　同一列数字旁字母不同表示差异显著(P<0 .05 )。
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疏松，3~4周后在附加 0.5~1.0 mg·L-1 6-BA的培
养基中少数外植体子叶基部有芽出现，附加 2.0
mg·L-1 6-BA的培养基中大多数外植体基部出现不
定芽。细胞分裂素6-BA对不定芽增殖的作用非常
关键，6-BA浓度低至 0.5 mg·L-1时，增殖倍数均
在 0.6以下；随着 6-BA浓度的增加，增殖倍数
明显增加，其浓度为 2.0 mg·L-1的培养基中增殖倍
数最高；6-BA浓度高于 2.0 mg·L-1时，其生长状
态逐渐变差，针叶肿大发硬、有玻璃化的趋势，
抑制了增殖甚至引起死亡(资料未列出) ；NAA浓
度在 0.1、0.2和 0.4 mg·L-1 3个水平内变化时对
不定芽增殖影响不大，但超过 0.2 mg·L-1时，外
植体基部产生直径约 1.5 cm的大量愈伤组织团，
不利于不定芽生长。在GD+2.0 mg·L-1 6-BA+0.1~
0.2 mg·L-1 NAA为黑松不定芽增殖培养基上，能
获得生长迅速、健壮、幼嫩的有效不定芽，增
殖率高达 100%，增殖倍数达 4倍之多，说明细
胞分裂素和生长素两者之间的适合比值对黑松不定
芽的增殖起关键作用。类似的结果在其他松属树
种的不定芽增殖培养中亦有报道(董丽芬和彭丽萍
2004；何月秋等 2005)。
(2)不同植物的不同生长阶段对营养物质的需
求不一样，因此，选择合适的基本培养基对植物
增殖至关重要，将不定芽分别接种在 5种含 2.0
mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 NAA的基本培养基上，调
查其增殖的情况的结果(表 2)表明，不同种类的培
养基都可不同程度地诱导不定芽分化，但不同基
本培养基的增殖效果不一样。综合考虑，无机盐
含量中等的GD培养基(Gresshoff和Doy 1972)的
增殖效果最好，增殖倍数可达 4.5，且不定芽生
长健壮，针叶嫩绿，有效芽多，这一点与初期
诱导培养条件一致(朱丽华等 2006) ；含有低浓度
钾和高浓度钙的DCR培养基(Gupta和Durzan 1985)
的增殖效果次之，增殖倍数为 3.7，不定芽生长
较快，但较细小；在W P M 培养基上，增殖倍
数不高。在改良 1/2GD培养基(Sommer等 1975)
上，苗老化、发黄。同样，在含有高浓度的NH4+
和NO3-的1/2 MS培养基(Murashige和Skoog 1962)
上，苗生长势最差，有的表现出干枯症状，有
的己经枯死，增殖倍数仅为 1.96。
(3)经过上述对培养基及激素的比较与筛选，
得到较适宜的黑松组培苗增殖条件是：GD+2.0
mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 NAA。将单芽重复接入该
培养基后，每隔 5 d进行 1次继代，1个月之内，
统计不同继代周期对不定芽增殖影响。结果(表 3)
显示，接种 0~10ｄ，不定芽增殖比较缓慢，增
表 2 不同基本培养基对黑松不定芽增殖的影响
Table 2 Effects of different basal media on bud proliferation in P. thunbergii
培养基 接种数 /个 分化数 /个 增殖率 /% 增殖倍数 外植体生长情况
GD 6 5 6 5 100 4.50 正常，芽点大，愈伤组织湿润浅绿
DCR 6 5 6 1 93.8 3.70 正常，芽点小，愈伤组织湿润浅绿
W P M 6 0 4 7 78.3 2.47 发黄，芽点干枯，愈伤组织褐色紧实
1/2GD 4 8 3 5 72.9 2.27 发黄，芽点中等，愈伤组织褐色紧实
1/2MS 5 5 3 8 69.0 1.96 老化，芽点小，愈伤组织褐色紧实
表 3 不同继代周期对黑松不定芽增殖的影响
Table 3 Effects of different subculture interval on bud proliferation in P. thunbergii
继代周期 /d 接种数 /个 分化数 /个 增殖率 / % 增殖倍数 外植体生长情况
5 3 8 1 0 26.3 1.50 老化，不定芽 0.5~1 cm
1 0 4 0 1 3 32.5 1.96 老化，不定芽 0.5~1 cm
1 5 3 8 1 6 42.1 2.47 保持幼嫩状态，不定芽 0.5~ 1 cm
2 0 3 6 2 7 75.0 3.65 保持幼嫩状态，不定芽 l~1 .5 cm
2 5 4 0 3 5 87.5 4.50 保持幼嫩状态，不定芽 l~1 .5 cm
3 0 4 5 4 5 100 4.60 保持幼嫩状态，不定芽 1.5~2.0 cm
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殖倍数很低；第 10~20天，芽增殖加速，第 20
天时，每个芽的平均增殖倍数增加到了 3.65，且
有 25%的芽能够长高至0.5 cm以上；第20~30天，
增殖的速度减缓，但成苗的数量增加，芽不仅增
殖生长快，而且较为健壮，80% 的芽生长到 1~
1.5 cm以上。在 30ｄ后，外植体会老化，芽生
长势逐渐减弱，基部褐化严重，部分不定芽玻璃
化，这可能是由于在培养过程中，芽吸收生长调
节物质过多，植物细胞生长异常，以及芽基形成
的愈伤组织褐化，影响其生长之故，不同继代周
期对单芽的增殖倍数和生长状态有很大的影响。
讨　　论
本文以黑松带胚轴的子叶为外植体，研究了
不定芽增殖所需的基本培养条件。结果表明，适
宜的激素浓度配比6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1
处理和GD基本培养基及继代培养30 d是培养成功
的关键。
黑松的组织培养从19世纪80年代开始就己经
有不少科学家开始研究了，而增殖培养的相关研
究报道几乎没有。目前，其增殖率低、易玻璃
化、易老化、生长速度慢及培养周期长等问题仍
然是组织培养技术用于黑松工厂生产育苗的瓶颈。
本文以提高黑松不定芽的增殖率以及成苗率为目
的，研究了黑松组培苗增殖的基本条件，更深入
的研究可以从蔗糖浓度、抗氧化剂的添加、光照
及温湿度等方面继续优化黑松增殖培养条件，使
组织培养技术能早日应用于黑松品种改良研究或新
品种的快速繁育。
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