全 文 ：植 物 研 究
BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH
第 19 卷 第 3 期 1999 年 7 月
Vol.19 No.3 July , 1999
光棘豆悬浮细胞原生质体培养影响因素的研究
张根发1 周延清2 张飞雄3 李效宇2
(1.北京师范大学生物系 ,北京 100875) (2.河南师范大学生物系 ,新乡 453002)
(3.首都师范大学生物系 , 北京 100037)
摘 要 采用光棘豆无菌苗胚轴诱导的分化能力强的愈伤组织建立的胚性细胞悬
浮系材料 ,对悬浮细胞原生质体解离所需酶液 、原生质体培养所需要的渗透压和激
素组合进行了研究。发现较低的培养基渗透压(<0.35mol/L 葡萄糖)和较高浓度
的 2 ,4-D(>1mg/L)易于诱导细胞出芽分裂 ,导致细胞破碎和死亡 ,并引起培养细
胞褐化。找出了适合光棘豆悬浮细胞原生质体培养的培养基渗透压和激素组合 。
关键词 光棘豆;原生质体;激素;渗透压;悬浮细胞
FACTORS AFFECTING PLANT REGENERATION FROM
PROTOPLASTS DERIVED FROM CELL-SUSPENSION
CULTURESOF OXYTROPIS LEPTOPHYLLA
Zhang Gen-fa1 Zhou Yan-qing2 Zhang Fei-xiong3 Li Xiao-yu2
(1.Department of Bio logy , Beijing Normal University , Beijing 100875)
(2.Department of Bio logy , Henan No rmal University , Xinxiang 453002)
(3.Department of Bio logy , Capital Normal University , Beijing 100037)
Abstract Cell-suspension cultures derived f rom the calli initiated f rom plumalar axis
of Oxytropis leptophyl la were used fo r studying the effects of different enzymes , phy-
tohormones and osmotic pressure in medium (e.g.the content of glucose)on proto-
plast isolat ion and culture.The results showed that the protoplasts w ere easy to dam-
age into small segments w hen osmotic pressure w as out of balance for protoplats pro-
toplasm.It w as also found that the low osmot ic pressure acted similarly to 2 , 4-D at
high concentration in inducing the cell budding division , which resulted in death of
cells.The optimum osmotic pressure and phytohormones combinat ion was determined.
Key words Oxy tropis leptophyl la;Protoplast;Phytohormone;Osmotic pressure;
收稿日期:1998-10-8
Cell-suspension
植物原生质体高频再生植株是进行遗传操作和细胞工程手段改造植物的基础 ,也是研
究基因表达与体外细胞分化的优良实验体系 ,因此受到国内外学者的广泛重视 。光棘豆是
多年生野生豆科植物 ,可饲用 ,也是常见的中草药。在以前的研究工作中 ,我们摸索出了其
离体培养高频再生植株的方法〔1〕 ,找到了适合其悬浮培养的培养基〔2〕 ,并获得了光棘豆悬
浮细胞原生质体的再生植株〔3〕 。利用遗传操作〔4〕和体细胞无性系变异〔5〕是驯化改良野生
牧草的有效途径 ,为提高光棘豆原生质体培养再生植株频率使其更好的运用于实际 ,本文对
影响光棘豆悬浮细胞原生质体培养的因素进行了研究 ,现将结果报告如下 。
1.材料与方法
以光棘豆无菌苗胚轴诱导的胚性愈伤组织建立的胚性细胞悬浮系为材料 ,选择生长旺
盛 、分散好 、具有较强分化能力的悬浮系解离原生质体 。取换液后 1 ～ 7天不同时间的分裂
旺盛的小细胞团 ,用不同的酶液解离原生质体 ,方法同前〔3〕 。按常规方法收集漂洗后 ,用
CK8p培养基〔3〕进行液体浅层静止培养。
在选用含大量胚性细胞团悬浮系材料的基础上 ,利用六种不同的酶液组合(表 1),研究
了解离原生质体所需的酶类组合及其适合浓度。方法是取换液后 3天的悬浮培养液 10ml ,
沉淀 10min收集小细胞团和游离细胞;分别取 1ml培养细胞 ,按 1∶8加入不同的酶液组合后
于 6cm 平皿中 ,置 40 ～ 60rpm 摇床 ,27℃黑暗中酶解 。每隔 1小时观察一次 ,原生质体出现
后 ,以观察时原生质体平均密度较前一小时不再增加为最适解离时间 。记录最适解离时间
时观察的酶—原生质体混合液中原生质体占原生质体 、细胞团和单细胞含量的百分比来确
定解离的优劣。
分别用含不同浓度葡萄糖(渗透压)的 CK8p 培养基(表 2)将解离的原生质体调整为密
度为 1×105/ml的悬液 ,取 1ml接种在 3.3cm×1cm平皿中 ,进行液体浅层培养。在培养的
1 ～ 2天检查原生质体细胞存活率 ,培养 7天细胞分裂高峰时统计分裂频率 。并对再生细胞
的形态 、分裂频率和细胞团的形成等发育过程进行跟踪观察 ,统计分析 ,研究细胞再生过程
与培养基渗透压的关系 ,找出适合原生质体培养的糖浓度。
利用植物组织培养中常用的生长素 2 ,4-D和 NAA ,细胞分裂素 ZT 进行了不同浓度
组合(表 3)对光棘豆悬浮细胞原生质体培养影响的研究。
2.结果与讨论
解离原生质体的研究结果表明 ,要获得高频率 、高活性的原生质体 ,悬浮系本身的状态
和活力是十分重要的 。换液后 1 ～ 7天的悬浮系细胞解离原生质体的结果表明:换液后 3 ～
4天 ,生长迅速的胚性细胞团易于解离 ,获得大量有活力的原生质体;而已经分化的细胞团
(含维管束组织等)和游离的长 、大细胞难以解离 ,获得大量的原生质体。处于分生状态的小
细胞团最适于原生质体的解离 。
六种不同酶液解离原生质体的研究结果表明 ,不同组合的酶液解离原生质体所需时间
不同 ,而最终获得的量也是不同的(表 1)。分析表 1不难发现 ,纤维素酶 Onozuka R-103%
的效果最好 ,但必须是与 Pectolyase Y-230.2%组合才能在最短时间内获得最大量的原生
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质体;其次是Macerozame 0.2%,效果也不错 。不同植物材料解离原生质体所需酶液组成不
尽相同 ,但总的来看果胶酶 Pectoly ase Y-23对于悬浮培养细胞高质量快速获得大量原生
质体是适用的〔6 , 3 , 7〕。
表 1 酶液组成对原生质体解离的影响
Table 1 Effect of different enzyme composition on protoplast isolation
酶液组成
Enzyme com positien
解离时间(小时)
Isolation t ime
(hou rs)
酶—原生质体混合液
Enzyme-protoplast combination
原生质体量%
Percentage of
protoplast
小细胞团单细胞含量%
Percentage of single
ceu in cell mass
Onozuka R-103%, Pect inase(Serva)1%Driselase 0.2% 24 36 64
Onozuka R-102%, Pect inase (Serva)1% Driselase 0.2%,
Macerozame 0.1% 18 48 52
Onozuka R-102%, Pect inase(Serva)1%Hemicellulase 1% >24 28 72
Onozuka R-102%, Pectinase(Serva)2%Macerozame 0.2% 12 54 46
Onozuka R-102%, Pectolyase Y-230.2% 4-6 >95 <5
Onozuka R-103%, Pectolyase Y-230.2% 4 >95 <5
表 2 培养基渗透压对原生质体细胞形态和生长发育的影响＊
Table 2 Effect of different medium osmotic pressures on cell morpha , growth and de-
velopment＊
蔗糖学浓度(渗透压)
Sucrose concent ration
培养二天原生质体
存活量%Percentage
of suroival protoplast s
af ter 2-day culture
under osmot ic pres-
su re
分裂频率%＊＊(出
芽频率%) Division
f requency(%)(Bud-
ding division foequen-
cy (%)
细胞团形态＊＊＊(细胞团含几十个细胞)
Morpha of cell mass＊＊＊
(cell mass con tained tens of cells)
0.35M 62 20(12)
细胞团较大 ,不规则 ,多由长形细胞组成 ,部分
褐化。 big , irregalar , most cells are rectangular ,
part s of w hich are brow ning
0.4M 82 18(6)
细胞团大 , 边缘细胞长形, 中间有圆形细胞。
bigger , marginal calls are rectangular , medial
cells are circular
0.45M 91 24(3)
细胞小 ,球形 ,由小圆形细胞组成 ,细胞内颗粒
结构物丰富。 sm aller , spherical , cells are small
and circular , containing plentiful granules
0.50M 86 18(2)
细胞团较小 ,球形 ,不易区分每个细胞 ,细胞内
颗粒结构物较多。 small , spherical , cell bound-
aries are unclear , cell con tained plentiful gran-
ules.
0.55M 68 4(0)
细胞团很小的球形 ,细胞数目少 ,体积小 ,边缘
褐化。 smallest , spherical , cell mass is made up
of few cells , w hose volumes are small w ith
margine brow ning
＊:培养基均为 CK8P、激素为 2 , 4-D 0.5mg/ L;NAA 1.0mg/ L;ZT 0.5mg/ L Media used are C8P , phytohormones used
are 2.4-D 0.5mg/ L;。 ＊＊:培养 7天的统计数值 Figures are calculated af ter 7-day-culture。 ＊＊＊:培养三周的观察
情况 Situations are observed af ter three-w eek-culture。
3153 期 张根发等:光棘豆悬浮细胞原生质体培养影响因素的研究
培养基的渗透压(葡萄糖的浓度)对原生质体存活和进一步发育的影响研究结果总结于
表 2。结果表明 ,原生质体能存活的渗透压范围较宽 ,特别是具有丰富液泡的较大体积的原
生质体;而通常认为有发育前途的原生质浓 、颗粒内含物丰富 、体积较小的原生质体受渗透
压的影响也较大 。本实验采用后一种原生质体为观察对象 ,当渗透压不适宜条件下(葡萄糖
浓度高于 0.55M 或低于 0.35M),大部分原生质体破碎 ,存活率极低。在原生质体培养 12
～ 24h存活率较高的渗透压范围内:葡萄糖 0.35 ～ 0.55M ,培养基的渗透压仍对原生质体的
再生细胞形态和进一步发育有很大影响 。渗透压低易于诱发出芽分裂 ,如葡萄糖在 0.35 ～
0.4M ;渗透压高则抑制细胞分裂 ,如葡萄糖 0.5 ～ 0.55M 。因此渗透压偏高或偏低 ,都会引
起细胞死亡 ,而死亡细胞过多是诱发培养细胞褐化的因素之一。这说明培养基适宜的渗透
压是原生质体存活和进一步分裂生长的重要条件。原生质体再生细胞发育的跟踪研究表
明 ,较高渗透压易于保持细胞的胚性分裂生长 ,而适时加液降低培养基渗透压对细胞团的增
长和进一步发育都有益的 。
原生质体早期培养时 ,培养基中的激素组成对其细胞壁再生 ,细胞分裂 ,细胞团形成乃
至以后的分化都是十分重要的 ,2 ,4-D是一种主要激素 ,对于细胞早期培养和胚状体形成
都是十分重要的〔8〕 ,而禾本科植物通常需要较高浓度〔9〕。本实验几种不同激素组合对原生
质体再生细胞分裂频率和分裂形式 ,及其细胞形态的影响研究结果(见表 3)表明:2 , 4-D
对原生质体细胞的分裂是重要的。但高浓度的 2 ,4-D有促使细胞持续出芽分裂的作用而
导致原生质体细胞死亡;只有适合的激素组合才能维持细胞正常分裂和生长 ,及其细胞团的
形成 、发育直至植株再生 。
表 3 激素对原生质体细胞形态和分裂频率的影响＊
Table 3 Effect of different phytohormenes on cel l morpha and diaision frequency of
protoplasts＊
激素组合(mg/ L)
Combination of
phytohormenes(mg/ L)
分裂频率(%)
出芽分裂频率(%)
Division frequency(%)
(Budding division f requency(%)
细胞形态
Cell morpha
2 , 4-D 0.5 16(8) 细胞大 , 内含物少 , 长型和不规则细胞较多。
biggest few irregular or rectangular
2 , 4-D 1.0 20(12)
细胞较大 ,内含物很少 ,液泡大 ,细胞形态变化
大;破碎细胞多。 bigger , few sereraltypes, cells
have brg vacuole , many cells are broken.
2 , 4-D 0.2 , NAA 1.0 , ZT 0.5 14(2)
细胞小 ,原生质浓 , 内含物较多;圆形 、椭圆形细
胞较多。 smaller , much , circular or oval , proto-
plasms are dense.
2 , 4-D 0.5 , NAA 1.0 , ZT 0.5 24(3) 椭圆形细胞多 ,个体较小 , 内含物多 ,原生质浓。
small , more , oval , protoplasms are dense
2 , 4-D 1.0 , NAA 1.0 , ZT 0.5 23(9) 细胞稍大 , 有多种细胞形态 , 破碎细胞多。 big ,
several types , manycells are broken
＊培养第七天观察结果 ,培养基为 CK8p ,蔗糖含量为 0.4 Medium is CK8P , sucrose concent ration is 0.45M , figures and si t-
uations are observed after 7-day-culture。
培养基渗透压(蔗糖浓度)与 2 ,4-D对细胞分裂和生长的作用似乎是相拮抗的。在适
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当范围内 ,较低渗透压与高 2 ,4-D类似 ,易于诱导细胞连续出芽分裂导致细胞死亡。较高
蔗糖浓度有利于胚性愈伤组织的发生 ,抑制非胚性愈伤组织生长〔10〕 ,也有研究表明 ,2 ,4-
D对体细胞胚胎发生是必要的〔8〕 ,尽管禾本科和豆科植物所需浓度不同 ,前者高些〔10 , 5〕 ,而
后者较低〔8〕。这样看来适宜的培养基渗透压(糖浓度)和适宜的激素组合是维持原生质体
细胞再生 、胚性分裂和增殖乃至再生植株的重要条件。研究不同培养基渗透压 ,不同激素种
类和不同浓度组合对光棘豆悬浮细胞原生质体培养的影响 ,实验结果表明:光棘豆悬浮细胞
原生质体培养的最适培养基渗透压为 0.45M 葡萄糖 ,最适激素组合为:2 ,4-D 0.5mg/L ,
NAA 1mg/ L , ZT 0.5mg/L。该激素组合对原生质体细胞分裂 ,细胞团形成乃至胚性愈伤
组织的分化和植株再生都是适宜的 。
影响原生质体培养和生长发育的因素是多种多样的 ,也具有其必然的内在机理。这都
有待于地一步深入地研究 。
参 考 文 献
1.安利佳等.植物学报 , 1992 , 34(10):743～ 752
2.张根发等.河南师范大学学报(自然科学版), 1993 , 21(1):47～ 50
3.张根发等.实验生物学报 , 1994 , 27(1):117～ 121
4.Davey , Mr , et al.Z.Planzenphysiol., 1980 , 99:435～ 447
5.Lu , DY , et al., Plant S ci.Let t., 31:87～ 89
6.张根发等.植物学报 , 1993 , 35(6):422～ 428
7.Johnson , LS , et al., Plant Sci.Let t., 1982 , 26:133～ 137
8.谷祝平 ,郑国昌.实验生物学报 , 1988 , 21(2):149～ 154
9.Nadar , HM., et al.Crop Sci., 1987 , 22:1070～ 1074
10.Kishor , PBK , et al.Plat Cell Report , 1986 , 5:391～ 393
3173 期 张根发等:光棘豆悬浮细胞原生质体培养影响因素的研究