全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第6期，2006年12月 1153
大豆和苜蓿种子中葫芦巴碱含量的测定
孙广玉* 李威 姜丽娜 王洋
东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040
Determination of Trigonelline Content in Seeds of Glycine max (L.) Merr and
Medicago sativa L.
SUN Guang-Yu*, LI Wei, JIANG Li-Na, WANG Yang
College of Life Sciences, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China
提要 用高效液相色谱法测定大豆和苜蓿种子内葫芦巴碱的含量的结果表明：以氨基键合柱为固定相，乙腈和水为流动
相，可快速而比较准确的测定种子中葫芦巴碱含量。大豆和苜蓿种子中葫芦巴碱的含量高于葫芦巴植物的，可作为提取
葫芦巴碱的原料。
关键词 大豆；苜蓿；葫芦巴碱；高效液相色谱
收稿 2006-06-27 修定　 2006-10-26
资助　 黑龙江省重点项目(GA03B006)。
*E-mail: sungy@vip.sina.com, Tel: 0451-82191507
葫芦巴碱(trigonelline, TRG)是从豆科植物蝶形
花亚科葫芦巴属葫芦巴(Trigonella foenum-graecum
L.)的干燥种子中分离的一种生物碱(Khanna和Jain
1972)，因而定名葫芦巴碱，是葫芦巴干燥种子
中的主要生物碱之一。TRG 主要用于治疗糖尿病
(Zia等 2001；Mishkinsky等 1967)、肿瘤(Sur等
2001；朱宝立等 2000)和肝损伤(刘春安和彭明
1994)等。过去，人们一直从葫芦巴的种子中分
离 T R G，认为 TR G 是葫芦巴特有的生物碱。近
年来，我们从常规栽培的豆科作物中大豆[Glycine
max (L.) Merr] 和苜蓿(Medicago sativa L.)种子中也
得到较高的 TRG，并建立了 TRG 的高效液相色谱
分析方法，此法比分光光度计法和极谱法(沙世炎
等 1984)简便和灵敏，精确度也高。
材料与方法
1 仪器
高效液相色谱采用美国 Waters 公司生产的
Waters600、二极管矩阵检测仪、Waters717自动
进样器、十万分之一天平和超声波清洗器。
2 试剂
胡芦巴碱对照品由中国药品生物制品检定所
提供(纯度为99.9 %)。甲醇和乙腈为色谱纯(迪
马公司) ，其它试剂均为分析纯，水为去离子
水。
3 色谱条件
色谱柱为 Waters 氨基键和色谱柱(416 mm
×250 mm, 5 mm) ；流动相采用乙腈和水(80:20，
V/V) ；流速为0.8 mL·min-1；检测波长为265 nm。
柱温：室温。
4 植物材料
苜蓿(Medicago sativa L.) 2个品种：‘凯撒’
和‘越冬之星’，由黑龙江省农垦科学院作物所
提供。大豆[Glycine max (L.) Merr] 2个品种：‘黑
农 38 号’和‘绥农 14 号’，由黑龙江省农业科
学院大豆所提供。种子放入粉碎机内粉碎，过45
目筛，于 6 0℃下干燥后，置于干燥器内备用。
5 样品制备
分别称取 0.25 g 苜蓿和大豆种子的样品粉
末，放入离心管中，加入 5 mL 甲醇溶液浸泡过
夜，用超声波仪(120 W)超声 1 h，以 2 700×g 离
心 3 min。取上清液放入 5 mL 容量瓶中。剩余
的残渣加入甲醇溶液，超声震荡，再将上清液移
入离心管，以 2 700×g 离心10 min，反复 3次，
最后定溶至5 mL。取 1 mL 样品用 0.45 mm 滤膜
过滤后，放入进样瓶中，得到样品溶液。
实验结果
1 标准曲线绘制
称取 5 mg 胡芦巴碱对照品置于 10 mL 量瓶
植物生理学通讯 第42卷 第6期，2006年12月1154
中，用甲醇溶解并定容，作为对照品储备液。分
别吸取 0.1、0.2、0.4、1.2、1.6 和 2 mL 储备
液放于 10 mL 量瓶中，甲醇稀释并定容，摇匀，
制成不同浓度的对照品溶液，分别吸取1 mL对照
品溶液，以微孔滤膜过滤后，放入自动进样器
中，取 10 mL 自动进样测定。其中，葫芦巴碱
的保留时间为25 min左右。以对照品浓度为横坐
标(X)，对照品峰面积为纵坐标(Y)，运用SPSS统
计软件进行回归分析，绘制工作曲线：Y=15805.62X+
5944.21，相关系数r=0.999，表明线性较好。相
同的实验重复6次，变异系数为0.415%，重现性
较 好 。
2 稳定性实验
苜蓿种子待测液放置于温室条件下，分 0、
1、3、6、9、1 2 、1 5 、2 4 、3 2 、4 8 和 9 6
h测定峰面积，平均峰面积为1.9×106，变异系数
为0.638%。待测液内葫芦巴碱在1 d (24 h)之内
和4 d (96 h)之内基本稳定。
3 回收率实验
称取0.25 g 已知葫芦巴碱含量的苜蓿样品，
置于 10 mL 量瓶中，分别加入 0.2、0.2、0.2、
0.5、0.5、0.5、1.0、1.0、1.0 mL 葫芦巴碱对
照品储备液(617.1 mg·g-1)，待甲醇挥干后，按制
备样品液，10 mL 自动进样测定。样品的平均回
收率为 98.24%，变异系数为 0.371%。已知葫芦
巴碱含量的大豆样品也按同样方法操作，平均回
收率为 98.76%，变异系数为 0.449%。
4 标准样品和待测样品的液相色谱图
样品提取葫芦巴碱后，分别制成 3 份待测溶
液，每一份进样 10 mL，按上述色谱条件测定，
取峰面积平均值，用外标法计算胡芦巴碱的含
量，色谱图见图 1 。
表1 不同作物种子中葫芦巴碱含量
作物 品种 葫芦巴碱含量/ 葫芦巴碱平均含
mg·g-1 (DW) 量/mg.g-1 (DW)
葫芦巴 3.434
大豆 ‘黑农 3 8 号’ 4.905±0.046 4.775
‘绥农 1 4 号’ 4.645±0.028
苜蓿 ‘ 凯 撒 ’ 119.100±0.794 122.578
‘越冬之星’ 126.055±0.535
图1 标准和测定的样品中葫芦巴碱色谱图
5 样品测定
分别测定苜蓿和大豆种子中葫芦巴碱含量的
结果(表1)表明，苜蓿种子的葫芦巴碱含量明显高
于大豆种子，二者差异达极显著水平(p<0.01)。
大豆和苜蓿的2个品种之间的葫芦巴碱含量相近。
显示用高效液相色谱法测定植物种子中葫芦巴碱
含量基本上是可行的。
植物生理学通讯 第42卷 第6期，2006年12月 1155
讨　　论
测定中草药中的葫芦巴碱含量一般多采用分
光光度法和极谱法，这 2 种方法测定的时间较
长，样品的制备和提取比较繁琐，操作复杂。而
高效液相色谱法相对比较简单方便。本文的结果表
明，流动相配比会影响葫芦巴碱的保留时间和分离
效果，多次实验说明以80:20 (V/V)的乙腈和水配比
分离葫芦巴碱的效果最好，基线平稳。另外，流
动相的流速不宜过大，以控制在0.8 mL·min-1为宜，
否则会造成色谱柱柱压增大，减缓色谱柱寿命。
通常情况下，医用葫芦巴碱主要从葫芦巴植
物的种子中提取，其在葫芦巴种子中的含量一般
为1.319~3.434 mg·g-1 (DW) (赵怀清等2002)，比
大豆种子中的含量低一些；而在苜蓿种子中含量
更大。葫芦巴碱是咖啡中的主要挥发性芳香物
质，是咖啡中的提神物质(Ky 等 2001)，市场上
的速溶咖啡中葫芦巴碱含量为8.435 mg·g-1 (DW)
(Trugo 等 1983)，比大豆种子的高，但比苜蓿种
子的低，苜蓿种子的含量为速溶咖啡的14.53倍。
另外，葫芦巴植物的种植技术比农作物难，种子
产量较低，而咖啡树则不适宜在我国北方地区种
植。因此，无论是从种植地区( 特别是我国北
方)，还是取材来说，我们认为从一般栽培的豆
科作物苜蓿和大豆种子中提取葫芦巴碱可能是比较
好的途径，尤其是苜蓿种子似可作为提取葫芦巴
碱的主要原料来考虑，值得一试。另外，大豆
和苜蓿中葫芦巴碱的医用效应与葫芦巴的是否一
样，也应深入探讨。
参考文献
刘春安, 彭明(1994). 抗癌中草药大辞典. 武汉: 湖北科学技术出
版社, 692
沙世炎, 严敏如, 曾纪琰(1984). 中草药有效成分分析法(下册).
北京: 人民卫生出版社, 219~220
赵怀清, 曲燕, 王学娅, 张雪航, 张洪建, 服部征雄(2002). 不同产
地葫芦巴种子中葫芦巴碱的含量测定. 中国药学杂志, 37 (8):
617~619
朱宝立, 班永宏, 段金廒(2000). 葫芦巴对急性化学性肝损伤的
保护作用. 中国工业医学杂志, 13 (1): 19~21
Khanna P, Jain SC (1972). Effect of nicotinic acid on growth and
production of trigonelline by Trigonella foenum-graecum
L. tissue cultures. Indian J Exp Biol, 10: 248~249
Ky CL, Guyot B, Louarn J, Hamon S, Noirot M (2001). Trigonelline
inheritance in the interspecific Coffea pseudozanguebariae×
C. liberica var dewevrei cross. Theor Appl Genet, 102:
630~634
Mishkinsky J, Joseph B, Sulman FG (1967). Hypoglycaemic ef-
fect of trigonelline. Lancet, 2 (7529): 1311~1312
Sur P, Das M, Gomes A, Vedasiromoni JR, Sahu NP, Banerjee S,
Sharma RM, Ganguly DK (2001). Trigonella foenum-graecum
(fenugreek) seed extract as an antineoplastic agent. Phytother
Res, 15 (3): 257~259
Trugo LC, Macrae R, Dick J (1983). Determination of purine
alkaloids and trigonelline in the instant coffee and other
beverage using high performance liquid chromatography. J
Sci Food Agric, 34 (3): 300~306
Zia T, Hasnain SN, Hasan SK (2001). Evaluation of the oral
hypoglycaemic effect of Trigonella foenum-graecum L.
(methi) in normal mice. J Ethnopharmacol, 75: 191~195