全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第4期，2006年8月790
果实保鲜的基因工程
张竞秋 武泰存 王景安*
天津师范大学化学与生命科学学院，天津300074
Gene Engineering of Fruits Fresh Keeping
ZHANG Jing-Qiu, WU Tai-Cun, WANG Jing-An*
College of Chemistry and Life Science, Tianjin Normal University, Tianjin 300074, China
提要 介绍了近几年来采用转基因或反义 RNA 技术，将果实成熟过程中的相关基因转化到植物体内以延长果实保鲜期的
研究进展。
关键词 果实；乙烯；基因工程
收稿 2006-01-10 修定 　2006-05-15
资助 天津市应用基础研究重点项目(033803711)。
* 通讯作者(E-mail: jinganwang899@126.com, Tel: 022-
23537629)。
呼吸跃变型的果实，如番茄、香蕉、苹果、
蜜瓜等在储存和运输过程中，由于成熟过程进展
迅速和难以控制，常常因为过熟而腐烂变质，引
起巨大的经济损失。本文就近几年来采用转基因
或反义 RNA 技术，将乙烯生物合成与分解过程中
所需酶的基因和细胞壁水解酶基因转化到植物体
内，以延长果实成熟和保鲜期的研究进行介绍。
1 乙烯对果实成熟的作用
乙烯(ethylene, ETH)是一种不饱和碳氢化合
物，其结构式为 CH2 ＝ CH 2，具有显著的催熟作
用，发动呼吸跃变和促进成熟，被认为是成熟激
素。乙烯合成的增加是果实成熟启动最好的分子
标记。因此，内源乙烯的显著变化是跃变型果实
成熟的重要调节步骤。1979 年 Adams 和 Yang 发
现1-氨基丙烷-1-羧酸(1-amino-cyclopropane-1-
carboxylate, ACC)是乙烯生物合成的直接前体，并
确定了植物体内乙烯合成的生物途径(图 1)。
图1 乙烯的生物合成途径
2 与果实成熟相关的调控基因
ACC合成酶(1-amino-cyclopropane-1-carboxy-
late synthase, ACS)、ACC氧化酶(1-amino-cyclo-
propane-1-carboxylate oxidase, ACO)和ACC脱氨酶
(1-amino-cyclopropane-1-carboxylate deaminase,
ACCD)均与乙烯合成直接有关。ACS 是乙烯形成
的关键酶，由多基因家族编码，各个基因协同表
达，每个基因都有自己的转录特性，近年来不断
揭示出果实中 ACS 基因家族中的新成员；ACO 是
一种与膜结合的酶，此酶具有结构上的立体专一
性，其内部存在正反馈调控，A C O 和 A C S 基因
协同表达影响乙烯的形成，进而控制着果实的成
熟过程。ACCD 可将 ACC 降解为丁酮酸和氨，从
而降低植物体内乙烯的合成量。
果实成熟过程中，多聚半乳糖醛酸酶
(polygalacturonases, PG)参与果胶的分解，可将细
胞壁中的多聚半乳糖苷降解，从而在果实软化中
起作用。果胶甲酯酶(pectin methylesteras, PE)可
将细胞壁中的果胶去甲基，使细胞壁软化，并减
少果实中的可溶性固形物的含量。纤维素酶
(cellulase, EG)活性与果实早期成熟软化的启动有
关。
植物生理学通讯 第42卷 第4期，2006年8月 791
3 果实保鲜中的基因工程
3.1 抑制乙烯合成与乙烯合成相关的酶基因
3.1.1 ACC合成酶基因 Oeller等(1991)将ACS的
基因 LE-ACC2 反向插入载体并转化番茄后，乙烯
合成降低 99.5%，果实无呼吸高峰出现，控制果
实成熟已获得成功，并已投入商业化生产。这种
转基因果实在空气中放置不能正常成熟，不出现
呼吸跃变，番茄红素合成和叶绿素降解受阻，果
实不能正常变红和变软，只有通过外源乙烯处
理，反义抑制才会改变，果实也才可正常变红变
软，成熟后的质地、颜色、气味和耐压性与天
然番茄没有明显差异。既延长了果实的保鲜期，
又不改变其自然品质。因此，用反义 R N A 技术
控制 ACS 基因表达，从而抑制乙烯合成是一条确
实可行而且能快速地培育耐贮藏果实的有效途径。
国内先后也有人用反义基因技术进行这方面
的工作。汤福强和刘愚(1994)用 ACS 基因和反义
基因转化番茄得到转基因植株，含 ACS 基因的转
化植株叶片乙烯释放比未经转化的植株增加
3 7 % ~ 3 0 0 %，植株生长异常，离体叶片衰老加
速。含 ACS 反义基因的植株也正常开花，但其离
体叶片乙烯释放量只有未经转化植株的 0~18%，
衰老也缓慢得多。
罗云波和申琳(1995)用 ACS 反义基因转入番
茄，也获得转基因植株。马庆虎和宋艳茹(1997)
把从番茄果实中分离得到的 ACS 的 cDNA 反向插
入和在 CaMV 35S 启动子的控制下，转入烟草，
这种异源反义基因能在烟草中表达，并抑制烟草
内源乙烯的合成。王春霞和简志英(1997)将番茄
的 ACS 基因正义和反义转入西瓜，正义转基因植
株的乙烯释放比未转基因的增加 80% 左右，两个
反义转基因植株的乙烯释放分别为未经转基因的
67% 和 78%。李天然和马庆虎(1999)将番茄 ACS
反义基因转入河套蜜瓜，也获得转基因植株。
刘传银(1998)克隆了 ACS 的 cDNA，并用反
义 RNA 技术在番茄中表达，从而抑制果实成熟。
受克隆的ACS基因插入1个二元载体pbin437中，
反向插入到带有增强子的CaMV35S启动子和3端
转录终止序列之间，构成一个表达载体 pBACC，
转化番茄子叶，得到了转基因番茄。转基因番茄
果实的乙烯释放量比非转基因番茄果实明显减少
30%。ACS 反义 RNA 抑制果实成熟的作用在转基
因植株及其后代T1 中检测到，在室温条件下转基
因番茄果实的保鲜期最少为60 d，硬度和色泽并
没有大的改变。用乙烯处理转基因果实15~20 d后
大部分果实成熟。分析 T 1 代的结果表明，反义
ACS 基因在转基因番茄后代中单基因稳定遗传。
转基因纯合体特异反义ACS 的 RNA 在 T2 代仍有延
长番茄保鲜期的作用。
Wang和 Peng (2001)克隆到香蕉果实ACS 基
因的启动子，并研究其启动子功能的结果表明，
2.5 kb的启动子连到带有GUS的cDNA序列上，用
微弹轰击法分别转入到香蕉叶、根和果实细胞
中，结果获得的启动子片断能引导果实特异基因
的表达。
魏绍冲等(2003)研究番茄中乙烯受体基因
LeETR1 和 LeETR4 的克隆和表达，结果显示，两
受体基因的表达在番茄果实成熟过程中变化不明
显，LeETR4在同一时期的果实外果皮中表达水平
低于其在辐射壁和中柱的表达。转反义 ACS 番茄
果实中LeETR1 和 LeETR4 的表达水平明显低于野
生型番茄果实，外源乙烯处理转反义 ACS 番茄果
实，可促进两个受体基因的表达。
3.1.2 ACC氧化酶基因 ACC氧化酶是乙烯生物合
成途径中最后一个酶，催化 ACC 向乙烯转化，为
乙烯生物合成途径的一种限速酶。
Yub和 Guis (1996)用 ACO的反义RNA技术转
化甜瓜后，转基因果实中的乙烯含量小于未转化
植株的 1 % ，甜瓜的成熟过程受抑。
Blume和Grierson (1997)将ACO的启动子连接
到番茄和白花丹醌烟草中，该启动子的表达受发
育和环境刺激的调节。在番茄中 ACO 由一个小的
多基因家族编码，包含 3 个成员，即 LEA C O 1、
LEACO2 和 LEACO3。ACO 基因表达后乙烯量显
著增加，并引起病源微生物的侵染。组织分析衰
老的叶片和成熟果实果皮中 G U S 活性的结果表
明：在叶片中，开始衰老叶片当中 G U S 活性是
嫩叶中的 3 0 0 倍，其活性随叶片的发育程度递
增；在果实的果皮中，IM (immature green)时期
只能检测到很低的GUS活性，MG (mature green)
时期 GUS 活性开始增加，当果实颜色开始改变 3
d 后，GU S 活性达到峰值，此时活性为 IM 时期
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果实的 50~60 倍，随后 GUS 活性开始下降。比
较表明，衰老叶片中的 GUS 活性值高于成熟果实
果皮中 G U S 活性的峰值。
叶志彪等(1996)将 ACO 基因的 cDNA 反义转
入番茄，所获得的转基因植株在常温条件下可贮
藏88 d，显著长于亲本。他们用番茄转基因系与
常规品种杂交选育出了耐贮藏的番茄新品种‘华
番一号’，这是我国第 1 个商品化生产的农业基
因工程产品。
饶景萍等(2002)在柿果实中用兼并引物扩增出
两个 ACO 的 cDNA 片段：其中 DK-ACO1 由 834
个碱基组成，编码 259 个氨基酸；DK-ACO2 为
836 个碱基，编码 260 个氨基酸。它们均具有其
它植物 ACO 中存在的保守区，且在多肽水平上的
同源性很高，DK-ACO1 与番茄 LE-ACO1 的同源
性是 86.2%，与 DK-ACO2 的同源性是 82.5%；
DK-ACO1 与甜瓜 CM-ACO1 的同源性是 82.6%，与
DK-ACO2 为 81.1%。据了解，有关柿的两个 ACO
基因与其果实成熟衰老的关系，以及在成熟软化
过程中表达调控的特异性的研究尚在进行中。
3.1.3 ACC脱氨酶基因 ACC脱氨酶基因可将ACC
降解为丁酮酸和氨，从而降低植物体内乙烯的合
成。苏少泉(1992)报道了丁酮酸是乙酰乳酸合成
酶的底物，在体内可转化为缬氨酸、亮氨酸和异
亮氨酸，氨可为植物体再利用。因此可以认为，
转化 ACCD 基因后不会对果实性状产生不利的影
响。Klee和Hayford (1991)从土壤细菌假单孢杆菌
中克隆到 ACCD 基因(其表达产物能够分解 ACC)，
并转化番茄得到转基因植株，成熟过程中有
90%~97% 的乙烯产量受抑制。将转基因番茄放在
室温下贮藏，其果实软化过程明显减慢，4 个月
仍不变软，除果实成熟特性以外的其它表型均和
未经转化番茄的一样。未经转化的番茄果实只能
存放 2 周。
宋俊岐等(1998)应用PCR技术克隆了ACCD基
因，并于 1998 年通过农杆菌介导的方法将 ACCD
基因导入番茄，获得保鲜期延长的番茄果实。其
再生植株经 Southern 杂交检测证明，ACCD 基因
已整合到番茄基因组中并稳定遗传表达。其乙烯
合成降低80% 左右，果实在离体条件下可保鲜75
d 左右。
张智俊(2002)将 ACCD 基因转入哈密瓜中，
也获得转化植株，其果实的储藏期和供应期均延
长。
杨甲定和钟海文(2002)用农杆菌转化白兰瓜子
叶，获得转 ACCD 基因的白兰瓜植株 3 株，在组
织培养过程中，没有观察到白兰瓜转基因再生植
株与未转基因植株在形态学上的差异。他们进一
步比较 3 株转基因白兰瓜植株中的酶活性，从植
株 A 中检测的 ACC 脱氨酶的活性最低，而植株 B
和 D 中则比较高。说明虽同为转基因植株，但外
源 ACC 脱氨酶基因的表达水平却有明显差异。
3.2 抑制细胞壁的降解与细胞壁降解有关的酶
3.2.1 多聚半乳糖醛酸酶(PG) 在果实成熟过程中，
果实软化和细胞壁降解密切相关。PG是细胞壁降
解主要酶类，可将细胞壁中的多聚半乳糖苷降
解，引起果实软化。
骆蒙等(1996)研究河套蜜瓜中PG活性的结果
表明，PG 活性增加与果实软化呈平行相关，而
与内源乙烯变化趋势一致；以乙烯利处理后的该
酶活性与乙烯生成量呈正相关。
Kalaitzis等(1997)从番茄衰老的叶和花的PG
中获得 3 个 cDNA：TAPG1、TAPG2 和 TAPG4，
三者的同源性达 76%~93%。未见到它们在果实、
茎、叶柄和花药中表达。T A P G 4 比另外两者转
录得早。
马庆虎等(1999)从肥城桃成熟果实的PG基因
中克隆到的cDNA长 1 188 bp，包括一个由393个
氨基酸组成的开放阅读框架。R T - P C R 分析表
明，肥城桃叶片中检测不到 PG 编码的 mRNA，但
在果实中其表达量却非常丰富，认为肥城桃PG基
因的 cDNA 在果实中是特异表达的。这表明通过
反义 RNA 转基因技术改善肥城桃的采后品质是有
前景的。
据李曜东等(2002)报道，不同成熟期和存放
前后的转反义PG基因番茄果实，其果皮外面几层
细胞厚度比未转基因的厚 1~5 mm，细胞结构、
细胞质和细胞核的状态都有明显区别，尤以贮藏
后更为明显，未转基因果实的果皮结构解体、细
胞质凝聚、细胞核变模糊程度都比转基因的严
重。用外源乙烯处理后，转基因和未转基因果实
的细胞结构呈相似的变化。这些结果显示，反义
植物生理学通讯 第42卷 第4期，2006年8月 793
PG 基因的转入可降低 PG 活性和减弱外源乙烯的
作用，从而延缓果实的衰老和提高耐贮性能，起
到果实保鲜的效果。
Jiménez-Bermúdez等(2002)用反义果胶酸盐裂
解酶基因调控草莓果实变软。草莓采后的保鲜期
之所以短，主要是由于短期内坚固结构的丧失。
为了调控草莓变软，他们用 35S 启动子调控，获
得了带有草莓果胶酸盐裂解酶基因反义序列的转基
因草莓。获得的41个独立的转基因系放在温室中
繁殖并进行农艺性状分析的结果表明，与非转基
因的草莓相比，转基因系发生了改变，大多数转
基因系的果实坚硬。有 6 个转基因系的成熟果实
中果胶酸盐裂解酶活性比非转基因的低 30%，其
中有3个转基因系的果胶酸盐裂解酶基因完全受到
抑制。这说明用果胶酸盐裂解酶基因延缓果实变
软也是一个值得考虑的途径。
3.2.2 果胶甲酯酶(PE) PE可将细胞壁中的果胶去
甲基，使细胞壁软化，并减少果实中的可溶性固
形物含量。在许多植物器官和组织中，包括成熟
的果实中都可检测到 PE 活性。PE 的生理意义是
为PG作用准备底物，对果胶物质的降解起辅助作
用。
Tucker和Zhang (1996)已克隆到PE基因cDNA
并构建了 35S 启动子控制下的反义基因。此种反
义基因在转基因番茄中表达后果实中的PE活性大
大降低，但对叶片或根部的 PE 活性没有抑制作
用。转基因果实中 PE 活性为非转基因的 10% 以
下，检测不到 PE 蛋白和 PE mRNA。低 PE 活性
的果实与非转基因的果实相比，其果胶分子量较
大，甲酯化过程和番茄红素堆积不受影响。这些
结果表明PE在果实细胞壁代谢中可延缓果实的衰
老，因而果实得到保鲜贮藏。
3.2.3 纤维素酶(EG) 薛炳烨和束怀瑞(2002)认为
EG活性与果实早期成熟软化的启动有关。编码番
茄 EG 的 2 个 cDNA 已得到鉴定，一个与未成熟果
实中丰富的 mRNA 相关，但在成熟果实中则检测
不到，在完全成熟时又急剧积累；另一个 E G
cD N A 与只在完全成熟时表达的 mRN A 相关，说
明番茄在果实发育过程中EG的表达不同，生理功
能也不同。
Tucker等(1988)从2.0 kb的EG mRNA得到了
部分 cDNA 克隆，之后得到了 1.7 kb 的 cDNA 全
序列，包括含有编码信号肽的1 485 bp的开放阅
读框，它的碱基序列和氨基酸序列与成熟鸭梨EG
的同源性分别为64% 和 50%。Bonghi 等(1998)用
桃叶片的 RNA 克隆到 753 bp 的 EG cDNA，研究
认为EG参与果实早期生长和起始软化，这两个阶
段的EG由不同的基因编码，且激素对它们的调节
也不相同。目前尚未见到用EG基因转化作物获得
转基因植物的报道。
起始于上世纪 70 年代的 EG 基因克隆的研究
主要集中在酸性纤维素酶方面，发展非常迅速。
到 2 0 0 3 年胡利勇和钟卫鸿已从里氏木霉
(Trichoderma reesei)克隆到ebhⅠ、ebhⅡ、ebhⅢ、
ebh Ⅳ、eg Ⅰ、eg Ⅲ和 bg 7 个 EG 基因，都在
大肠杆菌中都可以表达，这些基因的核苷酸序列
也已检测。但是EG在大肠杆菌中的分泌表达水平
很低，而且提取有很大困难，所以人们将目光转
向了真核表达系统。
4 结语
综上所述，应用转基因技术和反义 RNA 技术
延长果实保鲜期已取得了显著的成效，显示出非
常诱人的应用前景。但是目的基因的选择至关重
要，也应开展研究，另外，以下几方面也值得
探讨：
(1)应选择果实成熟过程中起最关键作用的基
因作为目的基因进行转基因研究，这样才能有效
延长果实保鲜期。如呼吸跃变型果实对乙烯敏
感，所以控制乙烯合成有可能有效控制果实的成
熟和软化。但对非跃变型果实来说，控制乙烯合
成对延缓果实成熟和软化的效果并不明显。
(2)由于与果实成熟相关的基因大多属于多基
因家族，它们受不同的因子调控，用其中成熟软
化型成员的反义基因转化可能会更有效，而用其
它成员，可能不一定有效。
(3)反义基因可能只作用于相应植物的目的基
因，所以不同种类的果实需用不同的反义基因来
达到保鲜的目的，而 ACC 脱氨酶基因没有种属特
异性的限制，它可在不同的植物体内起作用。因
此，要想有目的地控制果实成熟软化和保鲜，必
需弄清楚与果实成熟软化有关的每个基因的具体功
能和它的时空表达模式及其调控因子，对这类问
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题应该从基础工作着手，开展研究。
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