全 文 ：植　　　物　　　研　　　究
BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH
第 18 卷　第 1 期 1998 年　1月
Vol.18　No.1 Jan., 　1998
桔青霉诱导子对红豆杉培养
细胞中紫杉醇生物合成的影响
李家儒1　刘曼西2　曹孟德3　王君健2
(1.中国科学院水生生物研究所 ,武汉　430072)
(2.华中理工大学生物工程系 ,武汉 430074)　(3.河南医科大学基础部 , 郑州　450052)
摘　要　在红豆杉培养红胞中 ,桔青霉诱导子促进紫杉醇的合成 。将培养 6—7d 的
桔青霉菌丝体的粗提物 ,以 50μg 碳水化合物/ml培养液的浓度加入到处于指数生
长期末期的红豆杉培养细胞中 ,诱导子促进紫杉醇合成的作用最大 。高压灭菌处理
20—90min ,不影响诱导子的活性 。
关键词　桔青霉;诱导子;紫杉醇;细胞培养;红豆杉
EFFECTS OF PENICILLU M CITRINU M ELICITOR
ON THE BIOSYNTHESISOF TAXOL IN SUSPENSION
CELL CULTURES OF TAXUS CHINENSIS
Li Jia-ru1　Liu M an-xi2　Cao Meng-de3　Wang Jun-jian2
(1.Institute of Hydrobiolog y , The Chinese Academy of Science ,Wuhan 430072)
(2.Bioengineering Depar tment ,Huazhong University of Science & Technology ,Wuhan 430074)
(3.Department of Basic Science Henan Medical University , Zhengzhou 450052)
Abstact　The Penici llum citrinum elicitor w as ext rax ted af ter autoclaveing a 6 ～ 7-
day old culture of P.ci trinum which could promote taxol biosynthsis in suspension cell
cultures of Taxus chinensis.The optimum elicito r cocentration w as found to be 50μg
carbohydrate/ml medium of T .chinensis cell cultures.T .chinensis cells showed
strongest response to the elicitor during the grow th phase(20d).The t ime of autoclav-
ing(20 ～ 90min)did not af fect the elicitor s act ivity.
Ket Words　Penici llum citrinum ;Elicitor;Taxol;Cell culture;Taxus chinensis
收稿日期:1997-3-10
抗癌新药紫杉醇(taxol)是一种二萜类化合物 。1971年Wani et al首次报道从短叶红豆
杉(Taxus brevi folia Nutt)树皮中分离到紫杉醇〔19〕 。1979年 Horwitz et al阐明了紫杉醇的
独特作用机理 ,即在肿瘤细胞分裂时 ,紫杉醇能促进微管蛋白的聚合 ,又能稳定微管不致解
聚 ,使细胞分裂阻断 ,从而抑制肿瘤的生长〔18〕。紫杉醇在体外人瘤株筛选和实验动物中对
多种肿瘤均有效 ,属于广谱的抗肿瘤植物药。1989年紫杉醇被公认为具有重大突破的新一
代肿瘤化疗药物 ,目前已成为卵巢癌 、乳腺癌的一线药物 ,90年代开始应用于肺癌的临床试
验。迄今为止 ,紫杉醇主要从天然红豆杉树皮中提取 ,含量甚微。红豆杉生长缓慢 ,天然资
源破坏严重 ,有限的自然资源难以满足日益增长的临床试验与医疗用药的需要 。许多国家
的学者纷纷开展紫杉醇的化学全合成〔13 ,15 , 17〕 ,化学半合成〔12 , 14〕 ,及红豆杉细胞培养等方面
的研究 ,以开发紫杉醇新药源 。红豆杉细胞培养生产紫杉醇有可能成为解决紫杉醇药源危
机的一条重要途径 ,近年来已取得了很大进展〔1 ,4 ,5 ,6 ,16〕。
植物次生产物的合成具有全能性和多条代谢途径〔8〕 。因而通过培养条件的调控 ,可以
定向诱导目的产物的合成 。真菌诱导子是来源于真菌的一种确定的化学信号 ,在植物与真
菌的相互作用中 ,能快速 、高度专一和选择性地诱导植物特定基因的表达 ,进而活化特定次
生代谢途径 ,积累特定的目的次生产物〔2〕。真菌诱导子的应用 ,为植物次生代谢调控提供了
新的有效手段。利用诱导子提高植物培养细胞中目的产物含量的研究 ,近十几年一直是国
内外研究的热点〔2 ,3〕 。Christen A.A.et al研究表明在短叶红豆杉培养细胞中加入一些诱导
子可以提高细胞中紫杉醇的含量 ,同时可以诱导紫杉醇分泌到培养基中去〔10〕 ,国内尚未见
到有关利用诱导子调控红豆杉培养细胞次生代谢的报道。
我们从多种微生物中筛选出桔青霉(Penici llium citrinum Thom),其菌丝体的粗提物具
有诱导物活性 ,可提高红豆杉悬浮培养细胞中紫杉醇的含量。本文报告桔青霉诱导子促进
紫杉醇合成的活性 ,及影响这种活性因素的初步结果。
1.材料与方法
1.1　红豆杉细胞悬浮培养
供试材料为红豆杉(Taxus chinensis(Pilger)Rehd)细胞克隆系 TC158。培养基为:MS
+NAA0.5mg/L+BA0.5mg/L +CH2g/L +蔗糖 25g/ L ,pH5.5 ～ 5.8。每 250m l三角瓶中
装入 100ml培养基 ,接种约 10g新鲜愈伤组织于普通摇床上 110r/min ,25±1℃,暗培养 , 35d
后测定紫杉醇含量。
1.2　桔青霉培养
所用菌种桔青霉(Penici llium ci trinum Thom)由华中农业大学生命科学与技术学院赫
勃先生提供 。桔青霉成熟孢子接入查氏培养基中于普通摇床上 110r/min ,25±1℃,暗培养
6—7d ,待菌丝充分生长后收获 ,减压抽滤。
1.3　桔青霉诱导子粗提物的制备及其总糖含量的测定
菌丝抽滤后用 10倍滤液匀浆 ,匀浆液经 121℃高压灭菌 20min ,抽滤 ,滤液即为桔青霉
诱导子的粗提物 ,粗提物鉴定为糖类 ,采用硫酸一苯酚法〔7〕测定其总糖含量 ,以蔗糖为标准
品 ,诱导物中总糖含量为 2500μg/ml。
1.4　细胞内可溶性蛋白质含量测定
按考马斯亮蓝 G-250法〔9〕 ,以小牛血清蛋白为标准品。
791 期　　　　　　李家儒等:桔青霉诱导子对红豆杉培养细胞中紫杉醇生物合成的影响
1.5　细胞生长测定
细胞悬浮培养物抽滤 ,40℃烘至恒重 ,换算成相应于接种量为 10g 的细胞干重 ,以此作
为细胞生长指标 。
图 1　标准品之高压液相色谱图(9.63min)
Fig.1　HPLC of S tandard Sample(9.63min)
1.6　Taxol含量测定
样品制备:精确称取粉碎的干细胞培养物用适
量的甲醇浸泡 96小时 ,经 0.2μm 滤膜过滤 ,滤液
供HPLC分析。标准品:紫杉醇标准品得自美国国
家癌症研究所(NCI),用甲醇制成 5μg/ml标准溶
液 ,备用 。仪器:Waters510 型高效液相色谱仪 ,配
置Waters486型可变波长紫外检测器 ,Waters746
型色谱数据处理机 。色谱条件:使用 Novapak C-
18(3.9×150mm)柱 ,流动相甲醇:水(75:25),流速
0.5ml/min , 柱温 25℃, 进样量 3μl , 检测波长
227nm ,标准品分离情况如图 1。样品测定:各样品在上述色谱条件下测定计算出紫杉醇的
含量 。
2.结果与分析
2.1　桔青霉诱导子用量对紫杉醇合成的影响
在红豆杉细胞悬浮培养 20d 时加入不同用量的桔青霉诱导子 ,培养至 35d时测定细胞
中紫杉含量 ,结果见表 1。
表 1 不同诱导子用量对 taxol合成的影响
Table 1　Effect of the amount of the elicitor on taxol biosynthesis in suspension cell cul-
ture of T.chinensis
诱导子用量(m l)
amount of the elici tor
0 1 2 3 4
taxol含量(μg/ g.DW)
conten t of taxol
0 75.00 211.41 83.26 75.02
细胞生长量(g.DW/ L)
cell grow th
7.60 7.35 7.25 7.05 7.3
由表 1知 ,诱导子用量不同 ,诱导效果不同。在 100m l红豆杉细胞培养物中加入诱导子
的最适浓度为 2ml诱导子/100ml培养液 ,相当于 50μg 碳水化合物/ml培养液 ,此时 ,红豆杉
细胞中 taxol含量为 211.41μg/g .DW ,每 100ml细胞培养物中加入的诱导子用量多于或少
于 2ml ,均不能最大限度地促进 taxol的合成。对照处理中 taxol含量为零 ,说明诱导子作用
于红豆杉培养细胞后活化了 taxol合成途径。而不加诱导子时 ,红豆杉培养细胞中 taxol合
成途径没有开启 。不同用量的诱导子对红豆杉培养细胞的生长均有一定的抑制作用 。
2.2　高压灭菌锅 121℃处理时间对诱导子活性的影响
将桔青霉菌丝体匀浆液分别用高压灭菌锅 121℃处理 20min 、60min 、90min ,在红豆杉细
胞悬浮培养20d时加入2m l诱导子/100m l细胞培养物 ,培养至 35d时检查诱导子活性 ,结果
见表 2。
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表 2 高压灭菌 121℃处理时间对诱导子活性的影响
Table 2　　Effect of Duration of autoclaving for the elicitor on the el iciter s activity
处理时间(min)
t ime of treatment
总糖含量(mg/m l)
t otal sugar content
细胞生长量(g.DW/ L)
cell grow th
taxol含量(μg/ g.DW)
content of taxol
Cont rol - 7.60 0
20 2.50 7.25 211.41
60 2.49 7.21 205.32
90 2.50 7.28 215.28
图 2　红豆杉悬浮培养细胞生长曲线
Fig.2　Cell G row th Curve of T .chinensis in Sus-
pensuior Culture
　　由表 2知 ,高压灭菌锅 121℃处理不同时间
对桔青霉诱导子活性影响不大 ,诱导子中总糖
含量基本相同 ,说明该诱导子热稳定性好 ,能快
速溶于热水 ,菌丝体匀浆液经常规高压灭菌处
理即可。
2.3　红豆杉培养细胞生长状态对桔青霉诱导
子活性的影响
红豆杉生长曲线如图 2所示。
由图 2 可知 ,红豆杉细胞悬浮培养 0—8d
为延滞期 , 8—20d 为指数生长期 , 稳定期为
20—32d。分别于细胞悬浮培养的第 5d 、20d 、
25d时加入 2ml诱导子 ,35d时检测 taxol含量 。结果表明 ,在 20d时加入诱导子效果最好 ,
taxol含量为 199.lμg/gDW , 5d 、25d 时加入诱导子 , taxol含量分别为 6.95μg/g.DW 和 9.
85μg/g.DW ,均不及 20d时加入诱导子效果好。这说明 ,在指数生长期末红豆杉培养细胞对
诱导处理具有最强的反应能力 。
2.4　桔青霉诱导子对红豆杉细胞内可溶性蛋白质含量的影响
在红豆杉细胞培养 20d时加入 2ml诱导子 ,处理 5d 、10d时分别取样测定细胞中可溶性
蛋白质含量 ,结果如表 3。
表 3　诱导子对红豆杉细胞中可溶性蛋白质含量的影响
Table 3　Effect of the elicitor on the soluble protein con-
tent in suspension cell cultures of T.chinensis
处理时间(d)
t ime of treatment
蛋白质含量(mg/ gfw)
Soluble protein content
诱导处理　　　对照
elicited　　　cont rol
5
10
1.55　　　1.25
4.7　　　1.40
加入诱导子处理 5d后 ,细胞内可溶性蛋白质含量为
1.55mg/g.fw ,对照为 1.25mg/g.fw , 10d 后 ,诱导处理
的细胞可溶性蛋白质含量为相应对照的 3 倍多 ,诱导处
理大大促进了细胞内可溶性蛋白质含量的增加。
3.讨　　论
在植物培养细胞中加入诱导
子是提高目的次生产物含量的有
效手段之一 。在诱导处理中 ,诱
导子活性与其浓度有关 。诱导子
浓度效应有两种类型:一类是反
应饱和型 ,即次生产物的合成随
诱导子浓度增加而增加 ,达到等
最大值后保持稳定。另一类是最
适浓度型 ,即诱导反应要求最适
浓度 ,在此浓度诱导子表现出最
强的活性〔11〕 。本实验诱导子的
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反应属后一种类型 ,于 100m l培养液中加入 2m l即相当于 5000μg 碳水化合物的诱导子 ,效
果最佳 ,诱导子过量或不足 ,均不利于 taxol合成。
在植物培养细胞中 ,不少植物细胞是在指数生长期以后 ,才逐渐由初级代谢进入次级
谢。细胞感受外界刺激 、调节内部代谢的能力与细胞所处的生长阶段有关 。本实验表明 ,红
豆杉细胞培养 20d ,即指数生长期末期 ,接受诱导子的信号能力最强 ,此时诱导子促进 taxol
合成能力最强。
一般认为细胞内可溶性蛋白质是一些调节细胞内代谢的酶类 ,桔青霉诱导子促进细胞
内 taxol与可溶性蛋白质含量的增加 ,而未经诱导子处理的红豆杉细胞培养物中紫杉醇含量
为0 ,说明诱导子处理可能促进了 tax ol合成相关酶的合成。如何提高红豆杉培养细胞中
taxol合成的关键酶的表达 ,这是实现生物合成途径生产 taxol的一个关键而又复杂的问题 ,
有待于进一步深入研究。
参　　考　　文　　献
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