全 文 ：植　　　物　　　研　　　究
BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH
第 17 卷　第 1 期 1997 年　1 月
Vol.17　No.1 Jan., 　1997
东北地区三种柴胡种子游离氨基酸的研究
王好友1　苏　萍2　邢　怡1　汤学才3
(1.哈尔滨师范大学生物系 , 哈尔滨 150080)
(2.黑龙江省农业科学院 , 哈尔滨 150086)　(3.黑龙江省中药联营总公司 , 哈尔滨市 150056)
摘　要　东北地区三种柴胡 12个居群做了种子游离氨基酸成分分析 。发现狭叶柴
胡 9个居群中种子游离氨基酸种内存在着变异 ,而且种间游离氨基酸种类变异较
大 ,可以作为种间分类的指标 。
关键词　柴胡;高效液相色谱;游离氨基酸;种间关系
STUDY ON SEED FREE AMINO ACIDOF THREE
SPECIES OF BUPLEURUM L .IN NORTHEAST CHINA
Wang Hao-you1　Shu Ping 2　Xing Yi1　Tang Xue-cai3
(1.Depar tment of Biology , Harbin No rmal University , Harbin 150080)
(2.Cereal Center , Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences , Harbin 150086)
(3.Heilongjiang P rovincial Chinese Medicinal United General CO.Harbin 150056)
Abstract　In this paper it w as analysised that seed free amino acids of 12 populations
of three species of Bupleurum in Northeast China , and found that variat ion among 9
populations of B.scorzonexi fol ium and interspecif ic variation among three species w as
present.
Key words:Bupleurum L.;High performance liquid chromatography;Free amino
acid;Species relationship
北柴胡 B .chinense 和狭叶柴胡 B .scorzoneri fol ium 是我国传统中药 ,镰叶柴胡 B .
falcatum 被日本人视为药用的正品 ,现已引入我国华北地区栽培并返销日本 。在“中国植
物志”及各种地方志中都没有记录镰叶柴胡的分布 。我们通过细胞学研究发现在东北镰叶
柴胡有两种细胞型的分布:2n=20和 2n=26 ,这两种细胞型镰叶柴胡明显不同于其它种类
蔡火石生物科学发展基金资助项目和省教委重点资助项目
柴胡如北柴胡 、狭叶柴胡和大叶柴胡等〔1〕 。据文献报道 ,前人在经典分类 、细胞学 、生药学
和药理作用方面研究较多 ,但利用化学手段尤其是生物化学手段对东北柴胡进行分类却很
少。种子游离氨基酸在生物学上具有重要意义〔2-4〕 ,其分布往往具有间断性〔5 , 6〕 ,这种间断
性分布可以表示物种之间性状差异 ,因此种子游离氨基酸研究对于植物分类具有重要意义。
因此本文以东北地区三种柴胡为材料 ,对柴胡种子游离氨基酸进行分析 ,在小分子水平上探
讨物种之间的异同与变化规律 ,目的在于为这三种药用柴胡的分类提供一项依据。
1.材料和方法
试验材料主要采自东北地区野生居群 ,详见表 1。
表 1 种子游离氨基酸材料来源
Table 1 Origin of Bupleurum species examined for seed free amino acid
学　　名
Taxa
编号
No.
采　　集　　地
Locality
染色体数
Chromsome number
狭叶柴胡
Bupleurum scor-
zonerifolium Willd.
P1 牡丹江北山
Beishan , Mudanjiang city Heilongjiang
P rovince
(2n=12)
P2 P1种子栽培于哈师大植物园
population cultivated from Beishan , Mudan-
jiang city at botanical garden of Harbin Normal
University.
(2n=12)
P3 内蒙古额尔古纳左旗
Ergun Zuoqi , Inner Mongolia (2n=12)
P4 满归
mangui county , Inner Mongolia (2n=12)
P5 海东
Haidong , Hailar city , I nner Mongolia (2n=12)
P6 西林吉
Xilinji , Tahe county , Heilong jiang province (2n=12)
P7 肇东
Zhaodong county , Heilong jiang province (2n=12)
P8 泰康
Taikang county , Heilong jiang province (2n=12)
P9 P7种子栽培于哈师大植物园
population cultivated from Zhaodong county at
botanical garden of Harbin Normal University
(2n=12)
北柴胡
B.chinense DC. P10
辽宁省千山
M ts.Qianshan Liaoning province (2n=24)
镰叶柴胡
B.falcatum L.
P11 肇东五里木Wulimu , Zhaodong county , Hei-
longjiang provice
(2n=26)
P12
P11 种子栽培于哈师大植物园 population
cultivated f rom Wulimu , Zhaodong county at
botanical garden of Harbin No rmal University.
2n=26
1051 期　　　　　　　　　　王好友等:东北地区三种柴胡种子游离氨基酸的研究
　　样品制备
种子游离氨基酸样品制备:0.05g 种子用超纯水浸泡 24h ,吸胀后 ,用研钵于冰浴下研
磨均匀 ,加水定容至 1ml , 5 ,000转/min(1 ,500g)离心 15min ,取上清液用超滤膜在 5 ,000转
/min(1 ,500g)超滤。滤液取 100ul溶液冷冻真空抽干 ,加入10μl再干燥液(乙醇:水:三乙胺
=2∶2∶1)后 ,再次抽干。然后加入 20μl衍生剂(乙醇:三乙胺:水:异硫氰酸苯酯=7∶1∶1∶
1),真空泵抽干 。然后加入 20μl稀释液【710mgNa2HPO4/L 水 ,用 10%H3PO4/乙氰(95∶5)
调至 pH7.4】稀释混均即可上机分析 ,进样量为 8μl。
色谱分析:使用美国Waters公司生产的高效液相色谱仪 。包括 510型泵(两台),WA-
TERS PICO·TAG 生理氨酸分析柱(3.9×300mm),484型可见/紫外检测器 ,810工作站 ,柱
恒温系统 ,水解工作台 ,超纯水制备装置 。方法为 PICO·TAG方法。
流动相A:醋酸钠 、三乙胺 、乙腈 。
流动相 B:乙腈。
用前均用配有 FHUP0.5μm 滤膜抽滤 ,超声波脱气 20s ,分析条件为柱温 46℃,检测波
长 254nm 。
2.结果与讨论
2.1　柴胡野生居群与栽培居群间的游离氨基酸比较(见表 2)。
通过三组野生居群与栽培居群的实验 ,发现在牡丹江野生和栽培居群中不同点是蛋白
氨基酸 SER和非蛋白氨基酸 UNN4在野生居群中没有出现 ,却出现在栽培居群中;相同点
是非蛋白氨基酸中的 UNN1 、AAD 、β -ALA 、1MH 、3MH 、AAB 、UNN3 、ORN ,以及蛋白氨基
酸中的GLY 、THR 、PRO 、TYR 、VAL 、MET 、PHE和 LYS 在野生与栽培居群中均没有出现 ,
而另外的 16种氨基酸均出现在野生与栽培居群中 。肇东野生与栽培居群的不同点是蛋白
氨基酸 MET 和非蛋白氨基酸 CIT 在肇东野生居群中没有出现 ,却出现在栽培居群中 ,而蛋
白氨基酸 CYS 出现在肇东野生居群中 ,在肇东栽培居群中没有出现;相同点是非蛋白氨基
酸中的UNN1 、AAD 、β-ALA 、1MH 、3MH 、AAB 、UNN3 、UNN4 、ORN ,以及蛋白氨基酸中的
SER 、GLY 、THR、PRO 、TYR 、PHE和 LYS 在野生与栽培居群中均没有出现 ,而另外的 15
种氨基酸均出现在野生与栽培居群中。五里木野生与栽培居群的不同点是蛋白氨基酸
CYS和非蛋白氨基酸 HYLYS 、ORN 出现在野生居群中 ,栽培居群中没有出现 ,相同点是非
蛋白氨基酸 UNN1 、UNN3 、UNN4在野生与栽培居群中均没有出现 ,而其余的 27种游离氨
基酸均出现在野生与栽培居群中。从三组野生与栽培居群比较可以看出野生与栽培居群间
主要是 2—3个游离氨基酸的差别 ,这反映了在游离氨基酸这样的小分子水平上 ,大多数游
离氨基酸性状是稳定的 ,只有个别游离氨基酸的出现受环境影响 ,即表现出环境饰变 。
2.2　狭叶柴胡种内居群间种子游离氨基酸组成比较
从表 2中 ,我们可以看出在狭叶柴胡的 9 个居群中 ,种内变异式样并不非常大。有 12
种氨基酸完全出现 ,即为 9个居群所共有(9种非蛋白氨基酸和 3种蛋白氨基酸),它们是
UNN2 ,PSER , ASP , GLU , HYPRO , PEA , TAU , HIS , CARN , BAIB , CYS TA ,HYLYS;CYS
在肇东栽培居群中没有发现;SER只出现在牡丹江北山栽培品种和泰来居群中 , CIT 在海
东 、西林吉和肇东居群中没有发现 ,VAL 在泰康 、肇东和肇东栽培居群中出现 ,MET 只在泰
康和肇东栽培居群中发现 , ILE 和 LEU 在海东和西林吉两个居群中没有发现 ,PHE 只在泰
康居群中发现。另外 11种氨基酸(6种非蛋白氨基酸和 5种蛋白氨基酸)AAD 、GLY 、β -
ALA 、THR 、PRO 、1MH 、3MH 、AAB 、T YR 、ORN 、LYS 在各居群中均没有出现 。但是 ,在海
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东 、西林吉 、泰康三个居群中发现了一个未知氨基酸 UNN1。未知氨基酸 UNN3在海东和
西林吉居群中发现 ,其它居群中没有出现 。未知氨基酸 UNN4只在牡丹江北山栽培于哈师
大植物园的居群中出现 ,其它居群中皆没有发现。
在种内居群水平上 ,有 11种氨基酸表现出间断性分布 ,有 12 种氨基酸始终存在 ,只是
各种氨基酸成分在含量上有差别 ,具有一定的稳定性。可能是对特殊生态环境的适应。
表 2 三种柴胡 12个居群中种子游离氨基酸组成比较
Table 2　Comparision of seed free amino acids among 12 populations of three Bupleu-
rum species
P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12
UNN1 + + +
UNN2 + + + + + + + + + + + +
PSER + + + + + + + + + + + +
ASP + + + + + + + + + + + +
GLU + + + + + + + + + + + +
AAD + + +
HYPRO + + + + + + + + + + + +
PEA + + + + + + + + + + + +
SER + + + + +
GLY + +
β-ALA + +
TAU + + + + + + + + + + + +
HIS + + + + + + + + + + + +
CIT + + + + + + + + +
THR + + +
BAIB + + + + + + + + + + + +
CARN + + + + + + + + + + + +
PRO + +
1MH + +
3MH + +
AAB + + +
TYR + + +
VAL + + + + + +
MET + + + + +
UNN3 + +
CYSTA + + + + + + + + + + + +
CYS + + + + + + + + + +
UNN4 +
ILE + + + + + + + + + +
LEU + + + + + + + + + +
HYLYS + + + + + + + + + +
PHE + + + +
ORN + +
LYS + +
2.3　所测三种柴胡各居群间种子游离氨基酸出现频率
从图 1中 ,我们可以看出各种游离氨基酸在各居群中出现的频率有较大的差异。其中
有8种非蛋白氨基酸 PSER ,HYPRO ,PEA , TA U ,CARN ,BAIB ,CYSTA , UNN2和 3种蛋白
氨基酸ASP ,GLU ,HIS 出现频率为 100%;一种非蛋白氨基酸 HYLYS 出现频率为 92%;三
种蛋白氨基酸 CYS 、ILE , LEU 出现频率为 83%;一种非蛋白蛋氨基酸 CIT 出现频率为
75%;一种蛋白氨基酸 VAL 出现频率为 50%;二种蛋白氨基酸 SER 、MET 出现频率为
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42%;一种蛋白氨基酸 PHE出现频率为 33%;三种非蛋白氨基酸 UNN1 、AAD 、AAB和二种
蛋白氨基酸 THR 、TYR出现频率为 25%;5种非蛋白氨基酸 β-ALA 、1MH 、3MH 、UNN3 、
ORN 和 3种蛋白氨基酸 GLY 、PRO 、LYS出现频率均为 17%;一种非蛋白氨基酸 UNN4出
现频率为 8.3%。
图 1　三种柴胡各居群中种子游离氨基酸出现频率
Fig 1　F requency of seed free amino acids in three Bupleurum species
1.UNN1(未知氨基酸)2.UNN2(未知氨基酸)3.PSER(磷酸丝氨酸)4.ASP(天冬氨酸)5.GLU(谷氨酸)6.
AAD(α-氨基已丁酸)7.HYPRO(羟脯氨酸)8.PEA(磷酸乙醇胺)9.SER(丝氨酸)10.GLY(甘氨酸)11.β-ALA(β
-丙氨酸)12.TAU(牛磺酸)13.HIS(组氨酸)14.C IT(瓜氨酸)15.THR(苏氨酸)16.BAIB(β -氨基异丁酸)17.
CARN(肌肽)18.PRO(脯氨酸)19.1MH(1-甲基组氨酸)20.3MH(3-甲基组氨酸)21.AAB(α-氨基丁酸)22.
TYR(酪氨酸)23.VAL (缬氨酸)24.M ET(蛋氨酸)25.UNN3(未知氨基酸)26.CYSTA(胱硫醚)27.CYS(胱氨酸)
28.UNN4(未知氨基酸)29.ILE(异亮氨酸)30.LEU(亮氨酸)31.HYLYS(羟赖氨酸)32.PHE(苯丙氨酸)33.ORN
(鸟氨酸)34.LYS(赖氨酸)
2.4　三种柴胡种子游离氨基酸聚类分析及种间关系
用于本实验柴胡属的三个种 , 12 个居群 ,共测得氨基酸 34种 ,其中 15 种蛋白氨基酸
(其他 3种蛋白氨基酸ALA 、TRP 、ARG未测得)和 19种非蛋白氨基酸(15种已知氨基酸和
4种未知氨基酸)。通过比较发现 ,所测游离氨基酸在 12 个居群中全部出现的是 PSER 、
ASP 、GLU 、HYPRO 、PEA 、TAU 、HIS 、CARN 、BAIB 、CYSTA。GLY 、β -ALA 、PRO 、1MH 、
3MH 和 LYS只在镰叶柴胡和其栽培居群中发现 ,狭叶柴胡和北柴胡中均未发现 。AAD在
狭叶柴胡中没有发现 ,出现在北柴胡和镰叶柴胡中以及镰叶柴胡栽培品种中。CYS 和
HYLYS 在镰叶柴胡栽培品种中没有出现。ORN 只在北柴胡和镰叶柴胡中出现 ,在狭叶柴
胡和栽培的镰叶柴胡中没有出现。这些结果表明三种柴胡在种子游离氨基酸组成上存在差
异。当我们将所测得的各居群间游离氨基酸进行聚类分析(见图 2)后 ,就可以从树系图中
看出虽然狭叶柴胡种子游离氨基酸有居群间变异 ,但是本文所研究的 9个居群聚合后再与
另外两个物种相聚合;镰叶柴胡野生居群和栽培居群首先聚合在一起 ,然后再与北柴胡聚
合。这反映狭叶柴胡与北柴胡和镰叶柴胡关系较远 ,而北柴胡和镰叶柴胡则关系较近。
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图 2　三种柴胡游离氨基酸聚类分析图
Fig.2　Denarogr am by association coefficients clustered with single
linkage method show ing variation of seed amino acids in
seeds of 12 populations of three Bupleurum species.
2.5　综观全部工作 ,似有如
下意见值得进一步提出:GLY 、β
-ALA 、PRO 、1MH 、3MH 和 YS
为镰叶柴胡所共有 ,虽然与狭叶
柴胡同地分布 ,但仍不失为独立
物种;THR、AAB 、TYR 、ORN 为
北柴胡相对于狭叶柴胡所特有 ,
但与镰叶柴胡所共有 ,正如聚类
分析图所反映 ,北柴胡与镰叶柴
胡亲缘较近。值得特别注意的是
狭叶柴胡的牡丹江北山居群与肇
东居群 ,一经栽培在哈师大植物
园后 ,都较野生居群增加了新的
氨基酸 ,前者为 SER 、UNN4 ,后
者为 CIT 、MET , 特别是 UNN4
为三个种的所有居群中所没有 ,
这一方面说明环境变化对氨基酸
种类可以有明显影响 ,另一方面
也说明东部山区(牡丹江北山)与
西部草原(肇东)不同生态环境下
的同一物种的不同居群对同一栽
培环境有不同的反应;另外 SER、
CIT 、MET 却都为泰康(P8)居群
所共有 ,或许是泰康居群环境与
哈师大植物园环境有某些相似之
处 ,但 SER为北柴胡及镰叶柴胡
所共有 ,这是值得进一步研究的。在镰叶柴胡的五里木野生居群与栽培于哈师大植物园居
群的比较中所反映出来的不是氨基酸的增加 ,而是 CYS 、HYLYS 、ORN三种氨基酸的消失 ,
同是栽培在哈师大植物园 ,狭叶柴胡表现为增加氨基酸 ,而镰叶柴胡表现为减少氨基酸 ,这
从另一个侧面反映二者差别之大 ,把二者区分开来实属必要 。总之 ,这些工作反映出在分子
水平上种群生态遗传学的工作远比形态学的工作丰富 。
参　　考　　文　　献
1.姜传明等.东北柴胡属细胞分类学研究Ⅰ .6种柴胡的核型分析.植物研究 , 1994 , 14(3):267—270
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1091 期　　　　　　　　　　王好友等:东北地区三种柴胡种子游离氨基酸的研究